快速高通量提取植物基因組dna的方法
2023-06-02 06:51:21
快速高通量提取植物基因組dna的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，該方法是將待提取植物材料分別置於96孔板內，然後在每孔中放入鋼珠並進行液氮速凍，再藉助破碎儀將96孔板內的所述待提取植物材料進行充分研磨，最後通過改良NaOH、CTAB或SDS法從研磨後的粉末中提取DNA，在所述提取DNA的過程中均利用Zephyr?MBW核酸工作站的96通道進行各種試劑的添加。該方法具有高通量、低成本、速度快等優勢，另外，本發明的提取方法簡單、得到的基因組DNA純度高、穩定性好。
【專利說明】快速高通量提取植物基因組DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學的基礎領域，具體涉及一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，該方法快速、高通量、低成本，既可以從植物多個組織中提取基因組DNA，也可以從種子中提取基因組DNA。
【背景技術】
[0002]植物材料的基因組DNA的獲取是進行基因定位研究、分子標記輔助育種、種子純度鑑定和轉基因材料鑑定等相關研究的基礎。植物種子DNA提取和純度鑑定、抗病性檢測是確保種子高質量安全上市的必備步驟和重要保障。目前，最常用的提取植物基因組DNA的方法是利用大量的EP管(1.5-2ml等規格)手工抽提，過程耗時耗力，每天提取的樣品數量非常有限，僅約為200-400個樣品/人；而且存在一系列問題，如重複使用研缽引起的交叉汙染、大量EP管編號困難容易出錯、樣品提取過程人為誤差大、DNA結果檢測差異大、單個樣品提取成本高、不能進行標準化規模化操作等等。這些常規的DNA人工提取方法不能滿足短時間內進行大量植物材料的分子標記篩選和種子純度鑑定的需要。
[0003]隨著植物科研和育種規模的快速發展，植物材料和種子DNA的大規模提取也逐漸成為上述研究的重要限制因素。因此，研究植物材料和種子DNA的高通量、快速、低成本提取技術體系具有重要的意義。目前，各育種公司和科研機構也紛紛展開了此方面的研究。
【發明內容】
[0004]針對現有技術 的缺陷，本發明的目的在於提供一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案:
[0006]一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，將待提取植物材料分別置於96孔板內，然後在每孔中放入鋼珠並進行液氮速凍，再藉助破碎儀將96孔板內的所述待提取植物材料進行充分研磨，最後通過改良NaOH、CTAB或SDS法從研磨後的粉末中提取DNA，在所述提取DNA的過程中均利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道進行各種試劑的添加。
[0007]在上述方法中，作為一種優選實施方式，所述待提取植物材料為植物的新鮮或真空凍幹的真葉、嫩莖、子葉、嫩根或花部分的組織，或者所述組織的培養材料，所述96孔板每孔的待提取植物材料的用量為孔內容積的1/8-1/4 (比如1/7、1/6或1/5)，比如針對孔容積為(l-2ml)的96孔板，植物組織鮮樣每孔用量為10-500mg，幹樣或乾粉每孔用量為5_50mg，用量過多或過少都會影響DNA的提取效率。
[0008]在上述方法中，作為一種優選實施方式，所述待提取植物材料還可以為經催芽後的待提取植物種子，優選地，所述經催芽後的待提取植物種子的胚芽長度為l_3cm。
[0009]在上述方法中，所述植物可以為玉米、高粱、水稻、小麥、大豆、番茄、黃瓜、蘿蔔、油菜、菠菜、韭菜、大蔥、洋蔥、大白菜、西瓜、甜瓜、辣椒、茄子、青花菜、花椰菜或小白菜等。
[0010]在上述方法中，所述96孔板可以為96孔深孔板或96孔PCR板。[0011]在上述方法中，當所述待提取植物種子較小時，也可以直接將種子置於96孔板內或96孔PCR板加適量水後進行催芽，催芽後將孔內多餘的水分吸出以便於後續的操作。
[0012]在上述方法中，作為一種優選實施方式，所述改良NaOH法從研磨後的粉末中提取DNA的具體方法為:
