一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法
2023-06-07 20:07:16 2
專利名稱：一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法。
背景技術：
磁性分離技術是以納米或微粒級的磁性微粒為載體，利用結合於磁性微粒表面的蛋白質所提供的特異的親和特性，在加磁場的定向控制下，通過親和吸附、清洗、解吸操作，可以進一步從複雜的生物體系中分離到目標物分子，具有磁性分離簡單方便、親和吸附高特異性及高敏感性等眾多優點。應用於磁性分離技術的磁性載體應具備以下特點:①粒徑比較小，比表面積較大，具有較大的吸附容量物理和化學性能穩定，有較高機械強度，使用壽命長；③含有可活化的反應基團，以用於親和配基的固定化；④粒徑均一，能形成單分散體系；⑤懸浮性好，便於反應的有效進行。納米技術的出現，促進了磁性微粒的應用。納米磁微粒粒徑小，加至反應液中呈懸浮狀態，加磁場後可迅速分離。納米磁微粒還可通過免疫反應與標記有螢光素、化學發光物質、酶等物質連接，建立各種免疫分析方法。納米磁微粒化學發光免疫診斷試劑綜合採用了目前國際上的兩大主流免疫分析尖端技術——懸浮納米磁微粒載體技術、化學發光檢測技術，能夠準確定量的檢測人類血清中的免疫抗原或抗體，可用於過敏、自身免疫、甲狀腺功能、腫瘤、性激素、傳染病等相關標誌物的檢測。然而，不同的納米磁微粒和抗體的偶聯方法，會導致偶聯上抗體活性的不同，影響試劑的靈敏度。現有技術中，納米磁微粒和抗體偶聯過程中偶聯劑和抗體易接觸導致抗體活性下降，試劑的靈敏度較低。因此，開發一種納米磁微粒和抗體的偶聯方法，保證抗體偶聯到納米磁微粒上後保持較高的活性，確保試劑的靈敏度，是該平臺發展的核心技術之一 O
發明內容
有鑑於此，本發明的目的是提供一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法，以解決納米磁微粒包被抗體後活性下降，試劑靈敏度低的問題，提高納米磁微粒化學發光免疫診斷試劑的靈敏度。為了達到上述目的，本發明提供一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於，具體步驟為:(I)取含有磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝液重懸；(2)加入新鮮配製的碳二亞胺(EDC)水溶液，室溫混懸；(3)磁分離去上清，加入2-嗎啉乙磺酸緩衝液重懸；(4)加入抗體，室溫混懸；(5)磁分離，去上清，用磁微粒保存液重懸。較佳地，所述步驟(I)和(2)中，所述的2-嗎啉乙磺酸緩衝液為2-嗎啉乙磺酸的摩爾含量為0.05mol/L, pH4 6的2-嗎啉乙磺酸緩衝液。較佳地，本發明提供一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法的具體步驟為:
(I)取含有IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用0.05mol/L，pH4 62_嗎啉乙磺酸緩衝液IOml重懸；(2)加入0.5 2ml新鮮配製的10mg/ml的碳二亞胺水溶液,室溫混懸；(3)磁分離去上清，加入0.05mol/L, pH4 62_嗎啉乙磺酸緩衝液IOml重懸；(4)加入4mg的抗體，室溫混懸；(5)磁分離,去上清,用磁微粒保存液重懸到lmg/ml。較佳地,所述的磁微粒為表面帶有羧基的納米磁微粒,直徑200納米至3微米。較佳地，所述的抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體，純度為90wt%以上。 較佳地，所述步驟(2 )和(3 )中，室溫溫懸的時間為I 5h。相較於現有技術，本發明提供的納米磁微粒與抗體偶聯的方法，以兩步清洗偶聯法將納米磁微粒與抗體偶聯，避免了偶聯過程中偶聯劑EDC和抗體接觸導致抗體活性下降的缺陷，本發明的方法簡單，成本低，可用於納米磁微粒和多種抗體的偶聯，解決了納米磁微粒偶聯抗體後，抗體活性下降導致試劑靈敏度低的問題。
圖1為本發明實施例一中AFP試劑的靈敏度評價擬合曲線。圖2為本發明實施例二中AFP試劑的靈敏度評價擬合曲線。圖3為本發明實施例三中AFP試劑的靈敏度評價擬合曲線。
