一種基於sry基因的哺乳動物生雌性控方法
2023-06-15 01:02:26
專利名稱：一種基於sry基因的哺乳動物生雌性控方法
技術領域：
本發明屬於哺乳類動物性別控制技術領域。特別涉及以SRY蛋白為靶抗原對雌性動物進行免疫，通過誘導產生SRY蛋白特異的免疫反應而殺死表達該蛋白的雄性胚胎；或以SRY蛋白為靶抗原對動物進行免疫，獲得抗SRY抗血清、抗SRY抗體或抗SRY的單克隆抗體，在體外或體內處理胚胎，殺死雄性胚胎或阻滯其發育，從而實現生雌性控目的的方法。
背景技術：
在農業生物技術領域中，性別控制問題長期以來一直是生物科學家致力於研究的重大課題之一，而且具有巨大的經濟價值。性別控制的方法很多，但基本可歸類為兩大技術領域一類是通過對X型精子和的分離達到性別控制的目的，另一類是通過對早期胚胎進行性別鑑定後進行胚胎移植從而達到性別控制的目的。經過長期的研究和發展，在這兩類技術領域中已經形成了許多具有現實應用價值的方法和技術。
在精子分離技術領域，改進型流式細胞儀的出現使得準確高效分離精子成為可能(GeorgeE.Seidel，Reproduction(2002)124，733-743)，並迅速於2000年在英國和美國進入了商業化應用領域，這標誌著精子分離技術獲得了實質性的成功。儘管流式細胞分選器技術比較成功，但該方法還無法象人們預期中那樣能生產出滿足人工授精所需數量的性控精子，而且該設備價格極為昂貴，直接限制了其應用範圍。同時在精子分離操作過程中，有些步驟還會對精子產生損害作用，如高濃度的螢光染色劑、雷射照射、極高的流速、高稀釋倍數和離心力等，其中以冷凍保存處理造成的損害最大。因此，在當前日趨規模化的現代化養殖業中，僅就該技術的分離速度和成本來看，這一技術僅可用於體外受精，採用冷凍分離精液人工授精的成本仍然太高，所以真正用於生產還需要進一步地改進和降低成本。
在早期胚胎性別鑑定技術領域，經過長期發展和應用，目前基本發展成熟的是PCR性鑑技術，其主要內容是利用PCR技術擴增牛胚胎細胞中SRY基因核心序列或其5』端非編碼區序列，通過對擴增產物的分析而對胚胎性別進行鑑定。在這方面，美國的Herr CM等首先成功應用了PCR技術鑑定牛和羊胚胎的性別(Herr CM，Theriogenology，1991，35(1)45-54)。其後，隨著胚胎移植技術的產業化推廣，該項技術日益發展成熟，已成為國內外目前最常用的性別控制技術。該方面的情況已為業內人士所熟知，此處不再詳述。對胚胎進行性別鑑定雖是一種很好的性別控制方法，但這種技術的設計思想本身就存在著許多難以克服的困難和問題。首先，它只能應用於胚胎移植；其次，反覆轉移胚胎，再移植的胚胎的成活率降低；再次，不論怎樣進行胚胎的性別鑑定，按照生態平衡的理論所產生的雌雄胚胎的比例總是1∶1，在移植時，我們所需要的性別的胚胎被保留下來，而另一半因沒有用處被扔掉，造成胚胎的浪費。在畜牧業中，如果是大型規模化養殖，這是一項既艱巨又很浪費人力、物力和財力的做法。
綜上所述，這兩類技術各有其不足之處，主要表現在成本高、操作難度大、技術實施過程複雜，在現實生產中，這些不足直接限制了它們的應用規模，科學家們一直在試圖建立一種新的技術系統，力圖使性別鑑定成為一種操作簡單、成本低廉、效果良好、具有普及實施價值的技術。