[0013]步驟一,立即通過Zephyr MBW核酸工作站的96通道向裝有研磨後粉末的96孔板的各孔中加入 100-300 μ L (比如 120μ L、150y L、200y L、260y L 或 290 μ L) 0.2mol/L 的NaOH溶液，混勻後將所述96孔板置沸水浴中lmin，再加100 μ L、pH=8.0的Tris-Hcl，混勻後將所述96孔板置沸水浴中2min,之後4000rpm離心l_5min ；
[0014]步驟二，利用Z印hyr MBff核酸工作站的96通道從96孔板的各孔中取10-50 μ L(比如15μ L>20 μ L>25 μ L>30 μ L或45μ L)離心後的上清液到新的96孔板中，再加入190-950 μ L (比如 200 μ L、300 μ L、400 μ L、500 μ L、600 μ L、700 μ L、800 μ L 或 900 μ L)0.2mol/L、pH=8.0 的 Tris-Hcl 進行稀釋溶解。
[0015]在上述方法中，作為一種優選實施方式，所述CTAB法從研磨後的粉末中提取DNA的具體方法為:
[0016]步驟一,立即通過Zephyr MBW核酸工作站的96通道向裝有研磨後粉末的96孔板的各孔中加入 500-600 μ L (比如 510 μ L、550 μ L、570 μ L、580 μ L 或 590 μ L) CTAB 提取液，於65°C水浴10-15min (比如12min或14min)後向各孔中加入與各孔溶液等體積的氯仿與異戍醇的混合液，混勻後4000rpm離心5_12min (比如7min或Ilmin),其中在所述氯仿與異戊醇的混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，在所述CTAB提取液中各成分的濃度如下:0.1M Tris-HCl (ρΗ=8.0), 0.02Μ EDTA, 1.4M NaCl, 0.2νο1%β -巰基乙醇，0.05Μ CTAB ；
[0017]步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將96孔板的各孔中離心後的上清液轉移到新的96孔板中，然後向所述新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱lOmin，再在4000rpm離心10min，去除上清液，沉澱為提取的基因組DNA ；
[0018]步驟三,利用Zephyr MBW核酸工作站的96通道向步驟二離心得到的沉澱中分別加入100-200 μ L70%乙醇進行清洗,之後抽掉乙醇置通風櫥晾乾,幹樣為DNA,然後用水或TE進行稀釋溶解。
[0019]在上述方法中，作為一種優選實施方式，所述SDS法從研磨後的粉末中提取DNA的具體方法為:
[0020]步驟一,立即通過Zephyr MBW核酸工作站的96通道向裝有研磨後粉末的96孔板的各孔中加入lml65°C預熱的提取緩衝液，加入100 μ L20wt% (比如12wt%、15wt%、17wt%或19wt%)的SDS，並將96孔板於65°C水浴20min，期間搖勻1-2次；然後加入300-500 μ L5mol/L KAc,混勻後繼續於65°C水浴30min ;降至室溫後進行4000rpm離心10min,其中在所述提取緩衝液中各成分的濃度如下:IOOmM Tris-Hcl (pH=8.0),50mM EDTA (pH=8.0),500mMNaCl，IOmM β-巰基乙醇；
[0021]步驟二，利用Z印hyr MBff核酸工作站的96通道將經步驟一離心後的96孔板各孔中的上清液轉移到新的96孔板中，並向各孔中加入與孔中溶液等體積的氯仿和異戊醇的混合液，混勻後4000rpm離心5min,其中在所述氯仿和異戍醇的混合液中，氯仿與異戍醇的體積比為24:1 ；[0022]步驟三，利用Z印hyr MBff核酸工作站的96通道將經步驟二離心後的96孔板各孔中的上清液轉移到另一新的96孔板中，向所述另一新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱lOmin，4000rpm離心lOmin，去除上清液，沉澱為提取的基因組DNA ；
[0023]步驟四，利用Zephyr MBW核酸工作站的96通道向步驟三得到的沉澱中加入100-200 μ 170%乙醇進行清洗,之後抽掉乙醇置通風櫥晾乾,幹樣為DNA,然後用水或TE進行稀釋溶解。
