一種電致化學發光細菌傳感方法及多功能探針的製作方法

2023-09-11 10:59:50 2

專利名稱：一種電致化學發光細菌傳感方法及多功能探針的製作方法
技術領域：
本發明屬於電致化學發光技術領域，特別涉及一種電致化學發光細菌傳感方法及多功能探針。
背景技術：
細菌在自然界中分布極為廣泛，是地球物質循環的重要參與者，與人類的生活息息相關。然而一些致病菌的存在嚴重影響著食品安全、水安全，使人類產生各種疾病，危害人類的健康。比如2011年在歐洲爆發的食物中毒疫情就是由腸致病性大腸桿菌引起的，它能夠使人產生嚴重腹瀉和敗血症，甚至死亡。此外，廣泛存在的銅綠假單胞菌能夠使得醫院中的許多病人傷口感染，造成膿腫、肺部感染、菌血症和敗血症，危害極大。因此，細菌的檢測、鑑別和定量對於疾病的預防與診斷具有非常重要的意義。隨著科技的進步，各種各樣的新技術被用於細菌的檢測，從早期的顯微鏡觀察與計數、酶聯免疫法，到現在的差分脈衝伏安法、質譜、聚合酶鏈反應、表面增強拉曼散射、阻抗、石英晶體微天平、表面等離子體共振等，每種方法都展現出了獨特優勢，不過依然存在缺點，比如多數技術操作過程繁瑣、複雜，使用的儀器、藥品較為昂貴，測過程耗時較長等。因此，急需發展快速、簡便、可靠、廉價、靈敏度高的方法用於細菌的檢測。電致化學發光，簡稱ECL，是一種可靠靈敏的檢測方法，在分析化學中得到越來越多的關注。它是將電化學技術與化學發光檢測相結合，具有靈敏度好、儀器簡單、反應可控性好、檢測限低、發光物質可循環再生等特點，是較好的細菌檢測技術。如果將具有識別與催化功能的糖蛋白酶與具有催化和富集作用的納米粒子相結合，構建多功能探針，將使該檢測方法更加簡便、廉價，靈敏度更高。糖蛋白是由短的寡糖鏈與蛋白質共價相連構成的分子，在生物體中廣泛存在，許多酶、激素、凝集素、抗體等都是糖蛋白，這些糖蛋白在生物體內發揮著重要的作用，參與免疫、物質轉運、分泌、凝血、細胞遷移、細胞歸巢等過程。在糖蛋白中，寡糖鏈由唾液酸、甘露糖、葡糖胺、半乳糖、巖藻糖、半乳糖胺等組成，以氧-糖苷鍵或氮-糖苷鍵的方式與胺基酸相連。這些寡糖鏈攜帶著蛋白質的代謝去向信息，能夠作為識別單元，使糖蛋白與一些其他蛋白相互作用，發揮其生理功能。比如細胞表面唾液酸能夠幫助淋巴細胞正常地歸巢到脾臟，而切除了唾液酸之後，其則歸巢到肝臟。此外，糖蛋白上的寡糖鏈還能起到提高蛋白穩定性，保持蛋白生物活性，並賦予蛋白質特定性質，如抗蛋白酶水解、抗熱失活、抗凍性、潤滑性等。葡萄糖氧化酶是一種糖蛋白，表面含有豐富的糖基，可以與一些凝集素產生特異性結合，同時葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖產生葡萄糖酸和過氧化氫，而過氧化氫可以催化一些化學發光物質的發光，如魯米諾，因此，可以利用葡萄糖氧化酶的識別與催化功能構建生物傳感器。另外，這幾年來，金納米粒子在生物傳感領域得到廣泛的應用。一方面，納米金具有催化活性，能夠促進一些反應的發生；另一方面，其具有較大的比表面積和非常好的生物相容性，可以大大提升酶的負載量且不影響酶的活性。同時，金納米粒子具有優良的電子傳遞性能，能促進體系中酶活性中心與電極表面間的電子傳遞。因此，將具有識別與催化功能的糖蛋白酶與納米金進行結合，對於構建簡便、可靠、廉價、靈敏度高的傳感器具有重要的意義
發明內容

針對現有技術不足，本發明提供了一種電致化學發光細菌傳感方法及多功能探針。本發明構建了一種葡萄糖氧化酶與納米金結合的多功能探針。在金電極表面修飾了能與細菌表面和葡糖糖氧化酶等糖蛋白酶中廣泛存在的甘露糖或葡萄糖進行特異性結合的凝集素——伴刀豆蛋白A凝集素，細菌和探針能夠競爭性地與金電極上的伴刀豆蛋白A凝集素進行結合，最後通過高靈敏的電致化學發光方法進行檢測。—種電致化學發光細菌傳感方法，其具體步驟如下a.探針的製備取3毫升納米金溶液，濃度為I. 87 X 10_9摩爾每升，然後加入O. 05飛毫克葡萄糖氧化酶，室溫下攪拌24小時；然後在10000轉每分鐘的轉速下離心1(Γ20分鐘並用去離子水洗滌，最後用O. Γ6毫升，pH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散，即可得表面修飾葡萄糖氧化酶的金納米粒子探針溶液；b.