用於根結線蟲防治的方法和組合物的製作方法

2023-05-30 16:54:46

專利名稱：用於根結線蟲防治的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及由植物寄生的線蟲引起的疾病的遺傳防治。更具體地，本發明 涉及目標編碼序列的確認，並涉及使用重組DNA技術在植物寄生線蟲的細胞中進行轉錄 後阻抑或抑制目標編碼序列的表達，從而提供植物保護效果。
背景技術：
植物受到多種潛在的引起疾病的物質的影響，包括植物寄生的線蟲，其為生活 在潮溼表面上或液體環境(包括土壤內的水膜和其它生物體內的溼潤組織)中的活性的、 柔軟的、細長的生物體。有許多的植物寄生性線蟲物種，包括各種根結線蟲(例如根結 線蟲屬(Meloidogyne)的種)、根腐線蟲(Iesionnematodes)(如短體線蟲屬(Pratylenchus) 的種)、胞囊線蟲(cyst nematodes)(例如異皮線蟲屬(Heterodera)的種)、劍線蟲(dagger nematodes)(例如劍線蟲屬(Xiphinema)和蓮線蟲(stem and bulb nematodes)(例如蓮線蟲 屬(Ditylenchus)的種))及其它。墊刃線蟲(Tylenchid nematodes)(墊刃目的成員)(包括 異皮科(Heteroderidae)、根結線蟲科(Meloidogynidae)和短體科(Pratylenchidae))是最大 和最具經濟重要性的一組植物寄生的線蟲。線蟲類通過一系列的生命周期階段和蛻皮期 生長。典型地，具有五個階段和四個蛻皮期卵階段、Jl (即第一幼蟲階段)、Ml (即第 一蛻皮期)、J2(第二幼蟲階段，有時由卵孵化)、M2、J3、M3、J4、M4、A(成蟲)。 幼蟲(「J」 )階段有時也稱為蚴(「L」 )階段。基因表達可能對於一個或多個生命周 期階段是特異性的。植物特異性和動物特異性的線蟲種類已進化成為非常成功的寄生蟲，並在農 業和畜牧業方面造成重大的經濟損失和造成人的疾病和死亡。植物的線蟲寄生蟲可以 寄居在植物的所有部分，包括根、發育的花蕾、葉和莖。植物寄生蟲根據其攝食習 慣分成寬範圍的遷移性外寄生蟲(migratory ectoparasites)、遷移性內寄生蟲(migratory endoparasites)和定居性內寄生蟲(sedentary endoparasites)。定居性內寄生蟲(包括根結 線蟲種類(Meloidogyne spp.)和胞囊線蟲(球形胞囊線蟲屬(Globodera)和異皮線蟲)誘生 攝食位點(feeding site)(在根結線蟲的情況中是「巨細胞」和在胞囊線蟲的情況中是「合 胞體」)並在根中形成長期的感染，這通常對作物造成非常大的危害。據估計，按所有 主要作物每年估計平均12%的損失，寄生的線蟲在全世界每年對園藝業和農業造成超過 780億美元的損失。例如，據估計線蟲每年引起全世界大約32億美元的大豆損失(Barker等，1994)。 已經提供了幾種形式的用於防治線蟲感染的組合物、方法和藥物。在許多情況 下嘗試了生物和耕作防治方法(包括植物檢疫)。在某些作物中，已確認了提供線蟲抗性 或耐受性的植物抗性基因。化學組合物(如殺線蟲劑)通常應用於其中存在植物寄生性 線蟲的土壤中。但是，存在著對安全和高效的線蟲防治的急迫需求。與當前防治策略的 劣勢相關的因素包括對於農業可持續性的更高的關切和可能禁止或嚴厲限制許多可用的 農業化學驅蟲劑的使用的新政府法規。化學劑通常是非選擇性的並對非目標生物體產生作用，從而在施用該化學劑後 的一段時間內嚴重地破壞了有益微生物的種群。化學劑可能持久地存在於環境中且僅緩 慢地代謝。殺線蟲土壤薰劑(如三氯硝基甲烷和甲基溴及相關化合物)是高毒性的。甲 基溴已被確認為消耗臭氧的化合物，且其在美國使用的註冊已經被取消。這些藥劑也可 能累積在地下水或食物鏈中，並累積在較高營養層次的物種中。這些藥劑也可能具有突 變劑和/或致癌劑的作用以引起不可逆的和有害的遺傳改變。因此，線蟲防治的替代方 法(如遺傳方法)越來越多地受到研究。RNA幹擾(「RNAi」)是利用內源細胞途徑的方法，從而雙鏈RNA(dsRNA)
特異性的目標基因導致目標mRNA的降解。RNAi通過內源途徑發揮作用，包括能夠 從原dsRNA產生大約21個核苷酸的小幹擾RNA (siRNA)的Dicer蛋白複合體和使用 SiRNA引導(siRNA guides)識別並降低或阻斷相應mRNA的翻譯的RNA-誘導沉默複合 體(RISC)。僅與該siRNA互補的轉錄物受到影響，並因此mRNA表達的降低通常是序 列特異性的。RNAi的基因沉默效應持續數天且在試驗條件下可導致目標轉錄物豐度的 90%或更高的下降，隨之導致相應蛋白質水平的下降。附圖簡要說明

圖1顯示了用於選擇組合化學品(BASTA)和螢光(DsRed)以產生具有殺線蟲目 標基因(GOI)的均勻表達的毛根(Hairyroot)的毛根表達構建體的示意性實例。GOI可 編碼殺線蟲核苷酸，如靶向於關鍵線蟲基因的雙鏈RNA (dsRNA)。卡那黴素抗性用於細 菌宿主內的質粒擴增(plasmid propagation)。BASTA (草銨膦銨鹽草胺膦)耐受性通過 在甘露鹼(mannopine)合成酶啟動子和終止子的控制下的BAR基因(草胺膦乙醯轉移酶) 表達賦予。GOI可受到源自花椰菜花葉病毒35S啟動子(35S)或玄參花葉病毒(FMV)的 強組成型啟動子的驅動，或者可以使用多種植物啟動子(如泛素3啟動子)和終止子(如 E6、E9或章魚鹼合成酶(OCS)終止子)。紅色螢光蛋白DsRed可由強組成型病毒啟動 子或其它啟動子(如肌動蛋白7植物啟動子)驅動，並使用終止子如E6、E9或OCS。圖2顯示了實施例2中使用的線蟲評定量表(1-4)的例子。發明概述在一個方面中，本發明包括選自以下的多核苷酸(a)SEQIDNO: 1、SEQID NO: 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ IDNO 28、SEQ ID NO 29、 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQ ID NO 47的任何核酸序列的至少21個連續核苷酸的片段，其中植物寄 生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑 制該線蟲的生長；和(b) (a)中的序列的互補序列。在特定的實施方式中，該多核苷酸定 義為與異源啟動子可操作地連接。「異源的」意思是未發現天然地與所述多核苷酸結合 的任何序列(如啟動子)，包括例如，來自相同植物的未發現天然地結合在一起的核酸序 列的組合。在特定的實施方式中，該多核苷酸包含在植物轉化載體上。在本發明的進一 步的實施方式中，這裡提供的多核苷酸序列可以定義為分離的多核苷酸序列。本發明的另一方面是由這種多核苷酸的表達產生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中 植物寄生的線蟲攝取該核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長。在特定的實施方式中， 該雙鏈核糖核苷酸序列進一步定義為通過製備包含第一、第二和第三多核苷酸序列的重 組多核苷酸序列產生，其中所述第一多核苷酸序列包含選自以下的多核苷酸(a) SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、 SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ IDNO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 或 SEQ ID NO 47 的任何核酸序列的至少 21個連續核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的 雙鏈核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列；且其中所述 第三多核苷酸序列通過所述第二多核苷酸序列與第一多核苷酸連接，且其中第三多核苷 酸序列基本上為第一多核苷酸序列的反向互補序列，從而第一和第三多核苷酸序列在轉 錄成核糖核酸時雜交以形成由所連接的第二多核苷酸序列穩定的雙鏈核糖核苷酸分子。 在特別的實施方式中，當該多核苷酸序列被植物寄生的線蟲攝取時，該雙鏈核糖核苷酸 序列抑制基本上與該多核苷酸序列互補的核苷酸序列的表達。本發明的另一方面是包含選自以下的核苷酸序列的植物轉化載體(a) SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ IDNO 27、SEQ ID NO 28、 SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO : 46或SEQID NO : 47的任何核酸序列的至少21個 連續核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈 核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長；和(b) (a)中的序列的互補序列，其中該DNA序列 與在植物細胞中起作用的異源啟動子可操作地連接。本發明的進一步的實施方式是用這 種多核苷酸轉化的細胞。在特定的實施方式中，該細胞定義為原核細胞或真核細胞。在 特別的實施方式中，該細胞定義為植物細胞。本發明的另一實施方式涉及用選自以下的多核苷酸轉化的植物(a)SEQID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ IDNO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、 SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ IDNO : 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQ ID NO 47的任何核酸序列的至少21個連續核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈 核糖核苷酸序列將抑制線蟲的生長；和(b) (a)中的序列的互補序列。在特定的實施方式 中，該植物進一步定義為選自農作物，其選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、 西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、菸草、 胡蘿蔔、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞 植物。這種植物的種子(其中該種子包含所述多核苷酸)是本發明的另一實施方式。在 一些實施方式中，所述多核苷酸在植物或植物細胞(如根細胞)中表達為雙鏈核糖核苷酸 序列。在其它實施方式中，植物寄生的線蟲是根結線蟲種類。在特別的實施方式中，植 物寄生的線蟲是南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)。在再其它的實施方式中，植物寄 生的線蟲攝取抑制量的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制線蟲的生長和繁殖。本發明的另一方面是由包含選自以下的多核苷酸的植物生產的商品(a)SEQID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQID NO 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ IDNO 27、SEQ ID NO 28、 SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO : 46或SEQID NO : 47的任何核酸序列的至少21個 連續核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈 核糖核苷酸序列將抑制線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列，其中該商品包含可 檢測量的所述多核苷酸或由其表達的核糖核苷酸。本發明的另一方面是用於控制植物寄生線蟲的群體數量的方法，包括提供包含 在由線蟲攝取時發揮作用的雙鏈核糖核苷酸序列的藥劑，以抑制該線蟲體內的生物學功 能，其中該藥劑包含選自 SEQ ID NO 1、SEQID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQID NO: 17、SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、 SEQ ID NO 40、SEQ IDNO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 和 SEQ ID NO 47及其互補序列的核苷酸序列。本發明的再另一方面是用於控制植物寄生線蟲群體數量的方法，包括提供包含 在由植物寄生的線蟲攝取時發揮作用的第一多核苷酸序列的藥劑，以抑制該線蟲體內的 生物學功能，其中該多核苷酸序列沿著至少大約19-大約25個連續核苷酸表現出與源自 線蟲的編碼序列的大約95% -大約100%核苷酸序列同一性，並與第二多核苷酸序列雜 交，該第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列互補，且其中所述源自線蟲的編碼序列選 自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、 SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ IDNO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQID NO: 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ IDNO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 和 SEQ ID NO 47 及其互補序列。在特 定的實施方式中，線蟲是根結線蟲種類。在特別的實施方式中，線蟲是南方根結線蟲。 本發明的另一實施方式是用於控制植物寄生線蟲群體數量的方法，包括在植物寄生線蟲的宿主植物中提供表達選自以下的多核苷酸序列的轉化植物細胞SEQID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9、SEQID NO: 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、 SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 46和SEQ ID NO 47、這些多核苷酸序列的任一個 的至少21個連續核苷酸的片段及其互補序列，其中該多核苷酸被表達來產生在由植物寄 生的線蟲攝取時發揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制線蟲體內目標序列的表達並導致線 蟲或線蟲群的生長或繁殖相對於缺乏所述轉化植物細胞的宿主上的生長或繁殖降低。在 特定的實施方式中，該線蟲在感染宿主植物後表現出生長降低。構成本發明一部分的該 方法的特別實施方式中，目標序列編碼其預期功能如下的蛋白質DNA複製、細胞周 期控制、轉錄、RNA加工、翻譯、核糖體功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白質運輸 (protein trafficking),分泌、蛋白質修飾、蛋白質穩定、蛋白質降解、能量產生、線粒體 功能、中間代謝、細胞結構、信號轉導、內吞作用、離子調節、卵產生、繁殖和運輸。 在特別的實施方式中，線蟲選自根結線蟲種類。在更特別的實施方式中，線蟲是南方根 結線蟲。在一些實施方式中，該多核苷酸在由植物寄生的線蟲攝取時發揮作用以抑制其 執行的功能對於線蟲的存活、繁殖或生長關鍵的基因的表達，所述功能選自DNA複製、 細胞周期控制、轉錄、RNA加工、翻譯、核糖體功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白質 運輸、分泌、蛋白質修飾、蛋白質穩定、蛋白質降解、能量產生、線粒體功能、中間代 謝、細胞結構、信號轉導、內吞作用、離子調節、卵產生和運輸。