[0024]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0025]本發明提供了一套高通量、低成本、快速提取植物DNA的技術體系，以96孔板(0.25-2ml不同規格)、96通道Z印hyr MBff核酸工作站為載體，每4板樣品(384個樣品)DNA提取在IOmin-1h內完成(鹼法最快IOmin完成，SDS和CTAB法約需lh)。實現每人每天(8小時)可完成至少3702-18432個樣品的DNA提取任務，如進行統籌計劃，可完成更多樣品DNA (8000-30000餘份材料)的提取任務，且單個樣品成本降至0.3-1元人民幣。本發明為遺傳群體材料分析、分子標記輔助育種、種子純度鑑定、轉基因材料鑑定等研究和實際應用提供技術支撐。另外，本發明採用自配試劑配方、不使用酶試劑，成本低，提取方法簡單，在移液步驟中利用工作站即能實現半自動化，得到的基因組DNA純度高、無蛋白及RNA汙染，穩定性好。【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1是本發明採用CTAB法和SDS法進行高通量低成本快速提取植物DNA的流程圖；
[0027]圖2是黃瓜種子96孔深孔板播種催芽示意圖；
[0028]圖3是Z印hyr工作站結合改良的CTAB法提取的黃瓜葉片DNA純度檢測電泳示意圖；
[0029]圖4是以Z印hyr工作站結合改良的CTAB法提取的黃瓜葉片DNA為模板經PCR擴增後的結果示意圖；
[0030]圖5是Z印hyr工作站結合改良的NaOH法提取的黃瓜種子DNA純度檢測電泳示意圖；
[0031]圖6是以Z印hyr工作站結合改良的NaOH法提取的黃瓜種子DNA為模板經PCR擴增後的結果示意圖；
[0032]圖7是Z印hyr工作站結合改良的SDS法提取的黃瓜葉片DNA純度檢測電泳示意圖；
[0033]圖8是以Z印hyr工作站結合改良的SDS法提取的黃瓜葉片DNA為模板經PCR擴增後的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例對本發明做進一步說明，目的在於更好地理解本
【發明內容】
，並非限制本發明於此。
[0035]本發明涉及的96孔深孔板或96孔PCR板購自北京泰博昌生物技術有限公司，以下實施例中使用的96孔深孔板或96孔PCR板各孔的規格為1.5ml ;鋼珠購自北點泰博昌生物技術有限公司；低溫乾燥設備購置基因公司的丹麥labogene CS55-9型；組織破碎儀為GTlOO型,購自北京格瑞德曼公司；Zephyr工作站為Caliper Zephyr系列核酸工作站，購自基因公司；離心機為5810R型離心機，購自Eppendoff公司；紫外分光光度儀為ThermoScientific ND2000微量分光光度儀，購自基因公司。
[0036]以下實施例中使用的溶液的配製方法:
[0037]CTAB提取液的配製:以配製1000mL為例
[0038]
【權利要求】
1.一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，其特徵在於，將待提取植物材料分別置於96孔板內，然後在每孔中放入鋼珠並進行液氮速凍，再藉助破碎儀將96孔板內的所述待提取植物材料進行充分研磨，最後通過改良NaOH、CTAB或SDS法從研磨後的粉末中提取DNA,在所述提取DNA的過程中均利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道進行各種試劑的添加。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述待提取植物材料為植物的新鮮或真空凍幹的真葉、嫩莖、子葉、嫩根或花部分的組織，或者所述組織的培養材料，所述96孔板每孔的待提取植物材料的用量為孔內容積的1/8-1/4。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述待提取植物材料為經催芽後的待提取植物種子，優選地，所述經催芽後的待提取植物種子的胚芽長度為l_3cm。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述植物為玉米、高粱、水稻、小麥、大豆、番茄、黃瓜、蘿蔔、油菜、菠菜、韭菜、大蔥、洋蔥、大白菜、西瓜、甜瓜、辣椒、茄子、青花菜、花椰菜或小白菜。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述96孔板為96孔深孔板或96孔PCR板。