金電極的處理與組裝金電極用O. 3微米的氧化鋁拋光打磨，並分別在乙醇和水中超聲洗滌；然後在濃度為O. 5摩爾每升的硫酸溶液中,用循環伏安法在-O. 2 I. 65伏電位、O. I伏每秒的掃描速度下掃40圈以活化金電極；然後去離子水洗淨後用氮氣吹乾；用pH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液將伴刀豆蛋白A凝集素配製成濃度為O. 5 2毫克每毫升的溶液；取50 100微升配製好的伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分別加入各5微升濃度為1(Γ20毫摩爾每升的氯化鈣和氯化錳溶液，二者的物質的量比為1:1，將活化處理好後的金電極表面浸泡在伴刀豆蛋白凝集素溶液中，靜置修飾14小時；然後將金電極取出，用PH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後再放入5(Γ100微升濃度為O. 5^2毫克每毫升的牛血清蛋白組分五溶液中封閉，靜置I小時；接著將金電極取出，用PH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的磷酸鹽緩衝液洗滌；取5 10微升的細菌分散液滴加在金電極表面，室溫下浸泡廣2小時；用pH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後，再將金電極浸泡在5(Γ100微升配製好的金納米粒子探針溶液中，在室溫下反應O. 5 2小時；c.電致化學發光檢測用pH為6. (Til. 0，濃度為O. I摩爾每升的磷酸鹽緩衝液緩衝溶液配製含10(Γ500微摩爾每升的魯米諾和O. 05^1摩爾每升的葡萄糖的電解質溶液；往小燒杯中加入2毫升所配置電解質溶液，將組裝好的金電極與鉬對電極和銀-氯化銀參比電極構建成三電極體系，然後用電致化學發光的方法進行檢測；掃描電壓範圍為(Γ0. 6伏，掃速為100毫伏每秒，光電倍增管電壓為600伏；或按照上述用料比例、步驟的製備及檢測方法。所述納米金溶液中納米金粒子的平均粒徑為1(Γ50納米。所述細菌分散液為用pH為7. 2 7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散而成的濃度為4. 17 X IO4 ^4. 17 X IO8個菌落每毫升的大腸桿菌或銅綠假單胞菌溶液。一種多功能探針，其在納米金粒子表面固定多個葡萄糖氧化酶，能夠放大檢測信號。所述納米金粒子的平均粒徑為1(Γ50納米，並具有催化魯米諾發光的能力。所述葡萄糖氧化酶具有識別與催化雙重功能，葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖氧化產生過氧化氫，其表面的糖鏈能夠與伴刀豆蛋白A凝集素特異性識別結合。本發明的有益效果為結果表明，基於伴刀豆蛋白A凝集素的電化學傳感器對銅綠假單胞菌和大腸桿菌的定量測定線性範圍為4. 17 X IO2 4. 17 X IO6個菌落，檢出限為263個菌落。操作過程簡便，靈敏度較好。本發明採用表面修飾有葡萄糖氧化酶的金納米子探針進行檢測，該探針具有多重功能。整個組裝過程簡便，對魯米諾發光的催化作用大，使得檢測的靈敏度較好。


圖I為不同含量的銅綠假單胞菌的電致化學發光信號圖，其中a、b、c、d、e和f曲線分別表示菌落數為0、417、4. 17Χ103、4· 17Χ104、4· 17Χ105和4. 17X IO6時銅綠假單胞菌的電致化學發光信號圖；圖2為圖I所示不同含量的銅綠假單胞菌的電致化學發光響應線性圖；圖3為一種由本發明所製備的多功能探針在電致化學發光傳感器中的應用示意圖。
具體實施例方式本發明提供了一種電致化學發光細菌傳感方法及多功能探針，下面結合附圖和具體實施方式
