一種刺五加注射液的成分分析方法與流程
2023-07-04 13:52:11
本發明屬於藥物製劑領域，具體涉及一種刺五加注射液的成分分析方法。
背景技術：
：刺五加注射液為刺五加經提取加工而製成的滅菌水溶液，有平補肝腎，益精壯骨之功能，主治肝腎不足所致的短暫性腦缺血發作，腦動脈硬化，腦血栓形成，腦栓塞等。刺五加的化學成分主要包括苯丙酸類、香豆素類、木脂素類、含氮鹼基類、糖、胺基酸等。由於刺五加注射液中成分種類較多，目前還沒有一種檢測分析方法能夠較為全面的檢測刺五加注射液中的多種成分，而市售刺五加注射液種類規格和生產廠家各不相同，缺乏統一全面的檢測方法將使其質量控制面臨嚴峻考驗。另一方面，隨著近年來刺五加注射液的廣泛應用，其不良反應的報導也逐年增多，眾所周知，中藥注射液成分複雜，其中任何一種成分及其含量的變化均有可能成為致敏原因，因此對注射液成分及其含量的監測尤為重要。由於刺五加注射液中成分種類較多，單一指紋圖譜無法全面反映化合物的信息。目前建立起的刺五加注射液指紋圖譜檢測方法解析度相對較弱，僅能識別15個左右的成分；譜圖中各成分峰的區分度較差，相互之間存在明顯幹擾，直接影響檢測分析結果的準確性；背景雜峰相對較多，對注射液中的活性成分峰存在影響，也會直接影響到檢測分析結果的準確性；耗時相對較長，識別出15個左右的成分峰通常需要50分鐘以上；流動相成分和濃度選擇不合理，可能導致許多成分峰無法被識別到，進而無法監測注射液中的相應成分含量；並未對識別出的成分峰進行鑑定，因此無法得知識別出的所有成分峰對應的具體成分。例如，中國專利申請200410044162公開了一種刺五加指紋圖譜檢測方法，採用0.1％的磷酸溶液作為A相，30％的乙腈70％水的水溶液作為B相進行梯度洗脫，採集70min之內數據。其附圖公開的指紋圖譜中，僅識別出14個成分峰，且除紫丁香苷外其他成分未知，背景雜峰相對較多，基線相對不平穩，區分度相對較小。又例如，中國專利申請201210049755公開了一種刺五加組合物，含其製劑及其檢測方法。其中還包括指紋圖譜的檢測方法，其特徵在於，該指紋圖譜的檢測方法採用高效液相色譜法，應用Agilent的ZorboxEclipseXDB-C18色譜柱，柱溫為20℃，流速為每分鐘0.8ml，檢測波長為270nm，理論板數按紫丁香苷峰計算應不低於6000，且與其相鄰的色譜峰的分離度應達到1.5以上，梯度洗脫程序如下：流動相A為0.5％的甲酸溶液，流動相B為乙腈和水，其體積比為30∶70，0分鐘時為100％的流動相A；15分鐘時為88％的流動相A和12％的流動相B；21分鐘時為82％的流動相A和18％的流動相B；60分鐘時為31％的流動相A和69％的流動相B；65分鐘時為100％的流動相B；70-75分鐘時為100％的流動相A。該方法僅能識別出14中成分峰，且基線相對不平穩，背景雜峰較多，嚴重影響對成分峰的判定。中藥注射液由於其成分相對較為複雜，因此質量控制的難度也相對較大，然而日漸增多的不良反應發生案例使得我們不得不面對如何提高其質量控制這一難題。就刺五加注射液而言，含有多種主要活性成分，除此之外還含有各種微量活性成分，無可避免的還含有一些雜質成分。如何一次就能將刺五加注射液中的各種成分儘可能多地識別出來，對其生產製造以及臨床使用中的質量監控非常重要。綜上所述，提供一種刺五加注射液的成分分析方法，能夠儘可能多的識別出其中的各種成分是其生產製造和臨床應用中亟待解決的重要問題。技術實現要素：本發明的目的是提供一種刺五加注射液的成分分析方法。所述的成分分析方法利用超高效液相色譜指紋圖譜檢測方法。所述的指紋圖譜檢測方法包括以下步驟：(1)、樣品製備：精密量取待檢測刺五加注射液1-5mL，加入與其等體積的稀釋試劑，搖勻後，用0.22μm的微孔濾膜濾過，收集濾液，即為測試樣品；(2)、超高效液相色譜檢測：將步驟(1)得到的測試樣品進行超高效液相色譜檢測，應用WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱、WatersACQUITYUPLCBEHShieldRP18色譜柱或WatersACQUITYUPLCCSHC18色譜柱，柱溫為25-45℃，流速為每分鐘0.2-0.35mL，採用體積濃度為0.1-0.7％的甲酸和40％的乙腈水溶液作為流動相A，體積濃度為0.1-0.7％的甲酸水溶液作為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫液經紫外檢測器採集60分鐘之內的數據，所述的紫外檢測的檢測波長為250-340nm。所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(1)樣品製備中的稀釋試劑為超純水、20％甲醇水溶液或40％甲醇水溶液；優選為20％甲醇水溶液或40％甲醇水溶液；進一步優選為20％甲醇水溶液。所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，梯度洗脫的程序為：在開始時，也就是0分鐘時，流動相B為100％；到8分鐘時，流動相A為4％，流動相B為96％；到13分鐘時，流動相A為12％，流動相B為88％；到19分鐘時，流動相A為15％，流動相B為85％；到25分鐘時，流動相A為22％，流動相B為78％；到40分鐘時，流動相A為28％，流動相B為72％；到50分鐘時，流動相A為43％，流動相B為57％；到60分鐘時，流動相A為75％，流動相B為25％。