本發明的另一方面是用於減少宿主植物的根組織中形成的根結線蟲(RKN)攝食 位點的數目的方法，包括在根結線蟲的宿主植物中提供表達選自以下的多核苷酸序列的 轉化植物細胞SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 11、SEQID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、 SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ IDNO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 和 SEQ ID NO 47、這些多核 苷酸的任一個的至少21個連續核苷酸的片段及其互補序列，其中該多核苷酸被表達以產 生在由根結線蟲攝取時發揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制所述線蟲體內目標序列的表 達並導致所形成的攝食位點數目相對於缺乏所述轉化植物細胞的宿主上形成的攝食位點 數目降少。本發明的另一實施方式是防治植物中的植物線蟲蟲害的方法，包括在植物線蟲 害蟲的食物中提供dsRNA，其包含a)有義核苷酸序列；和b)與有義核苷酸序列互補的反 義核苷酸序列，其中有義核苷酸序列包含選自以下的核苷酸序列或與選自以下的核苷酸 序列互補SEQ IDNO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQID NO: 9、SEQID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ IDNO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、 SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ IDNO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 和 SEQ ID NO 47 及其互補序列。在一個實施方 式中，所述食物包含經轉化以表達所述有義和反義核苷酸序列的植物 細胞。本發明還涉及用於提高由遭受植物寄生線蟲感染的作物植物產生的作物產量的 方法，所述方法包括以下步驟a)將這裡描述的多核苷酸引入所述作物植物中；和b) 種植該作物植物以使得所述多核苷酸表達，其中該多核苷酸的表達抑制植物寄生線蟲感 染、生長、繁殖或由於植物寄生線蟲感染導致的產量損失。在特定實施方式中，該作 物植物選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科 植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、菸草、胡蘿蔔、棉花、油菜籽(加拿大油 菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞植物。在一些實施方式中，所述多 核苷酸的表達產生抑制已經與所述作物植物的一部分接觸的植物寄生線蟲中的至少第一 目標基因的RNA分子，其中該目標基因執行至少一種選自以下的關鍵功能DNA複製、 細胞周期控制、轉錄、RNA加工、翻譯、核糖體功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白質 運輸、分泌、蛋白質修飾、蛋白質穩定、蛋白質降解、能量產生、線粒體功能、中間代 謝、細胞結構、信號轉導、內吞作用、離子調節、卵產生、繁殖和運輸。在特定的實施 方式中，植物寄生的線蟲是墊刃線蟲。在特別的實施方式中，植物寄生的線蟲是根結線 蟲種類。在更特別的實施方式中，植物寄生的線蟲是南方根結線蟲。本發明的另一方面是用於提高遭受植物寄生線蟲感染的作物植物的滲透脅迫 (osmotic stress)耐受性的方法，所述方法包括以下步驟a)將權利要求1的多核苷酸引入 所述作物植物；b)種植該作物植物以允許所述多核苷酸表達，其中所述多核苷酸的表達 提高作物植物的滲透脅迫耐受性。在一些實施方式中，滲透脅迫耐受性定義為耐旱性。本發明的再另一方面是產生商品的方法，包括獲得包含SEQ IDNO 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQID NO 11、SEQID NO: 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ IDNO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ IDNO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQ ID NO 47任一核酸序列的至少21個連續核苷酸，其中植 物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制該線 蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列的植物或其部分；和從該植物或其部分製備 商品。本發明還涉及生產食物或飼料的方法，包括獲得這種植物或其部分和從所述植物 或其部分製備食物或飼料。在特定的實施方式中，食物或飼料定義為油、粗磨粉、蛋白 質、澱粉、麵粉或青貯飼料。本發明的再另一方面是調節植物寄生線蟲細胞中目標基因的表達的方法，該方 法包括(a)用包含選自以下的核酸序列轉化植物細胞SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ IDNO 19、SEQ ID NO 21、SEQID NO: 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ IDNO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、 SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47及這些序列中任一的至少21個連續核苷酸的片段，其 中該核酸序列編碼dsRNA並可操作地與啟動子和轉錄終止序列連接；(b)在足以允許包含多個轉化的植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養轉化的植物細胞；(C)選擇已 經將所述核酸序列整合到其基因組中的轉化植物細胞；(d)篩選表達由所述核酸序列編 碼的dsRNA的轉化植物細胞；和(e)選擇表達該dsRNA的植物細胞。本發明的另一實 施方式是進一步包括從表達所述dsRNA的植物細胞再生植物，從而植物中基因的表達足 以調節與轉化的植物或植物細胞接觸的植物寄生線蟲細胞中目標基因的表達。發明詳述下面是用於幫助本領域技術人員實施本發明的本發明詳細說明。本領域技術人 員可以在這裡描述的實施方式中進行改進和變化而不脫離本發明的精神或範圍。本發明提供了用於遺傳防治植物寄生線蟲蟲害，特別是用於遺傳防治植物的根 結線蟲屬(根癌)線蟲蟲害的方法和組合物。本發明還提供了根結線蟲屬植物寄生線蟲 的生活周期中關鍵的基因的確認和其用作線蟲種群的dsRNA介導的防治的靶標的方法。 編碼dsRNA分子的DNA質粒載體設計為抑制對於生長、發育、攝食或繁殖關鍵的線蟲 基因。例如，本發明提供了用於在植物寄生線蟲中的轉錄後阻抑或抑制目標編碼序列的 表達的方法和重組DNA技術，以通過允許植物寄生的線蟲食用由所有或一部分目標編碼 序列轉錄的一種或多種雙鏈或小幹擾核糖核酸(RNA)分子而提供保護效應，從而防治感
^fe ο本發明公開了根癌植物線蟲害蟲(根結線蟲種類)的來自保守的和對於植物寄生 線蟲的存活力關鍵的基因靶標的核苷酸和胺基酸序列。本發明進一步描述了這些序列用 於通過在根結線蟲的食物中提供包含本發明的一種或多種多核苷酸分子的一部分、或全 部或基本上全部的dsRNA改變至少根結線蟲細胞中一種或多種目標多核苷酸或蛋白質分 子的表達。這些目標根結線蟲序列的高核苷酸保守性有利於以少數的dsRNA構建體同時 靶向於多種根結線蟲種，同時提供對相似或同源的人和植物序列的選擇性，並還提供對 存在於其它非目標生物體(如有益的昆蟲，例如蜜蜂或蝴蝶)中的相似或同源序列的選擇 性。用於防治根結線蟲的環境良好但高效的替代方法是使用對關鍵線蟲基因進 行RNA幹擾以控制植物的線蟲蟲害。這是通過植物中與目標線蟲基因互補的雙鏈 RNA(dsRNA)的轉基因表達實現。該dsRNA與目標基因的互補性可能在選為靶標的序 列中是完全的(即100% )，或者dsRNA的序列可能沿選為靶標的序列基本上互補(例如 90%或95%以上)。因此，本發明涉及使用雙鏈RNA (dsRNA)，包括小的幹擾RNA(siRNA)，序列
特異性地抑制編碼序列的表達，從獲得預期水平的根結線蟲防治。 本發明還提供了抑制根結線蟲(根結線蟲種類)內的目標基因功能的方法，其可 以通過RNA幹擾完成，從而導致病原體生活周期的破壞。用於破壞的最佳目標基因包括 生命周期關鍵基因，該破壞引起寄生蟲種群的高滲透性死亡或通過以對植物的最小攝食 損傷阻止繁殖、減少所形成的攝食位點的數目、使所產生的卵的數目最小化、使卵的存 活力最小化和使達到下一世代的存活逃脫蠕蟲的數目最小化而導致「遺傳性死亡」。在 特別的實施方式中，可以通過將由施用本發明的方法和組合物的根結線蟲屬的線蟲產生 的卵的數目與在類似條件下生長但未施用這些方法和組合物的根結線蟲屬的線蟲產生的 卵的數目進行比較測定效率。本發明的另一方面提供預計對根結線蟲種類生長和/或發育(如攝食或卵的產生)關鍵的目標基因的核酸。用於預測這類目標的特徵包括與具有 強的和可再現的RNA幹擾表型的已知秀麗隱杆線蟲(C.elegans)基因的直系同源性、與大 豆胞囊線蟲(H.glvcines)(大豆的胞囊線蟲)中RNAi驗證的基因和根結線蟲種類中的表達 模式的直系同源性。
在本發明的再另一實施方式中，提供了如SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO 3、SEQ IDNO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 23、 SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 46 或 SEQ ID NO 47 或者其互補 序列的一系列分離的和純化的核苷酸序列。本發明還提供了用於表達一種或多種RNA以 抑制植物寄生的線蟲中由這些序列及其片段表達的目標基因的表達的穩定dsRNA分子。 穩定的dsRNA (包括dsRNA或siRNA分子)可以包含至少兩個轉錄序列，如沿相對於至 少一個啟動子的有義和反義方向排列的編碼序列，其中包含有義鏈和反義鏈的核苷酸序 列通過至少大約1至大約1000個核苷酸的間隔序列連接或接合，其中該有義鏈和反義鏈 可能長度不同，且其中兩個轉錄的序列各與以下所示的任何一個或多個核苷酸序列共有 至少80%的序列同一性，至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同 一性SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ IDNO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO 32、SEQID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQ IDNO 47或其互補序列。在再另一方面中，本發明提供了包含編碼這裡描述的dsRNA分子的核酸分子的 重組DNA構建體。dsRNA可以通過從與選自以下的核苷酸序列至少大約80%至大約 100%相同的核苷酸序列轉錄該dsRNA分子的一個鏈而形成SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO : 30、SEQ ID NO 32、 SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 禾口 SEQ ID NO : 47及其互補序列的至少21個連續核苷酸至全長的片段。這些重組DNA構建體可以定義 為產生能夠在攝食時抑制植物寄生線蟲細胞中內源目標序列的表達的dsRNA分子。該構 建體可以包含可操作地與在宿主細胞(如植物細胞)中發揮作用的啟動子序列連接的本發 明的核苷酸序列。這種啟動子可以是組織特異性的且可以是例如對作為植物寄生線蟲攻 擊對象的組織類型特異性的。在例如分別為根或葉病原體的情況中，可能希望使用分別 提供根或葉優先表達的啟動子。根據本發明的核苷酸序列的核酸構建體可以包含至少一個非天然存在的核苷酸 序列，該非天然存在的核苷酸序列可以轉錄成能夠通過分子間或分子內雜交在體內形成 dsRNA分子的單鏈RNA。這些dsRNA序列自組裝並可以在植物寄生線蟲的營養源中提 供以獲得希望的抑制作用。重組DNA構建體可以包含一個或多個不同的非天然存在的序列，該序列在體內表達為dsRNA序列並 在植物寄生線蟲的宿主植物的組織中提供時，抑制植物寄生線蟲中 至少兩個不同目標基因的表達。在特定的實施方式中，至少2、3、4、5、6、8或10個 或更多的不同dsRNA在具有線蟲抑制效應的細胞或包含該細胞的植物中產生。dsRNA可 以從在不同轉化事件中引入或可能引入到單一核酸分子上的多個構建體表達。dsRNA可 以使用單個啟動子或多個啟動子表達。在本發明的一個實施方式中，產生包含與植物寄 生線蟲體內的多個基因座同源的核酸的單一 dsRNA。在再另一方面中，本發明提供了在其基因組中具有至少一個重組DNA序列的重 組宿主細胞，該重組DNA序列被轉錄以產生至少一個在被植物寄生的線蟲攝食時發揮功 能的dsRNA分子，從而抑制目標基因在線蟲中的表達。dsRNA分子可以由這裡描述並如 序列表中所示的任何核酸序列編碼。本發明還提供了在其基因組中具有至少一個這裡描 述的重組DNA序列的轉化植物細胞。還提供了包含這種轉化植物細胞的轉基因植物，包 括任何世代的後代植物、種子和植物產物，各包含該重組DNA。本發明的dsRNA分子 可以在轉基因植物細胞中發現，例如在細胞質中。它們也可以在非原質體空間中發現。本發明進一步提供選自SEQIDNO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ IDNO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、 SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO 32、SEQID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQIDN0: 44、SEQ ID NO 46和SEQ IDNO 47及其互補序列的核酸序列的 片段。該片段可以定義為當表達為dsRNA並被線蟲攝取時引起死亡、生長抑制、繁殖 降低或中止根結線蟲屬線蟲的蟲害或攝食。該片段可以例如包含SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQID NO: 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 21、SEQ IDNO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、 SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 46 或 SEQ ID NO 47 或其互補序列中任何一個或多個序列的至少大約19、21、23、25、40、60、80、100、 125、200、250、300、400或更多的連續核苷酸或其全長。