對本發明做進一步說明。實施例I構建基於多功能探針的用於檢測大腸桿菌ATCC11775的電致化學發光方法a.探針的製備所有用於製備金納米粒子的玻璃儀器先用王水浸泡24小時，然後用去離子水洗淨。往250暈升三口燒瓶中加入92. 5暈升去尚子水和2. 5暈升濃度為4克每暈升的氯金酸，攪拌加熱至冷凝管有液滴均勻地回流至燒瓶。加入5毫升濃度為10毫克每毫升的二水合檸檬酸三鈉，加熱15分鐘後停止，然後攪拌冷卻至室溫，於4攝氏度溫度下保存。每次實驗前取3毫升濃度為I. 87X 10_9摩爾每升的納米金溶液，加入3毫克葡萄糖氧化酶，室溫下攪拌24小時。在10000轉每分鐘的轉速下離心10分鐘，並用去離子水洗滌，再用I. 5毫升的pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散，即可得表面修飾了葡萄糖氧化酶的金納米粒子探針溶液。b.細菌的培養與處理本實驗所採用的大腸桿菌ATCCl 1775由中國國家納米中心提供。細菌接種在裝有肉湯培養液的玻璃試管中，於37攝氏度的搖床中振蕩培養24小時。然後在8000轉每分鐘的轉速下離心3分鐘分離細菌，用pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌，離心洗滌三次後用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散。通過測細菌分散液的紫外可見吸光度值確定細菌溶度，再用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液稀釋至所需的各個濃度的細菌分散液。c.金電極的處理與組裝金電極用粒徑為O. 3微米的氧化鋁拋光打磨，分別在乙醇和水中超聲洗滌；然後在濃度為O. 5摩爾每升的硫酸溶液中，用循環伏安法在-O. 2^1. 65伏的電位、O. I伏每秒的掃描速度下掃40圈以活化金電極；然後去離子水洗淨後用氮氣吹乾。用pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液將2毫克伴刀豆蛋白A凝集素配製成濃度為2毫克每毫升的溶液。取100微升伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分別加入各5微升濃度為1(Γ20毫摩爾每升的氯化鈣和氯化錳溶液，二者的物質的量比為1:1，將活化後的金電極表面浸泡在伴刀豆蛋白A凝集素溶液中，靜置反應14小時。然後將金電極取出，用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後放入100微升2毫克每毫升的牛血清蛋白組分五溶液中封閉，靜置I小時。接著將金電極取出，用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌。取10微升所需濃度的待測大腸桿菌分散液滴加在金電極表面，室溫下浸泡2小時。用pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後，再將金電極浸泡在100微升的所配製的金納米粒子探針溶液中於室溫下反應I小時。最後用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌，以便用於電化學檢測分析。d.電致化學發光檢測用pH為7. 86，濃度為O. I摩爾每毫升的磷酸鹽緩衝液配製含100微摩爾每升的魯米諾和O. I摩爾每升的葡萄糖的電解質溶液。往小燒杯中加入2毫升電解質溶液，將組裝好的金電極與鉬對電極和銀-氯化銀參比電極構建成三電極體系，然後用電致化學發光的方法進行檢測。掃描電壓範圍為(Γ0. 6伏，掃描速度為100毫伏每秒，光電倍增管電壓為600伏。結果表明，基於伴刀豆蛋白A凝集素的電化學傳感器對大腸桿菌ATCC11775的響應線性範圍為4. 17 X IO2 4. 17 X IO6個菌落。實施例2構建基於多功能探針的用於檢測銅綠假單胞菌ATCC27853的電致化學發光方法a.探針的製備所有用於製備金納米粒子的玻璃儀器先用王水浸泡24小時，然後用去離子水洗淨。往250暈升三口燒瓶中加入92. 