具體實施例方式以甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體偶聯的納米磁微粒化學發光測試試劑為例，將AFP單抗和納米磁微粒採用以下方法偶聯。使用市售的Maglia60化學發光免疫分析儀測定AFP試劑的靈敏度。其中，所述的甲胎蛋白單克隆抗體偶聯的納米磁微粒化學發光測試試劑(APF試齊[J)包括:含有螢光素(FITC)標記的AFP抗體的溶液(簡稱第一試劑)和包被有螢光素抗體的磁微粒的懸浮液(簡稱磁分離試劑)，以及鹼性磷酸酶(ALP)標記的AFP抗體的溶液(簡稱第二試劑)。所述的AFP試劑通過以下方法製備得到:第一試劑的製備(I)材料與儀器:以磷酸鹽緩衝液保存的AFP抗體(純度超過95wt%，濃度為Img/ml);異硫氰酸螢光素(FITC)，碳酸氫鈉等試劑應達到化學純；G-25凝膠純化柱採購自GE公司。(2)製備步驟:①用0.2mol/L pH9.0的碳酸鹽緩衝液配製0.5mg/ml的FITC溶液；②按照AFP抗體與FITC分子比為1:20的比例在抗體溶液中加入步驟①所配FITC溶液，混合均勻，室溫靜置12h小時，反應生成AFP抗體-FITC連接物；③將經過步驟②的反應液通過G-25凝膠柱進行分離，除去未反應的FITC，得到含有AFP抗體-FITC連接物(即FITC標記的AFP抗體)的溶液；④將步驟③所得含有AFP抗體-FITC連接物的溶液用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)ρΗ8.0的0.lmol/L的Tris緩衝液稀釋到AFP抗體-FITC連接物濃度為I μ g/ml, pH為8，即為第一試劑。第二試劑的製備(I)材料與儀器:以磷酸鹽緩衝液保存的AFP單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為lmg/ml，下稱AFP抗體溶液)；以磷酸緩衝液保存的鹼性磷酸酶(ALP溶液，ALP純度為約99%，比活性為約1500U/mg，濃度為10mg/ml) ;5mg/ml SMCC (4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯)溶液、10mg/ml2-1T(2-亞氨基硫烷鹽酸鹽)溶液(SMCC和2-1T固體粉末，用DMF (二甲基甲醯胺)作為溶劑配成上述溶液使用；SMCC和2-1T購自THERMO公司);Tris等化學試劑應達到化學純；G-25凝膠純化柱、AKTA-purifierlOO蛋白純化儀和Supperdex200凝膠純化柱均為GE公司產品。(2)製備步驟:①取Img AFP抗體溶液，加入10mg/ml的2IT溶液2 4 μ 1，室溫靜置20min，加入0.lmol/L的甘氨酸溶液10 μ 1，室溫靜置5min。用G-25凝膠柱除鹽，收集活化的抗體，2-8°C
保存備用；②取1.5mg ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液20 μ 1，室溫靜置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化的ALP抗體，2-8°C保存備用；③將上述活化的AFP抗體與活化的ALP抗體混合，2_8°C條件下靜置15h,通過Supperdex200凝膠純化柱進行純化，獲得含有抗體AFP-ALP連接物(ALP標記的AFP抗體)的溶液，2-8 °C保存備用；④將抗體AFP-ALP連接物的溶液用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)pH8.0的0.1mol/L的TRIS緩衝液稀釋到I μ g/ml, pH8，即為第二試劑。磁分離試劑的製備分別通過下面實施例一至實施例三的具體工藝進行偶聯製備。其中，納米磁微粒與AFP單克隆抗體分別通過實施例一至實施例三的具體工藝進行偶聯。實施例一以甲胎蛋白(AFP)單抗偶聯的納米磁微粒化學發光試劑為例，將AFP單抗和納米磁微粒用下面的工藝進行偶聯。使用Maglia60型發光儀，測定AFP試劑的靈敏度。1、材料與儀器:納米磁微粒:表面帶有羧基的納米磁微粒,直徑200納米。抗體:AFP單克隆抗體，純度為98wt%以上。2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)和其他試劑應達到化學純。2、製備步驟:(I)取IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用0.05mol/L, pH4MES緩衝液IOml