用於本發明中的有益DNA片 段的一個例子是至少大約19至大約23、或大約23至大約100個核苷酸，但少於大約2000 個核苷酸的長度。特別有用的是與包括19、21、23、25、40、60、80、100、125、200、 250、300、400個或更多連續核苷酸的線蟲目標序列同源的包括大約23至大約300個核苷 酸的dsRNA序列。本發明還提供從任何這些序列表達的核糖核酸(包括dsRNA)。選擇 用於表達基因抑制劑的序列可以由源自一個或多個目標植物寄生線蟲種類並意圖用於表 達RNA的單個序列構建，該RNA起到在一種或多種目標病原體中抑制單個基因或基因家 族的作用，或該DNA序列可以構建為多個DNA序列的嵌合體。在另一實施方式中，本發明提供了用於調節線蟲細胞(如根結線蟲種類的細胞) 中目標基因的表達的方法，該方法包括(a)用包含與啟動子和轉錄終止序列可操作地連 接的核酸序列的載體轉化植物細胞，其中所述核酸序列編碼dsRNA; (b)在足以允許包 含多個轉化的植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養轉化的植物細胞；(C)選擇已 經將該載體整合到其基因組中的轉化植物細胞；(d)篩選表達由該載體編碼的dsRNA的 轉化植物細胞；(e)選擇表達該dsRNA的植物細胞；(f)任選地從表達該dsRNA的植物細胞再生植物，從而植物中核酸序列的表達足以調節與轉化的植物或植物細胞接觸的植物寄生線蟲的細胞中目標基因的表達。基因表達的調節可以包括這種表達的部分或完全 抑制。在再另一方面中，本發明提供了用於抑制植物寄生的線蟲中的基因表達的方 法，包括在線蟲宿主的組織中提供基因抑制量的由這裡描述的核苷酸序列轉錄的至少一 種dsRNA分子，其至少一個片段與植物寄生線蟲細胞中的mRNA序列互補。該方法可以 進一步包括觀察植物寄生線蟲的死亡、生長抑制或繁殖降低及宿主症狀的程度。在一個 實施方式中，被按照本發明的病原微生物攝食的dsRNA分子(包括其修飾形式如SiRNA 分子)可以是與由選自以下的核苷酸序列的全部或一部分轉錄的RNA分子至少大約80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99 或 大約 100% 相同SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、 SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQID NO: 27 至 SEQID NO: 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 44、SEQ ID NO 46 禾口 SEQ ID NO 47。因此，提供了用於轉錄本發明的dsRNA分子的分離的和基本純化的核酸分子， 包括但不限於非天然存在的核苷酸序列和重組DNA構建體，其在引入植物寄生線蟲中時 阻止或抑制內源編碼序列或目標編碼序列在植物寄生線蟲體內的表達。本發明還包括轉 基因植物，其(a)包含編碼所述分離的和基本純化的核酸分子的核苷酸序列和用於轉錄防 治植物寄生線蟲感染的dsRNA分子的非天然存在的重組DNA構建體和(b)顯示出對感染 的抗性和/或增強的耐受性。本發明包括用於局部施用到植物上或動物上或動物的環境 中以實現植物寄生線蟲感染的消除或降低的包含本發明的dsRNA核苷酸序列的組合物。編碼對於生存關鍵的蛋白質或蛋白質部分的cDNA序列(如參與各種代謝或降解 代謝途徑、細胞分裂、繁殖、能量代謝、消化等的胺基酸序列)可以選擇用於製備在植 物寄生線蟲的宿主植物中提供的雙鏈RNA分子。如這裡描述的，目標生物體攝食包含一 個或多個dsRNA (其至少一個片段對應於目標病原體的細胞中產生的RNA的至少基本上 相同的片段)可導致目標生物體的死亡或其它抑制。這些結果表明源自於植物寄生線蟲 的核苷酸序列(DNA或RNA)可用於構建對線蟲攝食具有抗性的植物細胞。例如，線蟲 的宿主植物可轉化為包含一個或多個源自這裡提供的線蟲的核苷酸序列。轉化到宿主中 的核苷酸序列可以編碼形成為轉化的宿主內的細胞或生物液體中的dsRNA序列的一個或 多個RNA，因此如果/當植物寄生線蟲形成與轉基因宿主的營養關係時使得該dsRNA可 為植物寄生線蟲得到。這可以導致植物植物寄生的根結線蟲類線蟲的細胞中一個或多個 基因的表達的抑制及其最終死亡或其生長、發育或繁殖的抑制。本發明一般涉及宿主生物體中植物寄生的線蟲的遺傳防治。更特別地，本發明 包括遞送線蟲防治藥劑至植物寄生的線蟲的方法。這類防治藥劑引起植物寄生線蟲攝 食、生長或在目標宿主中另外引起疾病的能力的直接或間接損害。本發明在一個實施方 式中提供了包括向植物寄生線蟲遞送作為抑制植物寄生線蟲中的目標基因的手段的穩定 的dsRNA分子，因此在線蟲宿主中獲得預期的植物疾病的防治。在實現前述方法時，本發明提供了抑制植物寄生線蟲中目標基因的表達的方法，從而導致 生長、發育、繁殖和/或攝食的損害，並最終可能導致植物寄生線蟲的死 亡。在一個實施方式中，該方法包括將部分或完全穩定的雙鏈RNA(dsRNA)核苷酸分子 (包括其修飾形式如小的幹擾RNA(siRNA)序列)引入植物寄生線蟲的營養組合物中，和 使得該營養組合物或食物源為植物寄生線蟲所用。攝食包含雙鏈或SiRNA分子的營養組 合物導致線蟲細胞攝取分子，從而導致線蟲細胞中至少一個目標基因表達的抑制。目標 基因的抑制發揮對線蟲的有害效應。該方法和相關的組合物可用於通過在線蟲的宿主中 提供一種或多種包含這裡描述的dsRNA分子的組合物在線蟲存在的任何宿主組織或環境 中或其上限制或消除線蟲對植物或植物細胞的感染或寄生。在特定的實施方式中，本發明提供的dsRNA分子包含與以下任一所示的序列互 補的核苷酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ IDNO 5、SEQ ID NO 7、 SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 23、SEQ ID NO 25、SEQID NO: 27 至 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQID NO: 47，其在植物寄生的線蟲中的抑制導致對線 蟲的生長和發育、繁殖或其它生物功能關鍵的蛋白質或核苷酸序列物質的減少或消除。 所選擇的核苷酸序列可以表現出與如下所示的一個核苷酸序列的大約80%至大約100% 的同一性SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQID NO: 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ IDNO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 40、 SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 46 或 SEQ ID NO 47，或者其至少 21 個連續核苷酸的片段直至該序列的全長，包括其互補序列。在特定的其它實施方式中， 能夠編碼有效的dsRNA分子的DNA序列選自於SEQ ID NO 27至SEQ ID NO 30、 SEQID NO 32、SEQ ID NO 46和SEQ ID NO 47或其互補序列。這種抑制可描述為 特異性的，因為來自目標基因一部分的核苷酸序列選自抑制性dsRNA或siRNA由其轉錄 的序列。該方法有效地抑制至少一個目標基因的表達並可用於抑制植物寄生線蟲中的許 多不同類型的目標基因。確認為具有線蟲防治效果的序列可以通過建立適宜的表達構建體輕易地表達 為dsRNA分子。例如，這些序列可以通過以下方式表達為髮夾及莖和環結構取得對 應於選自 SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQID NO 47或其片段的第一片段；將這一序列連接到不與 第一片段同源或互補的第二片段間隔區；並將其連接到轉錄RNA的第三片段，其中該 第三片段的至少一部分與第一片段基本互補。這種構建體通過第一片段與第三片段的 雜交形成莖和環結構且形成包含第二片段的環結構(W094/01550、W098/05770、US 2002/0048814A1和US2003/0018993A1)。dsRNA可以例如以雙鏈結構(如莖環結構， 例如髮夾)的形式產生，從而靶向於線蟲序列的siRNA的產生通過共表達導致siRNA產 生增加的靶向基因的片段(例如在另外的植物可表達盒上)而增強，或減少甲基化以阻止dsRNA髮夾啟動子的轉錄基因沉默(例如，W005/019408)。本發明包括的根結線蟲屬的典型物種包括花生根結線蟲(M.arenaria)、奇特 伍德根結線蟲(M.chitwoodi)、不列顛根結線蟲(M.artiellia)、偽哥倫比亞根結線蟲 (M.fallax) >北方根結線蟲(M.hapla)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、南方根結線蟲、小結 根結線蟲(M.microtyla)、M.partityla、番禺根結線蟲(M.panyuensis)禾Π M.paranaensis。 可能與根結線蟲一起發現的其它植物寄生線蟲包括球形胞囊屬、短體線蟲屬、擬毛刺 線蟲屬(Paratrichodorus)、穿孔線蟲屬(Radopholus)、紐帶線蟲屬(Hoplolaimus)、 莖線蟲屬、錐線蟲屬(Dolichodoras)、螺旋線蟲屬(Helicotylenchus)、潛根線蟲屬 (Hirschmanniella)、劍線蟲屬、腎形線蟲屬(Rotylenchulus)、毛刺線蟲屬(Trichodoras)、 矮化線蟲屬(Tylenchorhynchus)、刺線蟲屬(Belonolaimus)和長針線蟲屬(Longidoras)。本發明的方法和組合物可應用於任何單子葉或雙子葉植物，取決於所希望的病 原體(例如線蟲)防治。本發明保護的典型植物以及與它們相關的根結和其它植物寄 生的線蟲物種包括，但不限於苜蓿北方根結線蟲、南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、鱗 球莖莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、短體線蟲類、針線蟲類(Paratylenchus spp.)、劍線蟲 類；香蕉南方根結線蟲、花生根結線蟲、爪哇根結線蟲、香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)、多帶螺旋線蟲(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短體線蟲(Pratylenchus coffeae)、腎形線蟲(Rotylenchulus reniformis)；蠶豆和豌豆根結線蟲類、異皮線蟲 類、刺線蟲類、螺旋線蟲類、腎形線蟲、銀鏈花擬毛刺線蟲(Paratrichodorus anemones)、 毛刺線蟲類；木薯根結線蟲類、腎形線蟲；穀類納西根結線蟲(Meloidogyne naasi(大麥、小麥、黑麥)；鷹嘴豆根結線蟲類、木豆胞囊線蟲(Heterodera cajani)、 腎形線蟲、塞氏紐帶線蟲(Hoplolaimusseinhorsti)、短體線蟲類；柑橘根結線蟲類、 柑橘半穿刺線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、香蕉穿孔線蟲、柑橘穿孔線蟲(Radopholus citrophilus)、 Hemicycliophora arenaria、短體線蟲類、長尾朿Il 線蟲(Bolonolaimus longicaudatus) >毛刺線蟲類、擬毛刺線蟲類、劍線蟲類；三葉草根結線蟲類、三葉 草胞囊線蟲(Heterodera trifolii)；玉米南方根結線蟲、短體線蟲類、較小擬毛刺線 蟲(Paratrichodoras minor)、長針線蟲類、哥倫比亞紐帶線蟲(Hoplolaimuscolumbus)； 棉花南方根結線蟲、長尾刺線蟲(Belonolaimus longicaudatus)、腎形線蟲、盔狀紐 帶線蟲(Hoplolaimusgaleatus)、短體線蟲類、矮化線蟲類、較小擬毛刺線蟲；葡萄 根結線蟲類、劍線蟲類、傷殘短體線蟲(Pratylenchus vulmis)、柑橘半穿刺線蟲、腎形 線蟲；草類短體線蟲類、長針線蟲類、Paratrichodoras christiei、劍線蟲類、莖線蟲 類；花生北方根結線蟲、花生根結線蟲、短體線蟲類、小環線蟲類(Cricanemella spp.)、長尾刺線蟲；木豆根結線蟲類、木豆胞囊線蟲、腎形線蟲、塞氏紐帶線蟲、 短體線蟲類；馬鈴薯根結線蟲類、馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)、馬鈴薯 白線蟲(Globodera pallida)、短體線蟲類、原始毛刺線蟲(Trichodoras primitivus)、莖 線蟲類、擬毛刺線蟲類、異常珍珠線蟲(Nacobbus abemrns)；稻根結線蟲類、水稻 幹尖線蟲(Aphelenchiodes besseyi)、水稻蓮線蟲(Ditylenchus angustus)、潛根線蟲類 (Hirchmanniella spp.)、水稻胞囊線蟲(Heteroderaoryzae)；小果根結線蟲類、短體線 蟲類、劍線蟲類、長針線蟲類、Paratrichodoras christiei，滑刃線蟲類(Aphelenchoides spp.)；大豆南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、大豆胞囊線蟲、刺線蟲類、 哥倫比亞紐帶線蟲；甜菜根結線蟲類、甜菜胞囊線蟲(Heteroderaschachtii)、鱗球莖莖線蟲、異常珍珠線蟲、毛刺線蟲類、長針線蟲類、擬毛刺線蟲類；甘蔗根結線蟲類、短體線 蟲類、穿孔線蟲類、異皮線蟲類、紐帶線蟲類、螺旋線蟲類、盾線蟲類(Scutellonema spp.)、刺線蟲類、矮化線蟲類、劍線蟲類、長針線蟲類、擬毛刺線蟲類；菸草根結線 蟲類、短體線蟲類、菸草矮化線蟲(Tylenchorhynchus claytoni)、菸草胞囊線蟲(Globodera tabacum)、毛刺線蟲類、美洲劍線蟲(Xiphinema americanum)、鱗球莖莖線蟲、擬毛刺線 蟲類；和西紅柿根結線蟲類、短體線蟲類。本發明的各個方面特別可用於具有線蟲抗性的轉基因植物，包括但不限於 玉米、穀類(包括小麥、大麥、黑麥和水稻)、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、三葉 草、豆類(包括大豆(Glycine sp.)、蠶豆和苜蓿)、甘蔗、甜菜、菸草、胡蘿蔔、棉花 (Gossypium sp.) >油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀 賞植物等。本發明還提供用於防治植物寄生線蟲的感染的方法和組合物。一種方法提供了 用於保護植物免受植物寄生線蟲侵害的如本文中所述的dsRNA方法以及表現出與dsRNA 方法和組合物不同的特徵且可以幹擾線蟲生長、發育或繁殖的一種或多種化學劑。A.核酸組合物和構建體本發明提供了用於獲得特定宿主靶標的穩定轉化的重組DNA構建體。轉化的宿 主靶標可以由該重組DNA構建體表達有效水平的優選dsRNA或siRNA。分離的和純化 的核苷酸序列的對可以由cDNA文庫和/或基因組文庫信息提供。核苷酸序列對可以源 於用作熱擴增引物的任何線蟲以產生本發明的dsRNA和siRNA分子。如本文中所用的，術語「核酸」指從5』至3』端顯示的脫氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸鹼基的單鏈或雙鏈聚合物。「核酸」也可以任選地包含允許通過聚合物正確地 通讀且不減少該核酸編碼的多肽的表達的非天然存在的或改變的核苷酸鹼基。術語「核 苷酸序列」或「核酸序列」指作為單獨的單鏈或雙鏈體的核酸有義和反義鏈。術語「核 糖核酸」(RNA)包括 RNAi (抑制 RNA)、dsRNA (雙鏈 RNA)、siRNA (小幹擾 RNA)、 shRNA (小髮夾 RNA)、mRNA (信使 RNA)、miRNA (微 RNA)、tRNA (轉移 RNA，不 論是否帶有相應的醯化胺基酸)和cRNA(互補RNA)且術語「脫氧核糖核酸」(DNA)包 括cDNA和基因組DNA及DNA-RNA雜交體。詞語「核酸片段」、「核苷酸序列片段」 或更一般地說「片段」，本領域技術人員理解為包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉 移RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列和表達或可適用於表達蛋白質、多肽或肽的較 小的工程核苷酸序列的功能術語。本發明提供了核苷酸序列，其表達產生基本上與植物寄生線蟲中靶向基因的 RNA分子的整個或部分同源的RNA序列，該靶向基因的RNA分子包含線蟲基因組中核 苷酸序列編碼的RNA序列。因此，在消化穩定的RNA序列後，可以獲得植物寄生線蟲 細胞中目標基因的核苷酸序列的下調，從而導致對線蟲生長、生存力、增殖或繁殖的有