5暈升去尚子水和2. 5暈升濃度為4克每暈升的氯金酸，攪拌加熱至冷凝管有液滴均勻地回流至燒瓶。加入5毫升濃度為10毫克每毫升的二水合檸檬酸三鈉，加熱15分鐘後停止，然後攪拌冷卻至室溫，於4攝氏度溫度下保存。每次實驗前取3毫升濃度為I. 87X 10_9摩爾每升的納米金溶液，加入3毫克葡萄糖氧化酶，室溫下攪拌24小時。在10000轉每分鐘的轉速下離心10分鐘，並用去離子水洗滌，再用I. 5毫升的pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散，即可得表面修飾了葡萄糖氧化酶的金納米粒子探針溶液。b.細菌的培養與處理本實驗所採用的銅綠假單胞菌ATCC27853由中國國家納米中心提供。細菌接種在裝有肉湯培養液的玻璃試管中，於37攝氏度的搖床中振蕩培養24小時。然後在8000轉每分鐘的轉速下離心3分鐘分離細菌，用pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌，離心洗滌三次後用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散。通過測細菌分散液的紫外可見吸光度值確定細菌溶度，再用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液稀釋至所需的各個濃度的細菌分散液。
c.金電極的處理與組裝金電極用粒徑為O. 3微米的氧化鋁拋光打磨，分別在乙醇和水中超聲洗滌；然後在濃度為O. 5摩爾每升的硫酸溶液中，用循環伏安法在-O. 2^1. 65伏的電位、O. I伏每秒的掃描速度下掃40圈以活化金電極；然後去離子水洗淨後用氮氣吹乾。用pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液將2毫克伴刀豆蛋白A凝集素配製成濃度為2毫克每毫升的溶液。取100微升伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分別加入各5微升濃度為1(Γ20毫摩爾每升的氯化鈣和氯化錳溶液，二者的物質的量比為1:1，將活化後的金電極表面浸泡在伴刀豆蛋白A凝集素溶液中，靜置反應14小時。然後將金電極取出，用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後放入100微升2毫克每毫升的牛血清蛋白組分五溶液中封閉，靜置I小時。接著將金電極取出，用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌。取10微升所需濃度的待測銅綠假單胞菌分散液滴加在金電極表面，室溫下浸泡2小時。用pH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後，再將金電極浸泡在100微升的所配製的金納米粒子探針溶液中於室溫下反應I小時。最後用PH為7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌，以便用於電化學檢測分析。d.電致化學發光檢測用pH為7. 86，濃度為O. I摩爾每毫升的磷酸鹽緩衝液配製含100微摩爾每升的魯米諾和O. I摩爾每升的葡萄糖的電解質溶液。往小燒杯中加入2毫升電解質溶液，將組裝好的金電極與鉬對電極和銀-氯化銀參比電極構建成三電極體系，然後用電致化學發光的方法進行檢測。掃描電壓範圍為(Γ0. 6伏，掃描速度為100毫伏每秒，光電倍增管電壓為600伏。結果表明，基於伴刀豆蛋白A凝集素的電化學傳感器對銅綠假單胞菌ATCC27853的響應線性範圍為4. 17 XlO2I. 17 X IO6個菌落。
權利要求