現有研究已證實，SRY基因(Sex-determining region Y gene)在哺乳動物的性別決定中起著總開關的作用，可以啟動雄性性狀的發育。其原理在於，雄性動物的發育以SRY為核心，層次調控基因表達。其過程是SRY基因編碼的蛋白是一種DNA結合蛋白，當與線性DNA結合後能使DNA彎曲，引起變形，並使SRY蛋白與受控基因的啟動子序列結合，調節基因表達，誘導精巢發生，啟動SF-1基因轉錄，SF-1的表達激活MIS表達，MIS表達產物引起繆勒管退化，吳式管在精巢分泌的睪酮作用下分化出雄性器官。用反轉錄PCR(RT-PCR)方法檢測小鼠SRY轉錄產物的試驗結果表明，SRY基因僅在交配後10.5～12.0d的有限時間內表達，並且這種表達是隨著細胞的發育在生殖脊細胞內進行的，在小鼠交配後9.5d無預先的表達徵兆，只在交配後12.5d，睪丸索明顯形成的時候，才有表達痕跡。這種極短時間的表達揭示SRY啟動睪丸的發育，但對長時間維持睪丸特異基因的表達不是必需的。由於突變和缺失都會使SRY蛋白的DNA結合能力下降或喪失，從而導致SRY蛋白所調控的基因不能開啟轉錄，發生XY性反轉。
由於SRY蛋白為雄性特異產物，以其為靶抗原對雌性動物進行免疫將會誘導產生免疫反應，而雄性胚胎將在發育至10.5～12.0d時表達SRY蛋白，根據免疫學原理，在細胞內所表達的任何蛋白都會因被遞呈而在細胞表面形成特異的淋巴細胞識別表位，因此，母體免疫系統將會特異識別雄性胚胎並以細胞毒作用將其殺死，而對雌性胚胎不產生影響，這樣就產生了生雌性控的效果。同樣，如果製備出抗SRY抗血清、抗SRY抗體或抗SRY的單克隆抗體，在進行胚胎體外培養時加入培養液中，或在動物配種或人工授精後選擇合適的時間加入子宮中，也同樣可以殺死雄性胚胎或阻滯其發育，從而實現生雌性控的目的。
發明內容
本發明的技術方案是通過以下的措施來達到的一種基於SRY基因的哺乳動物生雌性控方法，其特徵在於使用以SRY蛋白為靶抗原的疫苗免疫雌性動物；或以SRY蛋白為靶抗原對動物進行免疫，獲得能特異識別SRY蛋白的免疫物質，在體外或體內處理胚胎。
本發明的技術方案是通過以下措施來達到的一種基於SRY基因的哺乳動物生雌性控方法，其特徵在於使用以SRY蛋白為靶抗原的疫苗免疫雌性動物；或以SRY蛋白為靶抗原對動物進行免疫，獲得能特異識別SRY蛋白的免疫物質，在體外或體內處理胚胎。
上述所使用的以SRY蛋白為靶抗原的疫苗是核糖核酸或脫氧核糖核酸或蛋白質。
上述以SRY蛋白為靶抗原對動物進行免疫的方法是核酸免疫或蛋白質免疫。
上述所使用的能特異識別SRY蛋白的免疫物質是指抗SRY抗血清或抗SRY抗體或抗SRY的單克隆抗體。
上述在體外或體內處理胚胎的方法是將能特異識別SRY蛋白的免疫物質加入胚胎培養液中作用於胚胎，或將其置入雌性動物子宮中作用於胚胎。
上述核酸疫苗是人工合成的或者通過生物體生產而成的DNA質粒。
上述核酸疫苗是通過以下方法得到的通過分子克隆的方法獲得某種哺乳動物的SRY蛋白編碼cDNA，將其插入到真核表達質粒中得到重組質粒並轉化到大腸桿菌中，用真核細胞瞬時表達的方法確認該重組質粒可以表達SRY蛋白，經大腸桿菌培養擴增後提取質粒，純化後溶於生理鹽水或含有不同佐劑的生理鹽水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
上述核酸疫苗是通過以下方法生產的通過分子克隆的方法獲得某種哺乳動物的SRY蛋白編碼cDNA，將其插入到真核表達質粒中得到重組質粒並轉化到大腸桿菌中，用真核細胞瞬時表達的方法確認該重組質粒可以表達SRY蛋白，經大腸桿菌培養擴增後提取質粒，純化後溶於生理鹽水或含有不同佐劑的生理鹽水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