害效應。如本文中所使用的，用於核酸序列的術語「基本上同源」或「基本同源性」 包括在嚴格條件下與以下任一的編碼序列雜交的核苷酸序列如序列表中所示的SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9、SEQID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、 SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO : 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO : 44、SEQ ID NO 46或SEQ ID NO 47或其互補序列。在嚴格條件下與如序列表中所示的SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQID NO: 11、SEQID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、 SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 46 或SEQ ID NO 47或其互補序列雜交的序列是使得在兩個序列之間發生反平行排列的那 些序列，且然後該兩個序列能夠在嚴格條件下與相對鏈上的相應鹼基形成氫鍵，從而形 成可使用本領域中公知的方法檢測的在適當的嚴格性(包括高嚴格性)條件下充分穩定的 雙鏈體分子。基本同源的序列通常與序列表中的SEQIDNO 1、SEQ ID NO 3、SEQ IDNO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 23、 SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 或 SEQID NO 47 任一所示 的所指核苷酸序列或其互補序列具有大約70%至大約80%的序列同一性，或更特別地大 約80%至大約85%的序列同一性或更特別地大約90%至大約95%的序列同一性，至大約 99%的序列同一性。 如本文中所用的，術語「直系同源基因(OrthOlOg) 」指兩個或多個物種中由共同 的祖先核苷酸序列進化的且可以在該兩個或多個物種保持相同功能的基因。如本文中所用的，術語「序列同一性」、「序列相似性」或「同源性」用於描 述兩個或多個核苷酸序列之間的序列關係。兩個序列之間「序列同一性」的百分比通 過在比較窗口內比較兩個最佳對齊序列確定，其中比較窗口中的序列部分與用於兩個序 列的最佳對齊的基準序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即空隙)。 該百分比通過確定兩個序列中存在的相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數目以獲得匹配 位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中總的位置數目並將其結果乘以100以產 生序列同一性的百分比而計算。與基準序列相比在每一位置相同的序列可以說與基準序 列相同，反之亦然。如果第一核苷酸序列表現出與第二或基準序列的完全互補性，則沿 5』 _3』方向觀察的第一核苷酸序列可以說是沿3』 -5』方向觀察的第二或基準核苷酸 序列的「互補序列」或與其互補。如本文中所用的，當沿5』 -3』閱讀的序列之一的每 一核苷酸與沿3』 -5』閱讀的其它序列的每一核苷酸互補，則可以說核酸序列分子表現 出「完全互補性」。與基準核苷酸序列互補的核苷酸序列表現出與基準核苷酸序列的反 向互補序列相同的序列。這些術語和說明在本領域中很好地定義並易於被本領域普通技 術人員理解。如本文中所用的，「比較窗口」指至少6個連續位置，通常大約50-大約100， 更通常大約100-大約150個連續位置的概念片段(conceptual segment)，其中兩個序列
最佳對齊後某一序列與相同數目連續位置的基準序列比較。比較窗口與用於兩個序列 的最佳對齊的基準序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含大約20%或更低的添加或缺失(即空 隙)。本領域技術人員可以在Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA)中找到用於序列比 對的詳細方法或從Ausubel等(1998)找到序列分析的詳細說明。本發明提供了能夠在細胞或微生物中表達為RNA轉錄物以抑制植物寄生線蟲的 細胞、組織或器官中目標基因表達的DNA。該序列包含編碼一種或多種不同核苷酸序列 的DNA分子，其中各不同核苷酸序列包含有義核苷酸序列和反義核苷酸序列。該序列可 以由編碼本發明的dsRNA分子的一部分間隔序列連接。間隔序列可以構成有義核苷酸序 列或反義核苷酸序列的部分或者不相關核苷酸序列，並且在該dsRNA分子中有義和反義 序列之間形成。有義核苷酸序列或反義核苷酸序列基本與目標基因或其衍生物的核苷酸 序列或其互補序列相同。dsRNA分子可以可操作地置於在表達該dsRNA的細胞、組織或 器官中具有功能的啟動子序列的控制下以產生dsRNA分子。在某些實施方式中，DNA 序列可以源自如序列表中的SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQID NO: 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQID NO: 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、 SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46或SEQ ID NO 47所示的核苷酸序列或其互補序列。本發明還提供用於在植物細胞中表達的DNA序列，該植物在將該DNA表達為 RNA並被植物寄生的線蟲攝食時獲得抑制植物寄生線蟲的細胞、組織或器官中的目標基 因的效果。dsRNA可以包含一個或多個結構基因序列，其中各結構基因序列包含可以通 過在互補和反義序列中形成環的間隔序列連接的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列。有 義核苷酸序列或反義核苷酸序列基本與目標基因的核苷酸序列、其衍生序列或其互補序 列相同。一個或多個結構基因序列可以可操作地置於一個或多個啟動子序列的控制下， 至少一個啟動子序列在原核或真核生物體(特別是植物細胞)中是可操作的。在植物中 表達基因抑制分子的方法是已知的(例如美國公開2006/0200878A1)，且可以用於表達本 發明的核苷酸序列。根據本發明的用於植物寄生線蟲防治的基因序列或片段可以克隆到可在轉基因 植物中操作的兩個組織特異性啟動子(如兩個根特異性啟動子)之間並且在其中表達以在 轉基因植物細胞中產生向其中形成dsRNA分子的mRNA。根特異性啟動子的實例是本領 域中已知的(例如線蟲誘導的RB7啟動子；美國專利5,459,252 ； Opperman等，1994)。 植物組織中包含的dsRNA分子被植物寄生的線蟲攝食以獲得預期的目標基因表達的抑 制。花椰菜花葉病毒35S啟動子(轉基因植物中通用的原型強啟動子)或相關啟 動子如E35S或FMV啟動子可以用於驅動線蟲抗性基因，特別是對於根結線蟲(參見 實施例8)。啟動子也已確認為指導在植物中線蟲誘導的覓食結構中的基因表達(例 如Gheysen和Fenoll，2002)。 因此，可以利用在覓食位點中可再生表達的基因中確 認的啟動子。在線蟲形成的覓食位點中上調的基因的實例包括在根和芽頂端分生組織 中表達的 AtlO.l(Mazarei 等，2003)、Hslpro-1 (Thurau 等，2003)、通常在伴細胞中表 達的AtSUC2 (Juergensen等，2003)、在維管組織和根尖中表達的Atl7.1 (Mazarei等， 2004)、FGAM合成酶(磷酸核糖甲醯甘氨脒合成酶(phosphoribosylformyHglycinamidinesynthase)) (Vaghchhipawala 等，2004)禾Π ABI3 (De Meutter 等，2005)等。根結巨細胞具有傳遞細胞(transfer cell)特有的細胞壁內生形態。因此，韌皮部中的基因表達也可能適 於輸送效應分子到覓食位點中。本發明提供的核苷酸序列可以包含由「間隔序列」分隔的反向重複序列。間隔 序列可以是包含有助於在各重複序列之間形成二級結構(這是需要的)的任何核苷酸序 列的區域。在本發明的一個實施方式中，間隔序列是mRNA的有義或反義編碼序列的部 分。或者間隔序列可以包含能夠與核酸分子共價連接的核苷酸或其同系物的任何組合。 間隔序列可以包含例如至少大約10-100核苷酸長度，或大約100-200核苷酸長度，至少 大約200-400核苷酸長度或至少大約400-500核苷酸長度的核苷酸序列。該核酸分子或核酸分子的片段或序列表中的其它核酸分子能夠在某些情況下特 異性地與其它核酸分子雜交。如本文中所用的，如果兩個分子能夠形成反平行、雙鏈核 酸結構，則可以說兩個核酸分子能夠彼此特異性地雜交。如果它們表現出完全互補性， 則可以說某一核酸分子是另一核酸分子的互補序列。如果兩個分子可以以足夠的穩定 性彼此雜交以允許它們在至少常規「低嚴格性」條件下保持彼此退火，則可以說它們是
「最小互補」的。類似地，如果兩個核酸分子可以以足夠的穩定性彼此雜交以允許它們 在常規「高嚴格性」條件下保持彼此退火，則可以說該分子互補。常規嚴格性條件由 Sambrook 等，(1989)和 Haymes 等，(1985)描述。因此，偏離完全互補性是可允許的，只要這種偏離不完全排除分子形成雙鏈結 構的能力。因此，為了核酸分子或核酸分子的片段用作引物或探針，它只需要能夠在所 採用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩定雙鏈結構的足夠互補性。促進DNA雜交的適宜嚴格性條件例如可以以相對低的鹽和/或高溫條件(如通 過大約0.02M至大約0.15M NaCl和大約50°C至大約70°C提供的條件)用於需要高選擇 性的應用。例如，高嚴格性條件是用高嚴格性洗滌緩衝液(0.& SSC或Ix SSC，0.1% SDS, 650C )洗滌雜交過濾器至少兩次。其它條件(如大約45°C下的6.0x氯化鈉/檸檬 酸鈉(SSC)，隨後在50°C下進行2.0XSSC的洗滌)也是本領域技術人員已知的且可以在 Current Protocols in Molecular Biology (1989)中找到。例如，洗滌步驟中的鹽深度可以選 自從50°C下大約2.0xSSC的低嚴格性至50°C下大約0.&SSC的高嚴格性。另外，洗滌 步驟中的溫度可以從室溫(大約22°C )的低嚴格性條件到大約65°C的高嚴格性條件。溫 度和鹽都可以變化，或者溫度或鹽濃度中任一可以保持恆定而另一變量發生改變。用於 本發明中的核酸可以在這些條件下特異性地與來自線蟲的一種或多種核酸分子或其互補 序列雜交。在特定的實施方式中，用於本發明中的核酸與序列表中SEQ IDNO : 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQID NO: 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、 SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 或 SEQ ID NO 47所示的一個或多個核酸分子或其互補序列表現出至少大約80%或至少大約90%或至少 大約95%或至少大約99%或甚至大約100%的序列同一性。本發明的核酸也可以通過本領域中已知的方法完全或部分地合成，特別是在其 中希望提供植物優先序列的情況中。因此，本發明的核酸的全部或一部分可以使用所選擇的宿主優先的 密碼子合成。物種優先密碼子可以例如選自在特定宿主物種中表達的蛋 白質中最常用的密碼子。核苷酸序列的其它修飾可以產生具有輕微改變的活性的突變 體。dsRNA或SiRNA核苷酸序列包含聚合核糖核苷酸的雙鏈且可以包括對磷酸糖骨 架或核苷的修飾。RNA結構的修飾可以進行調整以允許特定的遺傳抑制。在一個實施 方式中，dsRNA分子可以通過酶學過程修飾以使得可以產生siRNA分子。siRNA可以 在一些病原體中有效地介導一些目標基因的下調效應。這一酶學過程可以通過利用在昆 蟲、脊椎動物、真菌或植物細胞中存在的真核RNAi途徑的RNAse III酶或DICER酶完成 (Elbashir等，2001 ； Hamilton和Baulcombe，1999)。這一過程也可以利用通過本領域技 術人員很受容易理解的重組DNA技術引入目標昆蟲細胞中的重組DICER或RNAse III。 DICER酶和RNAse III (天然存在於病原體中或通過重組DNA技術製備)將較大的dsRNA 鏈切割成較小的寡核苷酸。DICER酶特異性地將dsRNA分子切割成各大約19-25核苷 酸長度的siRNA段而RNAse III酶通常將dsRNA分子切割成12-15鹼基對的siRNA。由 任一酶產生的siRNA分子具有2-3個核苷酸的3』懸端及5』磷酸和3』羥基末端。通 過RNAse III酶產生的siRNA分子與通過真核RNAi途徑中的Dicer酶產生的相同，並因 此隨後在其後續解繞、分離成單鏈RNA和與目標基因轉錄的RNA序列雜交後成為固有的 細胞RNA-降解機制的靶標並降解。這一過程導致有效降解或消除由病原體中目標基因 的核苷酸序列編碼的RNA序列。結果是病原體中特別靶向的核苷酸序列的沉默。酶學 過程的詳細說明可以在Haraion (2002)中找到。本發明的核苷酸序列可以記錄在計算機可讀介質上。如本文中所用的，「計算 機可讀介質」指可以直接被計算機閱讀和訪問的任何有形的表達介質。這類介質包括， 但不限於磁性儲存介質如軟盤、硬碟、存儲介質和磁帶；光存儲介質如CD-ROM ；電 存儲介質如RAM和ROM ；光學字符識別格式的計算機文件及這些類別的混合如磁/光 存儲介質。熟練技術人員可以很容易理解，任何目前已知的計算機可讀介質可用於產生 包含已在其上記錄本發明的核苷酸序列的計算機可讀介質的製品。如本文中所用的，「記錄」指將信息存儲在計算機可讀介質上的過程。熟練技 術人員可以很容易地採用目前已知的用於在計算機可讀介質上記錄信息的任何方法以產 生包含本發明的核苷酸序列信息的介質。多種數據存儲結構可被熟練技術人員用於產生 其上記錄有本發明的核苷酸序列的計算機可讀介質。數據存儲結構的選擇一般基於選擇 用於訪問存儲的信息的手段。另外，多種數據處理程序和格式可用於在計算機存儲介質 上存儲本發明的核苷酸序列信息。該序列信息可以表示在字處理文本文件中，在商用軟 件如WordPerfect和Microsoft Word中編排，或者以ASCII文本文件的形式表示，存儲在 資料庫應用(如DB2、Sybase、Oracle等)中。熟練技術人員可以很容易地採用多種數 據處理結構化格式(例如文本文件或資料庫)以獲得其上存儲有本發明的核苷酸序列信息 的計算機可讀介質。