1.一種電致化學發光細菌傳感方法，其特徵在於，具體步驟如下a.探針的製備取3毫升濃度為I. 87 X 10_9摩爾每升的納米金溶液，然後加入O. 05^5毫克葡萄糖氧化酶，室溫下攪拌24小時；然後在10000轉每分鐘的轉速下離心1(Γ20分鐘並用去離子水洗滌，最後用O. Γ6毫升，pH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散，即可得表面修飾葡萄糖氧化酶的金納米粒子探針溶液；b.金電極的處理與組裝用pH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液將伴刀豆蛋白A凝集素配製成濃度為O. 5^2毫克每毫升的溶液；取5(Γ100微升配製好的伴刀豆蛋白A凝集素溶液，分別加入各5微升濃度為1(Γ20毫摩爾每升的氯化鈣和氯化錳溶液，二者的物質的量比為1:1，將活化處理好後的金電極表面浸泡在伴刀豆蛋白A凝集素溶液中，靜置修飾14小時；然後將金電極取出，用PH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後再放入5(Γ100微升濃度為O. 5^2毫克每毫升的牛血清蛋白組分五溶液中封閉，靜置I小時；接著將金電極取出，用PH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的磷酸鹽緩衝液洗滌；取5 10微升的細菌分散液滴加在金電極表面，室溫下浸泡廣2小時；用pH為7. 2 . 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液洗滌後，再將金電極浸泡在5(Γ100微升配製好的金納米粒子探針溶液中，在室溫下反應O. 5 2小時；c.電致化學發光檢測用pH為6. (Til. 0，濃度為O. I摩爾每升的磷酸鹽緩衝液緩衝溶液配製含10(Γ500微摩爾每升的魯米諾和O. 05 1摩爾每升的葡萄糖的電解質溶液；往小燒杯中加入2毫升所配置電解質溶液，將組裝好的金電極與鉬對電極和銀-氯化銀參比電極構建成三電極體系，然後用電致化學發光的方法進行檢測；掃描電壓範圍為(Γ0. 6伏，掃速為100毫伏每秒，光電倍增管電壓為600伏；或按照上述用料比例、步驟的製備及檢測方法。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述納米金溶液中納米金粒子的平均粒徑為10 50納米。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述細菌分散液為用PH為7.2^7. 4，濃度為O. 01摩爾每升的無菌磷酸鹽緩衝液分散而成的濃度為4. 17X IO4 4. 17X IO8個菌落每毫升的大腸桿菌或銅綠假單胞菌溶液。
4.一種多功能探針,其特徵在於在納米金粒子表面固定多個葡萄糖氧化酶，能夠放大檢測信號。
5.根據權利要求4所述的一種多功能探針，其特徵在於所述納米金粒子的平均粒徑為1(Γ50納米，並具有催化魯米諾發光的能力。
6.根據權利要求4所述的一種多功能探針，其特徵在於所述葡萄糖氧化酶具有識別與催化雙重功能，葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖氧化產生過氧化氫，其表面的糖鏈能夠與伴刀豆蛋白A凝集素特異性識別結合。
全文摘要
本發明屬於電致化學發光技術領域，特別涉及一種電致化學發光細菌傳感方法及多功能探針。本發明在納米金粒子上富集修飾葡萄糖氧化酶，構建一種多功能探針，利用電致化學發光的方法檢測細菌。該探針上的葡萄糖氧化酶具有識別與催化雙重功能，首先，葡萄糖氧化酶是一種糖蛋白，其攜帶的寡糖鏈可以與凝集素特異性識別結合，而且葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖氧化產生過氧化氫，過氧化氫能夠促進魯米諾的電致化學發光；另外，比表面積較大的金納米粒子一方面起到了富集酶的作用，另一方面其自身也能催化魯米諾發光。因此，利用本發明可以構建一種快速、簡便、可靠、廉價且靈敏度高的方法用於細菌的檢測。
文檔編號G01N21/76GK102944549SQ20121048471
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月23日 優先權日2012年11月23日
發明者汪陽忠, 劉洋, 李景虹 申請人:清華大學