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述改良NaOH法從研磨後的粉末中提取DNA的具體方法為: 步驟一,立即通過Zephyr MBff核酸工作站的96通道向裝有研磨後粉末的96孔板的各孔中加入100-300 μ L0.2mol/L的NaOH溶液，混勻後將所述96孔板置沸水浴中lmin，再加100 μ L、pH=8.0的Tris-Hcl，混勻後將所述96孔板置沸水浴中2min，之後4000rpm離心l_5min ； 步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道從96孔板的各孔中取10-50 μ L離心後的上清液到新的96孔板中，再加入190-950 μ L pH=8.0,0.2mol/L的Tris-Hcl進行稀釋溶解。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述CTAB法從研磨後的粉末中提取DNA的具體方法為: 步驟一，立即通過Zephyr MBff核酸工作站的96通道向裝有研磨後粉末的96孔板的各孔中加入500-600 μ L CTAB提取液，於65°C水浴10-15min後向各孔中加入與各孔溶液等體積的氯仿與異戍醇的混合液，混勻後4000rpm離心5_12min,其中在所述氯仿與異戍醇的混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，在所述CTAB提取液中各成分的濃度如下:pH=8.0、0.1MTris-HCl, 0.02M EDTA, 1.4M NaCl, 0.2νο1%β -巰基乙醇，0.05Μ CTAB ； 步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將96孔板的各孔中離心後的上清液轉移到新的96孔板中，然後向所述新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱lOmin，再在4000rpm離心10min，去除上清液，沉澱為提取的基因組DNA ； 步驟三,利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道向步驟二離心得到的沉澱中分別加入100-200 μ L70%乙醇進行清洗,之後抽掉乙醇置通風櫥晾乾,幹樣為DNA,然後用水或TE進行稀釋溶解。
8.根據權利要求1所述的方 法，其特徵在於，所述SDS法從研磨後的粉末中提取DNA的具體方法為: 步驟一，立即通過Zephyr MBff核酸工作站的96通道向裝有研磨後粉末的96孔板的各孔中加入lml65°C預熱的提取緩衝液，加入100 μ L10-20wt%的SDS，並將96孔板於65°C水浴20min，期間搖勻1-2次；然後加入300-500 μ L5mol/L KAc,混勻後繼續於65°C水浴30min ;降至室溫後進行4000rpm離心10min,其中在所述提取緩衝液中各成分的濃度如下:ρΗ=8.0、100mmol/L Tris-Hcl, ρΗ=8.0、50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, IOmMβ -疏基乙醇； 步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將經步驟一離心後的96孔板各孔中的上清液轉移到新的96孔板中，並向各孔中加入與孔中溶液等體積的氯仿和異戊醇的混合液，混勻後4000rpm離心5min,其中在所述氯仿和異戍醇的混合液中，氯仿與異戍醇的體積比為24:1 ； 步驟三，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將經步驟二離心後的96孔板各孔中的上清液轉移到另一新的96孔板中，向所述另一新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱10min，4000rpm離心lOmin，去除上清液，沉澱為提取的基因組DNA ； 步驟四，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道向步驟三得到的沉澱中加入100-200 μ 170%乙醇進行清洗,之後抽掉乙醇置通風櫥晾乾,幹樣為DNA,然後用水或TE進行稀釋溶解。
【文檔編號】C12N15/10GK103882010SQ201410115253
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】溫常龍, 許勇, 於拴倉, 趙泓, 董從娟 申請人:北京市農林科學院