可公開獲得允許熟練技術人員訪問計算機可讀介質中提供的序列信息的計算機 軟體。在 Sybase 系統上執行 BLAST (Altschul 等，1990)和 BLAZE (Brutlag 等，1993)檢 索算法的軟體可用於識別序列中的開放閱讀框(ORFs)，如本文中提供的和包含與來自其 它生物體的ORF或蛋白質的同源序列的Unigenes和EST。這類ORF是本發明的序列中的蛋白質編碼片段且可用於產生具有商業重要性和蛋白質如用於胺基酸生物合成、代謝、 轉錄、翻譯、RNA加工、核酸和蛋白質降解、蛋白質修飾及DNA複製、限制、修飾、重 組和修復的酶。本發明進一步提供包含本文中描述的序列信息的系統，特別是基於計算機的系 統。這類系統設計為識別本發明的核酸分子的具有商業重要性的片段。如本文中所用 的，「基於計算機的系統」指用於分析本發明的核苷酸序列信息的硬體裝置、軟體裝置 和數據存儲裝置。本發明的基於計算機的系統的最小硬體裝置包含中央處理器(CPU)、 輸入單元、輸出單元和數據存儲單元。熟練技術人員可很容易理解，任何當前可得的基 於計算機的系統適用於本發明。如本文中所用的，「靶結構基序」或「靶基序」指任何適當選擇的序列或序列 的組合，其中該一個或多個序列基於在靶基序摺疊時形成的三維構型進行選擇。存在本 領域中已知的多種靶基序。蛋白質靶基序包括，但不限於酶活性位點和信號序列。核酸 靶基序包括，但不限於啟動子序列、順式元件、髮夾結構和誘導型表達元件(蛋白質結 合序列)。B.重組載體和宿主細胞轉化例如，重組DNA載體可以是線性的或封閉的環狀質粒。載體系統可以是單一載 體或質粒或者同時包含待引入細菌宿主的基因組中的總DNA的兩個或多個載體或質粒。 另夕卜，細菌載體可以是表達載體。例如，如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO 7、SEQID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQID NO: 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ IDNO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、 SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46 或 SEQ ID NO 47 所示的核酸分子 或其互補序列或片段可適當地插入在一種或多種微生物宿主中發揮功能以驅動所連接的 編碼序列或其它DNA序列的表達的適當啟動子控制下的載體中。許多載體可用於這一目 的，且適宜載體的選擇主要取決於待插入載體中的核酸的大小和將用該載體轉化的特定 宿主細胞。各載體包含取決於其功能(DNA的擴增或DNA的表達)和與其相容的特定宿 主細胞的各種成分。用於細菌轉化的載體成分一般包括，但不限於以下的一種或多種 信號序列、複製起點、一個或多個選擇標記基因和允許外源DNA表達的誘導型啟動子。表達和克隆載體一般包含選擇基因，也稱為選擇標記。這一基因編碼在選擇培 養基中生長的轉化宿主細胞存活或生長必需的蛋白質。典型的選擇基因編碼以下蛋白 質(a)賦予對抗生素或其它毒素(例如氨苄青黴素、新黴素、甲氨喋呤或四環素)的抗 性，(b)補充營養缺陷型缺陷或(c)供應複雜培養基不提供的關鍵營養物(例如編碼桿菌 的D-丙氨酸消旋酶的基因)。成功地用異源蛋白質或其片段轉化的那些細胞產生賦予藥 物抗性的蛋白質並因此在選擇配方中存活。 用於產生mRNA的表達載體也可以包含被宿主細菌生物體識別並與核酸可操作 地連接的誘導型啟動子。適用於細菌宿主的誘導型啟動子包括內醯胺酶啟動子、大 腸桿菌λ噬菌體PL和PR啟動子及大腸桿菌半乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、鹼性磷酸 酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子和乳糖操縱子啟動子及其變異體，以及雜合啟動子如tac 啟動子。但是，其它已知的細菌誘導型啟動子是合適的。
用於調控序列和結構核苷酸序列的術語「可操作地連接」意思是調控序列引起所連接的結構核苷酸序列的經調控的表達。「調控序列」或「控制元件」指位於結構核 苷酸序列上遊(5』非編碼序列)、之中或下遊(3』非翻譯序列)的核苷酸序列，且其影 響相關的結構核苷酸序列的轉錄、RNA加工或穩定、或翻譯的時機和水平或量。調控序 列可以包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、增強子、莖-環結構、阻遏物結合序列和 多腺苷酸化識別序列等。包含一個或多個上列成分的合適載體的構建採用標準重組DNA技術。分 離的質粒或DNA片段被切割、剪裁和重接合成產生所需要的質粒希望的形式。可 用的細菌表達載體的實例包括，但不限於多功能的大腸桿菌克隆和表達載體如 Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA)(其中例如核酸或其片段可以接合到載體中與氨基 末端Met和後續的β-半乳糖苷酶的7個殘基的序列同框從而產生雜合蛋白質)、ρΙΝ載 體(Van Heeke 和 Schuster，1989)等。本發明還包括本發明的核苷酸序列轉化到植物中以實現一種或多種dsRNA分子 的線蟲抑制性的表達水平。轉化載體可以很容易地使用本領域中可得的方法製備。轉化 載體包含能夠轉錄為RNA分子且基本上與目標線蟲基因組編碼的一種或多種核苷酸序列 同源和/或互補的一個或多個核苷酸序列，從而由該一個或多個核苷酸序列轉錄的RNA 被目標植物寄生線蟲攝取時，線蟲基因組的至少一個相應的核苷酸序列的表達下調。轉化載體可以稱為dsDNA構建體且也可以定義為重組分子、疾病控制劑、遺傳 分子或嵌合遺傳構建體。本發明的嵌合遺傳構建體可以包含例如編碼一個或多個反義轉 錄物、一個或多個有義轉錄物、一個或多個各前述的轉錄物的核苷酸序列，其中由此獲 得的轉錄物的全部或部分與包含病原體基因組內的核苷酸序列編碼的RNA序列的全部或 部分同源。在一個實施方式中，植物轉化載體包含分離和純化的DNA分子，其包含與本 發明的一個或多個核苷酸序列可操作地連接的異源啟動子。該核苷酸序列選自如序列表 中所示的 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQID NO: 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ IDNO 19、SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 46和SEQID NO 47及其互補序列。該核苷酸序列包括編碼目標線蟲 RNA轉錄物中存在的RNA的全部或部分的片段且可以包含目標線蟲RNA的全部或部分 的反向重複序列。包含表達載體的DNA分子還可以包含位於編碼序列上遊或甚至編碼序 列中的功能內含子序列，且還可以包含位於啟動子和翻譯起始點之間的五一撇(5』)未 翻譯前導序列(即，UTR或5』 -UTR)。植物轉化載體可以包含來自多於一個基因的序列，因此允許產生多於一種用於 在目標線蟲細胞中抑制兩個或多個基因的表達的dsRNA。本領域技術人員很容易理解， 其序列對應於不同基因中存在的序列的DNA的序列可組合成用於在轉基因植物中表達的 單個複合DNA片段。或者，已包含至少一個DNA片段的本發明的質粒可以通過在增強 子和啟動子或終止子序列之間順序插入另外的DNA片段進行修飾。在設計用於抑制多個 基因的本發明的疾病控制劑中，待抑制的基因可以由相同的植物寄生線蟲物種獲得以增強控制劑的效果。在某些實施方式中，基因可源自不同的植物寄生線蟲以擴展該控制劑 有效對抗的線蟲的範圍。當以多個基因作為抑制或表達和抑制的組合的目標時，多順反 子DNA元件可以如美國公開2004-0029283號中所表明和公開的製備。在不同植物物種中發揮功能的啟動子也是本領域中公知的。用於在植物中表 達多肽的啟動子包括如Odell等，(1985)所述的誘導型、病毒、合成或組成型啟動子， 和/或時間調節的、空間調節的和時間空間調節的啟動子。可以用於本發明中的啟動子 包括增強的CaMV35S啟動子和FMV35S啟動子。也可以有利地使用表現出根特異性的 CaMV35S啟動子的片段。出於本發明的目的，可能希望在植物的根組織中獲得這些基因 的最高表達水平。多種根特異性啟動子已經得到確認並且是本領域中已知的(例如美國 專利 5,110,732、5,837,848、5,459,252、Hirel 等，1992)。本發明的重組DNA載體或構建體可以包含賦予植物細胞選擇表型的選擇標記。 選擇標記也可用於選擇包含編碼本發明的多肽或蛋白質的外源核酸的植物或植物細胞。 該標記可編碼殺生劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那黴素、G418博來黴素、潮黴素等) 或滅草劑抗性(例如，草甘膦等)。選擇標記的實例包括，但不限於編碼卡那黴素抗性 且可以使用卡那黴素、G418等選擇的neo基因、編碼雙丙氨膦(bialaphos)抗性的bar基 因、編碼草甘膦抗性的突變EPSP合成酶基因、賦予對溴苯腈的抗性的腈水解酶基因、 賦予咪唑啉酮或磺醯脲抗性的 突變乙醯乳酸合成酶基因(ALS)和甲氨喋呤抗性DHFR基 因。可獲得賦予對氨苄青黴素、博來黴素、氯黴素、慶大黴素、潮黴素、卡那黴素、林 可黴素、甲氨喋呤、草胺膦、嘌呤黴素、壯觀黴素、利福平和四環素等的抗性的多重選 擇標記。這類選擇標記的實例在美國專利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047 中說明。本發明的重組載體或構建體還可以包括篩選標記。篩選標記可用於監測表 達。典型的篩選標記包括葡糖苷酸酶或編碼其各種發色底物已知的酶的UidA基因 (GUS) (Jefferson等，1987)；各種螢光蛋白質(FP)基因中的一種或多種如綠色螢光蛋白 (GFP),紅色螢光蛋白(RFP)或通常以特徵性波長發螢光的一大族蛋白質中的任一種； R-基因座(其編碼調節植物組織中花青素色素(紅色)的產生的產物MDellaporta等， 1988) ； β-內醯胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，編碼其各種發色底物已知的酶的基因(例 如，PADAC,顯色頭孢菌素)；螢光素酶基因(Ow等，1986)；編碼可轉化顯色兒茶酚 的兒茶酚加雙氧酶的xylE基因(Zukowski等，1983); α -澱粉酶基因(Ikatu等，1990); 編碼能夠將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶的酪氨酸酶基因(Katz等， 1983)，多巴醌隨之縮合成黑色素；α-半乳糖苷酶，其催化顯色α-半乳糖底物。植物轉化載體的實例包括源自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti 質粒的那些載體(例如，美國專利 4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967 和 EP O 122 791)。毛根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)質粒(或「Ri」 )也是可用的且是 本領域中已知的。其它植物轉化載體包括例如Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、 Klee (1985)和 EP 0120 516 公開的那些。一般在，可能希望將非特異性位置的功能性重組DNA引入植物基因組中。在特 殊的情況中，通過位點特異性整合插入重組DNA構建體可能是有用的。已知在植物中發 揮功能的現有的幾種位點特異性重組系統包括美國專利4,959,317中公開的cre-lox和美國專利5,527,695中公開的FLP-FRT。
據相信，用於本發明的合適的宿主細胞轉化方法實際上包括可以將DNA引 入細胞中的任何方法(參見，例如Miki等，1993)，如通過原生質體的轉化(美國專 利 No.5,508,184 ； Omirulleh 等，1993)、通過脫水 / 抑制介導的 DNA 攝取(Potrykus 等，1985)、通過電穿孔(美國專利5,384,253)、通過用碳化矽纖維攪拌(Kaeppler等， 1990 ；美國專利5,302,523和美國專利No.5,464,765)、通過土壤桿菌介導的轉化(美國 專利 5,563,055 ； 5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840、6,384,301)和通過 DNA 塗覆顆粒的加速(美國專利 5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、 6,403,865 ； Padgette等，1995)等。通過應用如這些的技術，實際上任何物種的細胞可以 穩定地轉化。在多細胞物種的情況中，轉基因細胞可以再生為轉基因生物體。最廣泛使用的將表達載體引入植物中的方法是基於土壤桿菌的天然轉化系統 (例如，Horsch等，1985)。根癌土壤桿菌和毛根土壤桿菌是遺傳轉化植物細胞的植物病 原性土壤細菌。根癌土壤桿菌和毛根土壤桿菌的Ti和Ri質粒分別攜帶負責植物的遺傳 轉化的基因。用於土壤桿菌介導的基因轉移的土壤桿菌載體系統和方法的由多種參考文 獻提供，包括 Gruber 等，1993、Miki 等，1993、Moloney 等，1989 和美國專利 4,940,838 和5,464,763。其它天然地與植物相互作用的細菌如中華根瘤菌(Sinorhizobium)、根瘤菌 (Rhizobium)和中生根瘤菌(Mesorhizobium)可以修飾以介導對許多不同的植物的基因轉 移。這些植物相關的共生細菌可使得通過獲得去武裝的Ti質粒和適宜的雙運載體(binary vector)而處於基因轉移的感受態(Broothaerts等，2005)。用於產生轉基因植物和特別是在植物中表達異源核酸的方法是已知的且可以用 於本文提供的核酸以製備表現出對目標線蟲攝食的較低易感性。例如，植物轉化載體可 以通過將本文公開的產生dsRNA的核酸插入植物轉化載體中並將其引入植物中製備。一 種已知的載體系統已通過改良根癌土壤桿菌的天然基因轉移系統得到。該天然系統包含 含有稱為T-DNA的大片段的大Ti (腫瘤誘導)_質粒，其被轉移到轉化的植物。Ti質粒 的另一片段，vir區域，負責T-DNA轉移。T-DNA區域以末端重複序列為邊界。在改 良的雙運載體中，腫瘤誘導的基因已被刪除且vir區域的功能用於轉移以T-DNA邊界序 列為邊界的外源DNA。T-區域也可以包含用於有效回收轉基因植物和細胞的選擇標記及 用於插入轉移序列(如編碼dsRNA的核酸)的多克隆位點。使用土壤桿菌轉化方法形成的轉基因植物通常可能包含插入一個染色體中的單 一的簡單重組DNA序列，稱為轉基因事件。這類轉基因植物可稱為對於插入的外源序列 為雜合的。對於轉基因純合的轉基因植物可以通過使包含單一外源基因序列的獨立隔離 轉基因植物(例如Ftl植物)與其自身有性交配(自交)以產生F1種子而獲得。所產生的 F1種子的四分之一將是對於轉基因純合的。萌發F1種子產生可以測試雜合性的植物，通 亮使用SNP分析或使得能夠區分雜合子和純合子的熱擴增分析(即，接合性分析)。將 雜合植物與其自身或另一雜合植物雜交產生雜合後代以及純合轉基因和純合空白後代。C.核酸表達和目標基因抑制舉例來說，本發明提供了病原性目標生物體的轉化的宿主植物、轉化的植物細 胞及它們的後代。轉化的植物細胞和轉化的植物可以進行生物工程以表達本文中所述的 一種或多種在異源啟動子控制下的dsRNA或siRNA序列，從而提供病原體防治效果。這些序列可以用於病原體中的基因抑制，從而在所保護的轉化宿主生物體上降低病原體引 起的疾病的水平和發病率。如本文中所用的，詞語「基因抑制」意圖指任何公知的用於 降低由於基因轉錄為mRNA和隨後mRNA的翻譯而產生的蛋白質的水平的方法。 基因抑制也意指降低基因或編碼序列的蛋白質表達，包括轉錄後基因抑制和轉 錄抑制。