所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，應用的色譜柱優選為用WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱或WatersACQUITYUPLCBEHShieldRP18色譜柱；進一步優選為WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱。所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，柱溫優選為30-40℃；進一步優選為35℃。所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，流速優選為每分鐘0.22-0.30mL；進一步優選為每分鐘0.25mL。在本發明較佳的實施方案中，所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，採用體積濃度為0.3-0.6％的甲酸和40％的乙腈水溶液作為流動相A，體積濃度為0.3-0.6％的甲酸水溶液作為流動相B，進行梯度洗脫。在本發明更佳的實施方案中，所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，採用體積濃度為0.5％的甲酸和40％的乙腈水溶液作為流動相A，體積濃度為0.5％的甲酸水溶液作為流動相B，進行梯度洗脫。所述的指紋圖譜檢測方法中步驟(2)超高效液相色譜檢測中，檢測波長優選為260-300nm；進一步優選為270nm。所述的指紋圖譜檢測方法獲得的刺五加注射液指紋圖譜中共有35個成分峰，其中有32個成分峰對應的成分得到鑑定。上述35個成分峰對應的成分如下所示：上述35個成分峰在指紋圖譜上對應的保留時間分別為：如無特別說明，本發明中涉及到的水為超純水。如無特殊說明，本發明中涉及到的百分比指體積比。和現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明提供的刺五加注射液的成分分析方法採用超高效液相色譜法指紋圖譜檢測方法，對刺五加注射液中的成分識別能力明顯提高，現有技術僅能識別約15種左右成分，而本發明提供的分析方法能夠識別35種成分，且各個成分峰分離度好。本發明提供的分析方法中洗脫體系中的流動相A和流動相B以及梯度洗脫程序使得各種成分的峰之間分離度好，各個峰之間幾乎無重疊，能夠獲得更加準確的檢測結果。本發明提供的分析方法對識別出的35種成分進行了分離鑑定，獲知了其中32種成分的具體化合物名稱，可以作為刺五加注射液檢測的標準參照。本發明提供的分析方法靈敏度高、重複性好、特異性強，僅需1μL的進樣量，即可獲得清晰的指紋圖譜。本發明提供的分析方法在檢測時用時短，在保證了分離度的基礎上，將現有技術中採集時間由70分鐘縮短到60分鐘。本發明提供的分析方法獲得的UPLC指紋圖譜背景幹擾小，雜峰少，基線平穩，使得分析結果更加清晰準確。綜上所述，本發明提供的刺五加注射液的成分分析方法具有相對更高的靈敏度、穩定性、重複性、特異性；能夠識別出刺五加注射液中的更多成分；縮短了常規分析方法的採集時間；峰與峰之間具有更高的分離度；確定了圖譜中個個成分峰所對應的具體化合物，為刺五加注射液的標準化檢測分析提供的了可靠的參照。本發明提供的刺五加注射液的成分分析方法為刺五加注射液的生產質量控制和臨床應用安全提供了可靠保障。附圖說明圖1為實驗例1中的刺五加注射液指紋圖譜。具體實施方式以下實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護範圍內。對所公開的實施例的下述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制於本文所示的這些實施例中，而是可以應用於符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的範圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員通常理解的相同意義。術語：超高效液相色譜(UltraPerformanceLiquidChromatography)在本發明中簡稱UPLC。ACQUITYUPLC超高效液相色譜儀(配脫氣機)、二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極體陣列檢測器購自Waters公司；Mill-Q超純水器購自Millipore公司；MettlerXS105型電子天平購自Mettler公司。乙腈、甲醇為色譜純，購自Merck公；甲酸為色譜純購自ROCScientific公司及Merck公司；其餘試劑均為分析純，購自西格瑪奧德裡奇公司；水為Milli-Q超純水。標準品：胞苷(批號：36641，HPLC純度：99.0％)、尿苷(批號31313，純度：99.5％)、腺苷(批號：D1303032，純度：99.5％)、鳥苷(批號32979，純度：99.5％)、咖啡酸(批號：A1309017)和腺嘌呤(批號：1132692)購自上海晶純實業有限公司；5-羥甲基糠醛(批號：130607，HPLC純度：99.64％)、原兒茶酸(批號：130509，HPLC純度：99.34％)、新綠原酸(批號：130426，HPLC純度：99.20％)、綠原酸(批號130602，HPLC純度：99.53％)、刺五加苷B(批號：130504，HPLC純度：99.25％)、隱綠原酸(批號：130405，HPLC純度：99.37％)、異嗪皮啶(批號：130427，HPLC純度：99.69％)和刺五加苷E(批號：130623，HPLC純度：99.42％)均購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；刺五加苷E、5-甲氧基落葉松醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和3,5二咖啡醯奎寧酸由浙江大學藥物信息學研究所自製。