重懸;(2)加入0.5ml新鮮配製的10mg/ml的EDC水溶液,室溫混懸Ih ；(3)磁分離去上清,加入0.05mol/L, pH4MES緩衝液IOml重懸；(4)加入4mg的抗體,室溫混懸15h ；(5)磁分離,去上清,用磁微粒保存液重懸到lmg/ml。
3、靈敏度評價檢測「O」濃度樣本，重複檢測20次，計算相對發光強度(RLU)的平均值(M)和標準差(SD)，並計算M+2SD值，根據零濃度校準品和相鄰校準品之間的濃度-RLU進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M+2SD值帶入上述方程中，求出對應的濃度值，即為最低檢測限。本方法的靈敏度遠高於行業標準YY/T1162-2009甲胎蛋白(AFP)定量測定試劑(盒)(化學發光免疫分析法)的0.5ng/mL。其中:A點發光值參見表I。表I
權利要求
1.一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於，具體步驟為: (1)取含有磁微粒的懸浮液，磁分離，去上清，用2-嗎啉乙磺酸緩衝液重懸； (2)加入新鮮配製的碳二亞胺水溶液，室溫混懸； (3)再次磁分離，去上清，然後再次加入2-嗎啉乙磺酸緩衝液重懸； (4)加入抗體，室溫混懸； (5)最後再磁分離，去上清，用磁微粒保存液重懸。
2.根據權利要求1所述的納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於:所述步驟(I)和(2)中，所述的2-嗎啉乙磺酸緩衝液為0.05mol/L, pH 4飛的2-嗎啉乙磺酸緩衝液。
3.根據權利要求1所述的納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於:具體步驟為: (1)取含有IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離，去上清，用0.05mol/L, pH 4^6 2-嗎啉乙磺酸緩衝液IOml重懸； (2)加入0.5 2ml新鮮配製的10mg/ml的碳二亞胺水溶液,室溫混懸； (3)再次磁分離，去上清，然後再次加入0.05mol/L, pH 4^6的2-嗎啉乙磺酸緩衝液IOml重懸； (4)加入4mg的抗體,室溫混懸； (5)最後再磁分離，去上清，用磁微粒保存液重懸到lmg/ml。
4.根據權利要求3所述的納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於:所述步驟(2)和(3)中，室溫溫懸的時間為l 5h。
5.根據權利要求1至4任意一項所述的納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於:所述的磁微粒為表面帶有羧基的納米磁微粒，直徑200納米至3微米。
6.根據權利要求1至4任意一項所述的納米磁微粒與抗體偶聯的方法，其特徵在於:所述的抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體，純度為90wt%以上。
全文摘要
本發明公開一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法，具體步驟為(1)取含有磁微粒的懸浮液，磁分離，去上清，用2-嗎啉乙磺酸緩衝液重懸；(2)加入新鮮配製的碳二亞胺水溶液，室溫混懸；(3)再次磁分離，去上清，然後再次加入2-嗎啉乙磺酸緩衝液重懸；(4)加入抗體，室溫混懸；(5)最後再磁分離，去上清，用磁微粒保存液重懸。相較於現有技術，採用本發明提供的一種納米磁微粒與抗體偶聯的方法後，抗體偶聯在納米磁微粒上具有較高的活性，試劑的靈敏度有較大的提高。
文檔編號G01N33/531GK103149350SQ20131002422
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者於大為, 程曉蕾 申請人:蘇州浩歐博生物醫藥有限公司