轉錄後基因抑制是通過由作為抑制的基因或編碼序列轉錄的mRNA的全部或部 分和用於抑制的相應的雙鏈RNA之間的同源性介導的，並且指實質和可測量地減少用於 核糖體結合的細胞中可得的可利用mRNA量或阻止核糖體的翻譯。轉錄的RNA可以是 沿有義方向產生dsRNA以實現所謂的共抑制，沿反義方向產生dsRNA以實現所謂的反義 抑制或沿兩個方面產生dsRNA以實現所謂的RNA幹擾(RNAi)。轉錄抑制是通過在細胞中存在表現出與啟動子DNA序列或其互補序列的基本序 列同一性的dsRNA基因抑制劑以實現所謂的啟動子反式抑制而介導的。基因抑制可以有 效對抗與性狀相關的原始植物基因以例如產生具有降低的該原始基因編碼的蛋白質的水 平或具有增高的或降低的感染代謝物的水平的植物。基因抑制也可以有效對抗攝食或接 觸含有基因抑制劑的植物材料的植物寄生線蟲中的目標基因，該基因抑制劑特別設計為 阻止或抑制線蟲細胞中一種或多種同源或互補序列的表達。通過反義或有義定向的RNA 的轉錄後基因抑制調節植物細胞中的基因表達公開於美國專利5,107,065、5,759,829、 5,283,184和5,231,020中。dsRNA用於抑制植物中的基因的用途公開於WO 99/53050、 W099/49029、美國公開2003/017596、美國專利申請公開2004/0029283中。對植物寄生線蟲的轉錄後基因抑制的有益方法採用有義定向和反義定向的，轉 錄的RNA其是例如作為髮夾或者莖和環結構穩定的。用於實現轉錄後基因抑制的DNA構 建體的實例是其中第一片段編碼表現出與作為抑制目標的基因的片段的基本同一性的、 表現為反義定向的RNA，該第一片段連接到編碼表現出與第一片段的基本互補性的RNA 的第二片段上。這種構建體通過第一片段與第二片段的雜交形成莖和環結構及由連接該 兩個片段的核苷酸序列形成環結構(參見W094/01550、W098/05770、US 2002/0048814 和US 2003/0018993)。也可以採用與另外的目標基因片段的共表達，如上所述(例如， W005/019408)。按照本發明的一個實施方式，提供了其體外表達導致轉錄與植物寄生線蟲中目 標基因的RNA分子基本同源的穩定RNA序列的核苷酸序列，該目標基因的RNA分子包 含線蟲基因組中的核苷酸序列編碼的RNA序列。因此，在植物寄生的線蟲攝食該穩定的 RNA序列後，實現了目標線蟲細胞中對應於目標基因的核苷酸序列的下調。在本發明的特定實施方式中，可以利用SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQID NO 13、 SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 46 或 SEQ ID NO 47 中 任一核酸序列或其互補序列的至少21個連續核苷酸的片段的表達，包括最多21、36、 60、100、550或1000個連續核苷酸的片段或表現出與這些序列的90-100%的同一性的 序列或其互補序列的表達。在特定的實施方式中，本發明提供的核苷酸可以包含選自表 4中所述的序列，包括如表4中所述的序列跨越核苷酸(sequencespanning nucleotide)上的位置。在再另外的實施方式中，本發明提供的核苷酸可以描述為包含SEQ ID NO:
I、SEQID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO
II、SEQID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27 至 SEQ ID NO 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO: 46 或 SEQ ID NO: 47 中一個或多個的核苷酸 1-21、22-50、51-100、101-150、 151-200、 201-250、 251-300、 301-350、 351-400、 401-450、 451-500、 501-550、 551-600、 601-650、 651-700、 701-750、 751-800、 801-850、 851-900、 901-950、 951-1000、 1001-1050、 1051-1100、 1101-1150、 1151-1200、 1201-1250、 1251-1300、 1301-1350、 1351-1400、 1401-1450、 1451-1500、 1501-1550、 1551-1600、 1601-1650、 1651-1700、 1701-1750、 1751-1800、 1801-1850、 1851-1900、 1901-1950、 1951-2000、 2001-2050、 2051-2100、 23-75、 76-125、 126-175、 176-225、 226-275、 276-325、 326-375、 376-425、 426-475、 476-525、 526-575、 576-625、 626-675、 676-725、 726-775、 776-825、 826-875、 876-925、 926-975、 976-1025、 1026-1075、 1076-1125、 1126-1175、 1176-1225、 1226-1275、 1276-1325、 1326-1375、 1376-1425、 1426-1475、 1476-1525、 1526-1575、 1576-1625、 1626-1675、 1676-1725、 1726-1775、 1776-1825、 1826-1875、 1876-1925、 1926-1975、 1976-2025、 2026-2075、 2076-2125、 1-550、 200-750、 300-850、 400-950、 500-1050、 600-1150、 700-1250、 800-1350、 900-1450、 1000-1550、1100-1650、1200-1750、1300-1850、1400-1950、1500-2050 直至該序列的 全長中一個或多個。用於選擇特定的亞序列作為SiRNA介導的基因抑制的靶標的方法是 本領域中已知的(例如，Reynolds等，2004)。 使用本發明的穩定dsRNA技術抑制目標基因是序列特異性的，因為對應於RNA 的雙鏈區域的核苷酸序列作為基因抑制的靶標。包含與目標基因轉錄物的一部分相同的 核苷酸序列的RNA在某些實施方式中可能對於抑制是有益的。具有相對於目標序列的插 入、缺失和單點突變的RNA序列也已發現對於抑制是有效的。在進行本發明的特定實施 方式中，抑制性dsRNA和目標基因的部分可以共有至少大約80%的序列同一性，或大約 90%的序列同一性，或大約95%的序列同一性，或大約99%的序列同一性，或甚至大約 100%的序列同一性。或者，RNA的雙鏈區域可以功能性地定義為能夠與目標基因轉錄 物的一部分雜交的核苷酸序列。表現出更高同源性的不到全長的序列補償了較長的低同 源性序列。相同核苷酸序列的長度可以是至少大約25、50、100、200、300、400、500 或至少大約1000鹼基。正常地，長於20-100核苷酸的序列可能是希望的，儘管取決於 目標基因的大小，長於大約200-300核苷酸的序列和長於大約500-1000核苷酸的序列可 能特別地提供某些益處。在一個實施方式中，本發明具有能夠耐受可預計由遺傳突變、 株多態性或進化趨異產生的序列變異的優勢。引入的核酸分子可能不需要與目標序列絕 對同源，且可能不需要相對於目標基因的初級轉錄產物或完全加工的mRNA的全長。因 此，本領域技術人員可以理解，如本文中所公開的，實施本發明不需要RNA和目標基因 之間的100%序列同一性。目標基因表達的抑制可以通過測量內源目標RNA或由目標RNA的翻譯產生的蛋 白質定量，且抑制的結果可以通過檢驗細胞或生物體的外向特性確認。定量RNA和蛋白質的技術是本領域技術人員公知的。在某些實施方式中，基因表達抑制至少10%，至少33%，至少50%或至少 80%。在本發明的進一步的實施方式中，基因表達在病原體的細胞內抑制至少80%，至 少90%，至少95%或至少99%，從而發生顯著的抑制。顯著抑制意思是指產生可檢測表 型(例如，生長中止、覓食、發育、繁殖降低、死亡等)的充分抑制或對應於所抑制的目 標基因的RNA和/或蛋白質的可檢測的減少。雖然在本發明的特定實施方式中，抑制在 植物寄生線蟲的基本上所有細胞中發生，在其它實施方式中，抑制僅在表達該基因的細 胞亞群中發生。dsRNA分子可以在體內或體外合成。dsRNA可以通過單個自身互補RNA鏈或 由兩個互補RNA鏈形成。細胞的內源RNA聚合酶可以介導體內轉錄或克隆的RNA聚合 酶可用於體內或體外轉錄。抑制可以靶向於器官、組織或細胞類型中的特異性轉錄、環 境條件(例如，感染、應激、溫度、化學誘導劑)的刺激和/或發育階段或時期的工程轉 錄。RNA鏈可以進行或不進行多腺苷酸化，RNA鏈能夠或不能夠被細胞的翻譯器官翻譯 成多肽。本發明的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA可以由本領域技術人員通過人工或
自動反應化學地或酶學地產生或者在另一生物體中體內產生。RNA也可以通過部分或完 全有 機合成產生；任何修飾的核糖核苷酸可以通過體外酶學或有機合成引入。RNA可 以通過細胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)合成。表達構 建體的用途和產生是本領域已知的(參見，例如，WO 97/32016、美國專利5,593,874、 5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。 如果化學合成或通過體外酶學合成， RNA可以在引入細胞之前純化。例如，RNA可以通過溶劑或樹脂的提取、沉澱、電泳、 色譜或其組合由混合物純化。或者，RNA可以無純化或最小純化使用以避免由於樣品處 理導致的損失。RNA可以乾燥用於存儲或溶解於水溶液中。溶液可以包含緩衝液或鹽 以促進退火和/或雙鏈的穩定。對於體內轉基因或表達構建體的轉錄，調控區域(例如，啟動子、增強子、沉 默子(silencer)和多腺苷酸化)可用於轉錄RNA鏈(或多條鏈)。因此，在一個實施方 式中，用於產生RNA分子的核苷酸序列可以可操作地連接在微生物、真菌或植物宿主細 胞中發揮功能的一個或多個啟動子。理想地，核苷酸序列置於通常存在於宿主基因組中 的內源啟動子的控制下。在可操作地連接的啟動子序列的控制下的本發明的核苷酸序列 可以進一步側鄰有利地影響其轉錄和/或所獲得的轉錄物的穩定性的其它序列。這類序 列一般位於可操作地連接的啟動子的上遊和/或表達構建體3』末端的下遊，且可以同時 存在於啟動子的上遊和表達構建體3』末端的下遊，雖然也包括僅這種上遊序列。如本文中所用的，術語「疾病控制劑」或「基因抑制劑」指由第三RNA片段連 接的第一 RNA片段和第二 RNA序列組成的特定RNA分子。第一和第二 RNA片段存在 於RNA分子的長度內且為彼此的基本反向重複序列和通過第三片段連接到一起。第一和 第二 RNA片段之間的互補性產生該兩個片段在體內和體外雜交以形成在各第一和第二片 段的一個末端由第三片段(其形成環)連接在一起的雙鏈分子(即莖)的能力，從而整個 結構形成莖和環結構，或甚至更緊密雜交的結構可以形成莖-環的節結構。第一和第二 片段總是(但不是必然分別地)對應於與在意圖通過攝取dsRNA分子抑制的目標病原體中由目標基因轉錄的目標RNA同源的有義和反義序列。控制劑也可以是基本純化(或分 離)的核酸分子且更特別地來自於基因組DNA(gDNA)或cDNA文庫的核酸分子或其核酸 片段分子。或者，片段可以包含具有大約15-大約250個核苷酸殘基和包括大約15-大 約30個核苷酸殘基的較小的寡核苷酸。
如本文中所用的，術語「基因組」在用於植物寄生線蟲的細胞或宿主時不僅包 括細胞核中發現的染色體DNA還包括在細胞的亞細胞成分中發現的細胞器DNA。因此 引入植物細胞中的本發明的DNA可以進行染色體整合或定位於細胞器中。術語「基因 組」在應用於細菌時包括細菌宿主細胞內的染色體和質粒。因此引入細菌宿主細胞中的 本發明的DNA可以進行染色體整合或定位於細胞器中。
如本文中所用的，術語「植物寄生線蟲」指可以在經轉化以表達雙鏈基因抑制 劑或塗覆雙鏈基因抑制劑的宿主植物材料上感染、移殖、寄生或引起疾病的那些線蟲。 如本文中所用的，「線蟲抗性」性狀是引起轉基因植物、轉基因動物或其它轉基因宿主 抵抗通常能夠對宿主造成損害或損失的線蟲攻擊的宿主特性。這種抗性可由天然突變或 更典型地由引入賦予植物寄生線蟲抗性的重組DNA產生。為向轉基因植物施加線蟲抗 性，重組DNA例如可以轉錄成在重組植物的組織或流體內形成dsRNA分子的RNA分 子。dsRNA分子部分地由與植物寄生線蟲內的DNA序列編碼的相應RNA片段相同的 RNA的片段構成，該植物寄生線蟲可引起宿主植物的疾病。目標植物寄生線蟲內基因的 表達受到dsRNA的抑制，且目標植物寄生線蟲內基因表達的抑制產生對線蟲具有抗性的 植物。
dsRNA的調節效應可應用於在植物寄生線蟲中表達的多種基因，包括例如負責 細胞代謝或細胞轉化的內源基因，包括管家基因、轉錄因子、蛻皮相關基因和編碼參與 細胞代謝或正常生長和發育的多肽的其它基因。
如本文中所用的，短語「基因表達的抑制」或「抑制植物寄生線蟲細胞中目標 基因的表達」指源自目標基因的蛋白質和/或mRNA產物的不存在(或其水平的可觀察 的降低)。特異性指抑制目標基因而沒有對產生該dsRNA分子的細胞的其它基因的直接 效應和沒有對細胞內的任何基因的任何直接效應的能力。目標植物寄生線蟲中目標內基 因的基因表達的抑制可以在線蟲中產生新的表型性狀。
本發明部分地提供用於通過攝食宿主細胞或細胞的內容物遞送線蟲控制劑的遞 送系統。按照另一實施方式，本發明包括產生包含轉錄本發明的穩定dsRNA分子的重組 DNA構建體的植物細胞或植物。如本文中所用的，「攝取」指試劑與目標生物體(如線 蟲)的細胞形成接觸的過程。這可以例如通過線蟲覓食、通過吮吸或通過注入發生。如 本文中所用的，短語「產生轉基因植物細胞或植物」指採用本領域中很容易得到的重組 DNA技術(例如，Sambrook等，1989)構建轉錄本發明的穩定dsRNA分子的植物轉化載 體的方法，從而轉化植物細胞或植物和產生包含轉錄的、穩定的dsRNA分子的轉基因植 物細胞或轉基因植物。
可預想的是，本發明的組合物可作為整合到植物細胞基因組中的重組基因的表 達產物或通過併入在播種前塗覆到種子上的塗層或種子處理劑中而併入植物物種的種子 中。包含重組基因的植物細胞在本文中被認為是轉基因事件。
本發明部分地提供用於向植物寄生的線蟲遞送疾病控制劑的遞送系統。本發明的穩定dsRNA或SiRNA分子可以直接引入植物寄生線蟲的細胞中。用於引入的方法可以 包括RNA與用於植物寄生線蟲的宿主組織直接混合以及其中作為宿主的物種經遺傳工程 以表達dsRNA或siRNA的遺傳工程途徑。在一個實施方式中，RNA可以噴射到植物表 面上。在再另一實施方式中，dsRNA或siRNA可以由微生物表達且微生物可以應用到植 物表面上或通過物理手段(如注射)引入根、莖中。在再另一實施方式中，植物可以進 行遺傳工程以表達足以殺滅已知侵染植物的植物寄生線蟲的量的dsRNA或siRNA。
也可以預想，通過化學或酶學合成產生的dsRNA可以以與常見農業實踐協調的 方式配製且用作用於防治植物疾病的噴塗產品。該製劑可以包括有效葉覆蓋所需的適當 的粘著劑(sticker)和溼潤劑以及保護dsRNA免受UV損傷的UV保護劑。這類添加劑是 生物殺蟲劑工業中通常使用的且是本領域技術人員公知的。這些應用可以與其它噴塗殺 蟲劑應用(基於生物或不基於生物)以增強植物寄生線蟲的植物保護。
本發明還涉及用於在微生物中表達的重組DNA構建體。外源核酸(目標RNA由 其轉錄)可以使用本領域已知的方法引入微生物宿主細胞中，如細菌細胞或真菌細胞。