實施例1一種刺五加注射液的成分分析方法採用超高效液相色譜指紋圖譜法檢測供試樣品。供試樣品：共21個不同批次的刺五加注射液，由哈爾濱珍寶製藥有限公司生產，批號分別為BS20120801、BS20120803、AS20121101、AS20121102、AS20121103、AS20121104、A20120907、A20120908、A20120909、A20120910、C20120503、C20120507、C20120511、C20120515、C20120521、20120402、20120405、20120411、S20130801、S20130803和S20130702。檢測步驟：(1)、樣品製備：精密量供試樣品2.5mL，置5mL容量瓶中，加20％甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻後用用0.22μm的微孔濾膜濾過，收集濾液，即為測試樣品；(2)、超高效液相色譜檢測：將步驟(1)得到的測試樣品進行超高效液相色譜檢測，色譜條件為：色譜柱：WatersACQUITYUPLCHSST3(2.1×100mm，1.8μm)色譜柱配Waters在線過濾柱；流動相：以0.5％甲酸和40％乙腈水溶液(V/V)為流動相A，以0.5％甲酸溶液為流動相B，按以下程序進行現行梯度洗脫：在開始時，流動相B為100％；到8分鐘時，流動相A為4％，流動相B為96％；到13分鐘時，流動相A為12％，流動相B為88％；到19分鐘時，流動相A為15％，流動相B為85％；到25分鐘時，流動相A為22％，流動相B為78％；到40分鐘時，流動相A為28％，流動相B為72％；到50分鐘時，流動相A為43％，流動相B為57％；到60分鐘時，流動相A為75％，流動相B為25％；柱溫為：35℃；流速為：每分鐘0.25mL；檢測波長為：270nm；進樣量為：3μl；數據採集時間為：60分鐘。在上述色譜條件下獲取的刺五加注射液UPLC指紋圖譜見圖1，刺五加注射液UPLC指紋圖譜中共識別出35個成分峰，利用標準品鑑定，其中有32個成分得到鑑定，鑑定結果為：成分峰1-35分別為：腺嘌呤、胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶醯葡萄糖苷、原兒茶酸、butane-2,3-diol-2-O-β-D-apiofuranosyl-(1->6)-β-D-glucopyranoside或其構體、胸苷、1-咖啡醯奎寧酸、香草酸葡萄糖苷、新綠原酸、紫丁香酸葡萄糖苷、5-(4-O-β-D-葡萄糖基阿魏醯)-奎寧酸、香豆醯奎寧酸、刺五加苷B葡萄糖苷或其異構體、4-(4-O-β-D-葡萄糖基阿魏醯)-奎寧酸、阿魏醯葡萄糖苷、綠原酸、刺五加苷B葡萄糖苷或其異構體、咖啡酸、刺五加苷B、隱綠原酸、未知成分、阿魏醯奎寧酸、4-葡萄糖基芥子酸苷、阿魏醯葡萄糖苷、未知成分、右旋鬆脂醇二葡萄糖苷或其異構體、未知成分、右旋鬆脂醇二葡萄糖苷或其異構體、刺五加苷E、5-甲氧基落葉松醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、3,5二咖啡醯奎寧酸。實驗例1方法重複性實驗取同一批次刺五加注射液(批號：AS20121102)6份，按照實施例1的成分分析方法進行分析，統計6份注射液的中的峰面積和保留時間，統計結果如下所示：峰面積：成分峰第1份第2份第3份第4份第5份第6份平均值RSD(％)15876185823735838815733545794575798795810940.8324635794754674776134730244645854740184713811.2537386577590497617067128327529947252777417532.6643416913488293512673407873479273480873464311.2189477559717149734869514779647429682059628971.121313512831381212138677213548891369705137702713701481.05144685754803614802114704764723624783534750561.10163272353364513363693296463322483327783324551.102011275911142974114620811289441132649113963811363340.682410011841017790103184510068181021331102243510169011.10保留時間：由統計結果可見：各峰保留時間RSD小於0.5％，單峰面積大於總峰面積2％的峰的峰面積RSD小於3.0％，表明本方法具良好重複性。以上所述僅為本發明的部分較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1 2 3