本發明的核苷酸序列可以引入很多種的原核和真核微生物宿主中以產生穩定 的dsRNA或siRNA分子。術語「微生物」包括原核和真核物種如細胞和真菌以及線 蟲。真菌包括酵母和絲狀真菌等。例證的原核生物(革蘭氏陰性的和革蘭氏陽性的) 包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia) 和沙雷氏菌屬Merratia)；芽胞桿菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)如根瘤 菌屬(Rhizobium)；螺菌科Mpirillaceae)如發光菌屬(photobacterium)、酵單胞菌屬 (Zymomonas)；乳桿菌科(Lactobacillaceae)；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)如假單胞 菌屬(Pseudomonas)和醋酸桿菌屬(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae),放線菌 目(Actinomycetales)和硝化桿菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物中包括真菌如藻狀菌綱 (Phycomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)，包括酵母屬Maccharomyces)和裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)，和擔子菌綱(Basidiomycetes)如紅酵母屬(Rhodotorala)、短梗黴 屬(Aureobasidium)等。
D.轉基因植物和細胞
毛根特徵在於快速生長、頻繁分枝、斜生現象。毛根用作全根的強模型(Strang model),因為它們保持類似於完整植物的根合成化合物的能力(David等，1984)。已很 好地建立了用於轉移和整合位於毛根土壤桿菌的根誘導質粒Ri上的基因到植物基因組中 及其用於在其中的表達的方法(White和Nester，1980)。這些類型的根在不含激素的培 養基在體外繼續生長且還表現出高水平的遺傳穩定性(Aird等，1988)。土壤細菌毛根土 壤桿菌將基因轉化到宿主植物基因組中的天然能力導致根在感染位點形成，且用於產生 毛根培養物。用毛根土壤桿菌菌株R-1000感染植物導致T-DNA整合到植物基因組中和 表達，這引起毛根的發育。毛根培養物快速生長，顯示斜生的根生長且在無激素的培養 基上高度分枝。由毛根土壤桿菌誘導的轉基因毛根在體外支持根結線蟲(「RKN」 ；根 結線蟲類)的完整生活周期，並允許大規模的組織快速生長，這可用於鑑別和分離目標 基因。毛根如下面所述且按照本領域中的知識由大豆或西紅柿植物開始。
本發明提供具有一個或多個轉基因事件的種子和植物。事件的組合稱作「堆疊 的(stacked) 」轉基因事件。這些堆疊的轉基因事件可以是針對相同目標生物體的事件，或者它們可以針對不同目標病原體或害蟲。在一個實施方式中，具有表達本文提供的核 酸的能力的種子也具有表達至少一種其它物質的能力，包括但不限於其序列源自於目標 病原體(如線蟲)中表達的RNA序列且在種子或由該種子生長的植物細胞中表達時形 成雙鏈RNA結構的RNA分子，其中一個或多個植物細胞被目標攝食導致目標的細胞中 RNA表達的抑制。
在某些實施方式中，具有表達其序列源自目標植物寄生線蟲的dsRNA的能力也 具有提供除草劑耐受性的「堆疊的」轉基因事件。除草劑耐受性基因的一個有益的實例 提供對草甘膦(N-(膦醯基甲基)氨基乙酸)的抗性，包括這種除草劑的異丙胺鹽形式。
本發明提供的益處可以包括，但不限於將dsRNA引入植物寄生線蟲細胞中的 方便性、可使用的dsRNA的低濃度、dsRNA的穩定性和抑制的有效性。使用低濃度的 穩定dsRNA的能力避免了反義幹擾的幾種缺陷。本發明不限於體外用途或特定的序列組 成，不限於特定系列的目標基因、目標基因的核苷酸序列的特定部分或特定轉基因，或 不限於特定的遞送方法，這與某些本領域中已知的可用技術(如反義和共抑制)相反。此 外，在不是經典遺傳模型的生物體中進行遺傳操作是可能的。
為了實現希望防治的植物寄生線蟲物種內的目標基因的物性抑制，目標基因應 通常表現出與植物或脊椎動物中的相應基因的低水平的序列同一性。在特定的實施方式 中，序列同一性的水平低於大約80%，包括低於大約70%和低於大約60%。
除了用重組DNA構建體直接轉化植物外，轉基因植物可通過使具有重組DNA 構建體的第一植物與缺乏該構建體的第二植物雜交。例如，用於基因抑制的重組DNA可 引入需轉化的第一植物家系以產生可與第二植物家系雜交的轉基因植物，從而將用於基 因抑制的重組DNA滲入第二植物家系中。
實際上，本發明可以與植物中的其它疾病防治性狀組合以獲得希望的用於增強 植物疾病防治的性狀。採用完全不同的作用模式的組合疾病防治性狀可以提供具有優於 攜帶單一防治性狀的植物的保護轉基因植物的耐久性，因為其在田間發展出抗性的可能 性降低。
本發明還涉及包含本發明的一種或多種序列的商品，且特別地包括包含本發明 的一種或多種核苷酸序列的重組植物或種子產生的商品作為本發明的實施方式。包含本 發明的一種或多種序列的商品意圖包括，但不限於包含本發明的一種或多種序列的重組 植物或種子的粗磨粉、油或磨碎的或完整的穀粒。在本文中包括的一種或多種貨物或 商品中本發明的一種或多種序列的檢測是該貨物或商品由設計為為了使用dsRNA介導的 基因抑制方法防治植物疾病的目的而表達本發明的一種或多種核苷酸序列轉基因植物組 成。
E.獲得核酸
本發明提供了用於獲得包含產生dsRNA或SiRNA的核苷酸序列的核酸的方法。 在一個實施方式中，這種方法包括(a)分析在線蟲中的dsRNA介導的基因抑制時一種 或多種目標基因的表達、功能和表型；(b)用包含來自目標線蟲的核苷酸序列或其同源 序列的全部或部分的雜交探針探測cDNA或gDNA文庫，該目標線蟲在dsRNA介導的抑 制分析中表現出改變的(例如，降低的)線蟲生長、發育或繁殖表型；(C)鑑別與該雜交 探針雜交的DNA克隆；(d)分離在步驟(b)中鑑別的DNA克隆；和(e)測序包含步驟(d)中分離的克隆的cDNA或gDNA片段，其中測序的核酸分子轉錄RNA核苷酸序列或 其同源序列的全部或主要部分。
在另一實施方式中，本發明的用於獲得包含產生dsRNA或SiRNA的主要部分的 核苷酸序列的核酸序列的方法包括(a)合成對應於來自目標病原體的一種核苷酸序列 的一部分的第一和第二寡核苷酸引物；和(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物 擴增存在於克隆載體中的cDNA或gDNA插入序列，其中擴增的核酸分子轉錄本發明的 dsRNA或siRNA的主要部分。
在實施本發明時，目標基因可以源自南方根結線蟲或另一線蟲。可預想的是， 可採用幾種標準選擇目標基因。根結線蟲類基因可以是具有秀麗隱杆線蟲同源基因的基 因，在表達的RNAi敲落時具有強表型(如PO表型)的高可能性。這些目標通常是參與 核心細胞過程(如DNA複製、細胞周期、轉錄、RNA加工、翻譯、蛋白質運輸、分泌、 蛋白質修飾、蛋白質穩定和降解、能量產生、中間代謝、細胞結構、信號轉導、通道和 轉動蛋白及內吞作用)蛋白質產物的那些目標基因。在某些實施方式中，有利的是選擇 其表達水平小的下降會導致對病原體的不利影響的基因。特別感興趣的是具有其它墊刃 線蟲(例如，大豆胞囊線蟲)中的RNAi驗證直系同源基因的根結線蟲基因。
如本文中所用的，術語「源自」指可以從特別指定的來源或物種獲得的指定的 核苷酸序列，儘管不是必然直接得自該指定的來源或物種。
在一個實施方式中，選擇實質上參與植物寄生線蟲的生長、發育或繁殖的基 因。用於本發明中的其它目標基因可以包括例如，在線蟲存活、生長、發育、感染和建 立覓食位點中發揮重要作用的那些基因。這些目標基因可以是管家基因、轉錄基因等之 一。另外，用於本發明中的核苷酸序列也可以源自植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源 基因(包括直系同源基因)，其功能已經由文獻確定和其核苷酸序列與目標線蟲基因組的 目標基因共有實質的相似性。按照本發明的用於線蟲防治的一個方面，目標序列可以基 本源自目標植物寄生線蟲。一些克隆自線蟲的典型目標序列(其編碼作為已知蛋白質的 同源物或直系同源物的蛋白質或其片段)可以在序列表中找到，例如在SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO 3、SEQID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、 SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 23 和 SEQ IDNO 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 44、SEQ ID NO 46 和 SEQ IDNO 47 中。
出於本發明的目的，dsRNA或siRNA分子可以通過源自gDNA或cDNA文庫或其部分的目標基因序列的聚合酶鏈(PCR)擴增獲得。DNA文庫可以使用本領域技術人 員已知的方法製備，且可以提取DNA/RNA。由目標生物體產生的基因組DNA或cDNA 文庫可以用於產生dsRNA或siRNA的PCR擴增。
然後，目標基因序列可以進行PCR擴增並使用本領域中容易獲得的方法測序。 本領域技術人員也許能夠改變PCR條件以確保最佳的PCR產物形成。確認的PCR產物 可用作體外轉錄的模板以利用包括的最小啟動子產生有義和反義RNA。在一個實施方式 中，本發明包含可用作植物寄生線蟲防治劑的分離和純化的核苷酸序列。分離和純化的 核苷酸序列可以包含如序列表中所示的那些核苷酸序列。
如本文中所用的，短語「編碼序列」、「結構核苷酸序列」或「結構核酸分 子」指當置於適當的調控序列控制下翻譯成多肽(通常通過mRNA)的核苷酸序列。編 碼序列的邊界通過5』末端的翻譯起始密碼子和3』末端的翻譯終止密碼子確定。編碼 序列可以包括，但不限於基因組DNA、cDNA、EST和重組核苷酸序列。
術語「重組DNA」或「重組核苷酸序列」指包含通過經由誘變、限制性酶等的 操作的遺傳工程修飾的DNA。
對於作為本發明防治的潛在靶標的許多植物寄生的線蟲，可能存在有關大多數 基因的序列或由特定基因的突變產生的表型的有限信息。因此，可以預想，選擇用於本 發明中的適當基因可以通過使用由模型生物體(如秀麗隱杆線蟲)中的相應基因的研究提 供的信息完成，其中該基因已經按照實施例1-8所述的分析方法鑑定。在某些情況中， 有可能通過利用基因的名稱或來自例如該基因由其克隆的線蟲的序列檢索資料庫(如 GenBank)而獲得來自目標線蟲的相應基因的序列。一旦獲得了序列，PCR可以用於擴增 用於本發明的目標線蟲中基因的適當選擇的片段。PCR引物可以基於在該基因由其克隆 的另一生物體中發現的序列進行設計。該引物設計為擴增用於本發明中的足夠長的DNA 片段。DNA(基因組DNA或cDNA)從目標植物寄生線蟲製備，且PCR引物用於擴增該 DNA片段。選擇擴增條件以使得擴增甚至在引物未精確匹配目標序列的情況下發生。或 者，基因(或其部分)可以使用已知基因作為探針從由植物寄生線蟲物種製備的gDNA或 cDNA文庫克隆。用於進行PCR和由文庫進行克隆的技術是已知的。在實施例中提供了 來自目標植物寄生線蟲的DNA片段可以基於預先由其它物種克隆的基因序列分離的方法 的進一步細節。本領域技術人員可認識到，多種技術可用於分離與預先由其它物種分離 的基因對應的來自目標植物寄生線蟲的基因片段。
實施例
本發明人在此確定了用於通過向植物寄生的線蟲提供雙鏈核糖核酸分子防治植 物寄生線蟲的方法和選擇編碼這些雙鏈核糖核酸分子的序列的方法。在攝食時發揮作用 以抑制線蟲中的生物功能的雙鏈核糖核酸分子可以例如導致以下的一種或多種特性線 蟲生長的下降、線蟲發育的抑制或者生存力或卵產生的下降。這些特性的任一種或任意 組合可導致有效抑制植物感染或移殖，且在植物病原線蟲的情況中，導致植物疾病的抑 制和/或疾病症狀嚴重性的降低。
實施例1
毛根產生方案
對於大豆A3244(易感的)或PI88788(抗性的)毛根，毛根土壤桿菌菌株 K599 (NCPPB 2659 ； NCPPB, SandHutton, York, UK)在 LB (Luria Bertani)或酵母提取 物和蛋白腖(YEP)培養基上生長和維持。酵母提取物是自溶的酵母的水溶性部分。自 溶小心地進行控制以保持天然存在的B複合維生素。酵母提取物通常通過在富含碳水化 合物的植物培養基中生長麵包酵母(baker』 s yeast)(酵母屬的種)製備。酵母在水中收 獲、洗滌和重懸浮，酵母在其中發生自溶，即利用酵母的酶自體消化。酵母提取物是這 一自溶作用的全部可溶部分。自溶活性通過加熱步驟終止。所獲得的酵母提取物過濾透 明並通過噴霧乾燥乾燥成粉末。使用毛根土壤桿菌菌株Dl產生轉基因西紅柿Mountain Spring (易感的)或Fresh Mountain Plus (抗性的)毛根培養物的方法是相似的，除了使用包含酵母提取物、NaCL胰蛋白腖、L-穀氨酸、磷酸鉀、硫酸鎂和生物素的MgL培養 基外。大豆種子通過在受控條件下接觸氯氣12-16小時進行表面消毒，接著在清潔空氣 罩中通氣至少30分鐘。種子在含有l/4MS(Murashige& Skoog，1962)的皮氏培養皿中 發芽。6天齡幼苗的胚軸或子葉使用手術刀切割，且切割的子葉隨後浸入新生長的含目 標DNA構建體的毛根土壤桿菌培養物中並真空滲透。子葉在用於種子發芽的相似條件 下培養，除了抗生素頭孢噻肟加入到1/4MS瓊脂培養板中以防止毛根土壤桿菌隨後生長 過度。不定根與用毛根土壤桿菌接種的胚軸或子葉切開。假定轉化的根在包含3%蔗糖 +3g/l Gelrite ，BASTA 和頭孢噻肟的 Gamborg' s B-5 瓊脂(Gamborg 等，1976)上培 養。通過選擇存活的根轉移到新鮮培養基中並保持在無光、大約M_30°C的溫度下在培養 箱中的Gamborg' sB_5瓊脂上。通常每2_4周切割一段根尖並轉移到新鮮培養基中。
實施例2
毛根材料上的線蟲生物分析
在選擇毛根系後，用於植物線蟲生物分析的根轉移到含Gamborg' sB-5培養基 的新鮮培養基板上並使其生長大約兩周以在用根結線蟲(RKN)的第二階段幼蟲接種之前 提供用於線蟲感染的充足組織。單個的毛根尖置於感染板上。通常，大約20個板用於 轉化的根與SCN或RKN反應的病原性測試。各板包含來自單獨整合的轉化根。包含轉 化的(空載體)SCN-易感或RKN-易感的對照的另外20個板和包含轉化的SCN-抗性或 RKN-抗性對照的另外20個板包括在測試中。所採用的方案主要是Narayanan等，1999 的方案，具有小的改進。板用大約450滅菌南方根結線蟲Ds接種並在沈-281孵育。在 用南方根結線蟲接種後大約兩周，感染的大豆毛根從瓊脂板移除並計數蟲癭的數目。蟲 癭評分參照如下的評定標準基於對大小的評估進行評定最小的蟲癭得分為1，且隨著 蟲癭面積變得更大，蟲癭評分提高。蟲癭評定標準的實例如圖2中所示。然後1-4的標 度用於評定試驗中各板上的各蟲癭。
也在42天針對西紅柿毛根中的RKN感染對卵數目評分(例如，參見表4)。在 感染後42天，板進行微波處理並過篩以收集根。然後根在10%漂白溶液中混合併傾到一 系列篩上以去除根碎片並收集卵。從各板去除卵並計數，且根進行稱重。
製備滅菌的SCN和RKN幼蟲以用於毛根培養系統。滅菌SCNJ2如下產生收 集清潔的大豆胞囊線蟲卵(即除去土壤和其它碎片的卵)並置於包含30ml的10%漂白溶 液的50ml離心管中。漂白溶液溫和攪拌並然後使其沉降2-3分鐘。該管再次溫和攪拌 以重懸浮卵並然後以IOOOrpm離心1分鐘。在無菌罩下，漂白溶液移入容器中，且25ml 的無菌水加入卵管中。該管在無菌罩下重新加蓋，溫和攪拌以重懸浮卵和以IOOOrpm離 心1分鐘。在無菌罩下，將這一液體傾出且再將25ml的無菌水置於管中。該管在無菌 罩下重新加蓋，並重複攪拌和離心過程。用無菌水洗滌卵的這一過程重複大約4次以將 漂白劑從卵徹底漂洗掉。在無菌罩下最後漂洗之後，除去液體以遺留大約l_2ml的卵濃 縮物。滅菌卵通過在靜置在5mM硫酸鋅溶液中深度恰覆蓋濾紙表面的潮溼濾紙上孵育卵 而進行孵化。在2-3天後，J2幼蟲收集在濾紙下的溶液中。J2幼蟲進行離心並進一步 使用洗必泰滅菌(Atkinson等，1996)。
滅菌RKN幼蟲通過將切碎的RKN感染的根置於具有足夠量的10%漂白溶液的 攪拌機中收集卵而製備。攪拌機以5秒間隔開關。這一過程重複5-8次。然後根漿通過一系列篩，其中卵和小碎片收集在500微米篩中。將任何殘留的漂白溶液從這一卵/ 碎片徹底漂洗掉。20毫升的卵/碎片加入50ml錐形管中且20ml的40%蔗糖溶液加入 管底，達到40毫升的總體積。這一溶液然後以3750rpm離心5分鐘以將卵與碎片分離。 在離心後，將卵移出並徹底漂洗以除去任何殘留的蔗糖溶液。然後將卵置於包含用恰好 足夠的加氣自來水潤溼的濾紙以覆蓋卵的孵化盤中。1-2天後，J2幼蟲收集在濾紙下的 溶液中。J2幼蟲進行離心並進一步使用洗必泰滅菌(Atkinson等，1996)。
實施例3
適合通過RNA幹擾廣譜防治根結線蟲物種的根結線蟲目標基因
表1描述了具有高核苷酸保守性的關鍵線蟲基因核苷酸序列(預測的或編碼的多 肽列於表2中)，其有助於根結線蟲類的基於RNAi的廣譜防治。但是這些序列與非目標 生物體(如人類、宿主植物和有益昆蟲)中的關鍵基因具有足夠的核苷酸差異以在暴露於 線蟲dsRNA時降低對這些另外的生物體產生毒性的可能性。
為確認特徵秀麗隱杆線蟲基因的南方根結線蟲直系同源基因，使用BLAST程序 套裝(Altschul等，1990)進行同源性檢索。使用秀麗隱杆線蟲基因(Wormpep)的預測蛋 白質序列，TBLASTN用於檢索大豆胞囊線蟲成簇(clustered)EST和其它由Genbank獲得 的序列以及最近產生的專有基因組勘測序列(genome survey sequences)。追蹤Bitscore、 e-值和％同一性。對於作為靶標，秀麗隱杆線蟲基因必須以至少e-10或更高的e-值具 有與南方根結線蟲中的直系同源基因或同源序列的TBLASTN匹配。具有SCN RNAi正 向直系同源基因的RKN基因賦予高優先級。
表1 核苷酸根結線蟲目標序列
SEQ ID NO: 1南方根結線蟲topi cDNA秀麗隱杵線蟲M01E5.5b的2238核 苷 酸cDNA同源序列SEQ ID NO:3南方根結線蟲 let767 cDNA秀麗隱杆線蟲C56G2.6的954核苷 酸cDNA同源序列SEQ ID NO:5南方根結線蟲 sec61a cDNA秀麗隱杆線蟲Y57G11C.15的1422 核苷酸cDNA同源序列SEQ ID NO:7南方根結線蟲轉酮 醇酶cDNA秀麗隱杆線蟲F01G10.1的1848核 苷酸cDNA同源序列SEQ ID NO:9南方才艮結線蟲pas4 cDNA秀麗隱杆線蟲C36B1.4的738核苷 酸cDNA同源序列SEQ ID NO: 11南方根結線蟲kin2 cDNA秀麗隱杆線蟲R07E4.6的1119核苷 酸cDNA同源序列SEQ ID NO: 13南方根結線蟲cghl 部分cDNA秀麗隱杆線蟲C07H6.5的993核苷 酸部分cDNA同源序列SEQ ID NO: 15南方根結線蟲ubal cDNA秀麗隱杆線蟲C47E12.5的3222核 苷酸cDNA同源序列SEQ ID NO: 17南方根結線蟲vhal 3 cDNA秀麗隱杆線蟲Y49A3A.2的1713核 苷酸cDNA同源序列SEQ ID NO: 19南方才艮結線蟲vhal 9 部分cDNA秀麗隱杆線蟲Y55H10A.1的827核 苷酸部分cDNA同源序列SEQ ID NO:21南方#■結線蟲noahl cDNA秀麗隱杵線蟲C34G6.6的3507核 苷酸cDNA同源序列
權利要求
1.一種多核苷酸，包含(a)SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27、 SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ IDNO 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 44、SEQ ID NO 46 或 SEQ ID NO 47 的任一核酸 序列的至少21個連續核苷酸的片段；和(b)(a)中片段的反向互補序列。
2.權利要求1的多核苷酸，其中植物寄生的線蟲攝取包含所述至少21個連續核苷酸 的核糖核苷酸將抑制該線蟲的生長。
3.權利要求1的多核苷酸，定義為可操作地與外源啟動子連接。
4.權利要求1的多核苷酸，在所述片段和該片段的反向互補序列之間包含間隔多核苷 酸序列。
5.包含權利要求1的多核苷酸的轉化載體。
6.權利要求5的轉化載體，其中所述多核苷酸可操作地與在植物細胞中發揮功能的外 源啟動子連接。
7.從權利要求1的多核苷酸表達產生的雙鏈核糖核苷酸分子，其中植物寄生的線蟲攝 取所述核糖核苷酸分子將抑制該線蟲的生長。
8.權利要求7的雙鏈核糖核苷酸分子，其中所述核糖核苷酸分子在植物寄生的線蟲中 抑制基本上與所述多核苷酸分子互補的核苷酸序列的表達。
9.用權利要求1的多核苷酸轉化的細胞。
10.權利要求9的細胞，定義為原核細胞。
11.權利要求9的細胞，定義為真核細胞。
12.權利要求9的細胞，定義為植物細胞。
13.用權利要求1的多核苷酸轉化的植物。
14.權利要求13的植物，進一步定義為選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、 西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、菸草、 胡蘿蔔、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞 植物的作物。
15.權利要求13的植物的種子，其中所述種子包含所述多核苷酸。
16.權利要求13的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表達為雙鏈核糖核苷酸分子。
17.權利要求16的植物，其中植物寄生的線蟲攝取包含所述雙鏈核糖核苷酸分子的植 物的組織將抑制該線蟲的生長。
18.權利要求17的植物，其中所述植物寄生的線蟲是根結線蟲種類(Meloidogyne spp)。
19.權利要求17的植物，其中所述植物寄生的線蟲是南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)。
20.由權利要求13的植物產生的商品，其中所述商品包含可檢測量的所述多核苷酸或由其表達的核糖核苷酸。
21.一種用於控制植物寄生線蟲群體數量的方法，包括提供包含雙鏈核糖核苷酸分子 的藥劑，該雙鏈核糖核苷酸分子在被線蟲攝取時發揮抑制線蟲內的生物學功能的作用， 其中所述藥劑包含選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO: 5、SEQID NO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ IDNO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 23、 SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ IDNO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO : 40、SEQ IDNO : 42、SEQ ID NO : 44、SEQ ID NO 46和SEQIDNO 47，及其互補序列。
22.一種用於控制植物寄生線蟲群體數量的方法，包括提供包含在由植物寄生的線 蟲攝取時發揮作用以抑制線蟲體內的生物學功能的第一多核苷酸序列的藥劑，其中該多 核苷酸序列沿至少大約19-大約25個連續核苷酸表現出與源自線蟲的轉錄序列的大約 95%-大約100%的核苷酸序列同一性，並與第二多核苷酸序列雜交，該第二多核苷酸序 列與第一多核苷酸序列互補，且其中所述源自線蟲的轉錄序列選自SEQIDNO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 11、SEQID N0: 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、 SEQ IDNO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 44、SEQ ID NO 46 和 SEQ ID NO 47 及其互補序列。
23.權利要求22的方法，其中所述線蟲是根結線蟲種類。
24.權利要求22的方法，其中所述線蟲是南方根結線蟲。
25.—種用於控制植物寄生線蟲的群體數量的方法，包括在植物寄生線蟲的宿主植物 中提供表達權利要求1的多核苷酸分子的轉化植物細胞，其中該多核苷酸被表達以產生 在由植物寄生的線蟲攝取時發揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制所述線蟲體內目標序列 的表達並導致線蟲或線蟲群體的生長或繁殖相對於在缺乏所述轉化植物細胞的宿主上的 生長或繁殖降低。
26.權利要求25的方法，其中所述線蟲在感染宿主植物後表現出生長降低。
27.權利要求25的方法，其中所述目標序列編碼蛋白質，該蛋白質具有選自如下的 預期功能DNA複製、細胞周期控制、轉錄、RNA加工、翻譯、核糖體功能、tRNA合 成、tRNA功能、蛋白質運輸、分泌、蛋白質修飾、蛋白質穩定、蛋白質降解、能量產 生、線粒體功能、中間代謝、細胞結構、信號轉導、內吞作用、離子調節、卵產生、繁 殖和運輸。
28.權利要求25的方法，其中所述線蟲選自根結線蟲種類。
29.權利要求25的方法，其中所述線蟲是南方根結線蟲。
30.權利要求25的方法，其中所述多核苷酸在由植物寄生的線蟲攝取時發揮作用以抑 制其執行的功能對於線蟲的存活、繁殖或生長關鍵的基因的表達，所述功能選自DNA復 制、細胞周期控制、轉錄、RNA加工、翻譯、核糖體功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋 白質運輸、分泌、蛋白質修飾、蛋白質穩定、蛋白質降解、能量產生、線粒體功能、中 間代謝、細胞結構、信號轉導、內吞作用、離子調節、卵產生和運輸。
31.—種用於減少宿主植物的根組織中形成的RKN攝食位點的數目的方法，包括在根 結線蟲的宿主植物中提供表達權利要求1的多核苷酸的轉化植物細胞，其中所述多核苷 酸被表達以產生在由根結線蟲攝取時發揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制所述線蟲體內 目標序列的表達並導致所形成的攝食位點數目相對於在缺乏所述轉化植物細胞的宿主上 形成的攝食位點數目降少。
32.一種用於防治植物中的植物線蟲蟲害的方法，包括在植物線蟲害蟲的食物中提供 dsRNA，其包含a)有義核苷酸序列；和b)與所述有義核苷酸序列互補的反義核苷酸序列，其中所述有義核苷酸序列包含權 利要求1的核苷酸序列或與其互補。
33.權利要求32的方法，其中所述食物包含經轉化以表達所述有義和所述反義核苷酸 序列的植物細胞。
34.一種用於提高由遭受植物寄生線蟲感染的作物植物產生的作物產量的方法，所述 方法包括以下步驟a)將權利要求1的多核苷酸引入所述作物植物中；和b)種植該作物植物以使得所述多核苷酸表達，其中該多核苷酸的表達抑制植物寄生 線蟲感染、生長、繁殖或由於植物寄生線蟲感染導致的產量損失。
35.權利要求34的方法，其中所述作物植物選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴 薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、煙 草、胡蘿蔔、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和 觀賞植物。
36.權利要求34的方法，其中所述多核苷酸的表達產生抑制已經與所述作物植物的一 部分接觸的植物寄生線蟲中的至少第一目標基因的RNA分子，其中所述目標基因執行至 少一種選自以下的關鍵功能DNA複製、細胞周期控制、轉錄、RNA加工、翻譯、核糖 體功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白質運輸、分泌、蛋白質修飾、蛋白質穩定、蛋白 質降解、能量產生、線粒體功能、中間代謝、細胞結構、信號轉導、內吞作用、離子調 節、卵產生、繁殖和運輸。
37.權利要求36的方法，其中所述植物寄生的線蟲是墊刃線蟲。
38.權利要求37的方法，其中所述植物寄生的線蟲是根結線蟲種類。
39.權利要求37的方法，其中所述植物寄生的線蟲是南方根結線蟲。
40.一種用於提高遭受植物寄生線蟲感染的作物植物的滲透脅迫耐受性的方法，所述 方法包括以下步驟a)將權利要求1的多核苷酸引入所述作物植物；b)種植該作物植物以允許所述多核苷酸表達，其中所述多核苷酸的表達提高作物植 物的滲透脅迫耐受性。
41.權利要求40的方法，其中所述滲透脅迫耐受性定義為耐旱性。
42.—種用於生產商品的方法，包括獲得權利要求13的植物或其部分，和從該植物或 其部分製備商品。
43.一種用於生產食品或飼料的方法，包括獲得權利要求13的植物或其部分和從所述植物或其部分製備食品或飼料。
44.權利要求43的方法，其中所述食品或飼料定義為油、粗磨粉、蛋白質、澱粉、面 粉或青貯飼料。
45.一種用於調節植物寄生線蟲細胞中目標基因的表達的方法，該方法包括(a)用包含編碼dsRNA的核酸序列的載體轉化植物細胞，所述核酸序列選自SEQID NO: 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9、SEQID NO: 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQID NO 25、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、 SEQ ID NO 29、SEQ IDNO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 44、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47 及其至少 21 個連續核苷酸的片 段，其中所述核酸序列編碼dsRNA並可操作地與啟動子和轉錄終止序列連接；(b)在足以允許包含多個轉化的植物細胞的植物細胞培養物發育的條件下培養轉化的 植物細胞；(c)選擇已經將所述核酸序列整合到其基因組中的轉化植物細胞；(d)篩選表達由所述核酸序列編碼的dsRNA的轉化植物細胞；和(e)選擇表達該dsRNA的植物細胞。
46.權利要求45的方法，進一步包括從表達所述dsRNA的植物細胞再生植物，從而 植物中核酸序列的表達足以調節與轉化的植物或植物細胞接觸的植物寄生線蟲細胞中目 標基因的表達。
47.—種多核苷酸，包含(a) SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15、SEQID NO 17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 23、SEQ IDNO 25、SEQ ID NO 27、 SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ IDNO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 44、SEQ ID NO 46 或 SEQ ID NO 47 的任一核酸 序列的連續核苷酸的片段；和(b) (a)中片段的反向互補序列，其中在植物寄生的線蟲的食物中提供表達足以調節所述線蟲中目標基因表達的多核 苷酸的植物細胞。
全文摘要
本發明公開了用於遺傳防治由根結線蟲屬的線蟲(根結線蟲)引起的植物疾病的基因靶標、構建體和方法。本發明涉及通過確認目標編碼序列和使用用於轉錄後阻抑或抑制植物寄生線蟲細胞中的目標編碼序列的表達的重組DNA技術獲得植物保護效應。所公開的基因靶標在不同根結線蟲種的直系同源基因之間在核苷酸水平上表現出顯著的保守性，從而利於RNA幹擾的屬範圍的靶標選擇。
文檔編號C07K14/435GK102027121SQ200980115310
公開日2011年4月20日 申請日期2009年4月10日 優先權日2008年4月10日
發明者B·恰瓦佩利, B·高, D·J·威廉斯, J·D·布拉德利, J·P·麥卡特, M·L·維布斯基 申請人:孟山都技術公司