一種對哺乳類動物進行性別控制的蛋白疫苗，其特徵在於該疫苗由純化的某種哺乳動物的SRY蛋白與佐劑組成。
上述蛋白疫苗是人工合成的或者通過生物體生產而成的蛋白質。
上述核酸疫苗是通過通過以下方法之一得到方法一通過分子克隆的方法獲得某種哺乳動物的SRY蛋白編碼cDNA，將其插入到原核或真核表達質粒中，將該重組質粒轉化或轉染到原核或真核細胞中，以細胞內或分泌的形式表達SRY蛋白，以生物化學的方法收集所表達的蛋白並進行純化，然後溶於生理鹽水或含有不同佐劑的生理鹽水中，得到所需要的SRY蛋白疫苗。
方法二用生物化學的方法從雄性哺乳動物組織中直接分離。
上述的對哺乳類動物進行性別控制的核酸疫苗的使用方法是以注射、噴射、口服的方式經鼻、眼、生殖道、腸道通過滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述疫苗進行機體；或者是上述疫苗被其它物質包裹或混合後進入機體。
具體實施例方式
藉助以下實施例對本發明作進一步描述。
下面這些實施例是示範性的，而不是限制性的，可根據上述發明的技術方案和試劑情況，來確定具體的實施方式。
一、小鼠SRY核酸疫苗的製備及免疫1、材料與方法菌株與質粒大腸桿菌DH5α和HB101、質粒pVAX1和pSecTag為Invitrogen公司產品，pMD18-T質粒為Takara公司產品。
實驗動物6-8周齡的BALB/C小鼠，重18-20g，購自北京實驗動物中心。
主要試劑各種限制性內切酶、DNA修飾酶、mRNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自Takara公司，陽離子脂質體轉染試劑盒購自Invitrogen公司，羊抗鼠IgG-HRP、BSA、SDS、ELISA板均購自華美公司。
2、表達載體pVAX-SRY的構建和鑑定1)、獲得SRY蛋白基因ORF的編碼cDNAmRNA提取使雌性小鼠與雄性小鼠同籠，在交配後第11天將雌鼠拉頸處死，從子宮中衝出胚胎，收集胚胎並進行勻漿，然後按mRNA提取試劑盒操作要求進行操作，獲得mRNA。
cDNA合成及擴增設計以下引物(上遊引物5』atggagggccatgtcaagcgccccatgaatgcatt 3』，下遊引物5’tcatgagactgccaaccacagggctgtgctgaggt 3』)，按RT-PCR試劑盒操作要求進行操作，獲得長度為1188bp的SRY蛋白基因ORF的cDNA，並將其克隆到pMD18-T質粒中，得到克隆載體pMD-SRY。
2)、質粒pVAX-SRY的構建酶切pMD-SRY用內切酶Pst I和Xba I雙酶切質粒pMD-SRY，分離並純化SRY cDNA。
酶切pVAX1用內切酶Pst I和Xba I雙酶切質粒pVAX1並純化。
連接反應建立連接酶反應體系，將SRY cDNA克隆到質粒pVAX1中。
轉化並篩選重組子將重組子轉化到感受態的E.coli DH5α中，用卡那黴素篩選獲得陽性克隆，並進行酶切鑑定。
3、重組質粒pVAX-SRY在真核細胞中的瞬時表達復甦Hela細胞，用RPM1640-20％FBS培養液傳代培養，將細胞濃度調整為4×105/ml，將純化好的質粒pVAX-SRY用脂質體轉染法轉染Hela細胞，更換培養液後繼續培養32小時，然後收穫細胞，按常規免疫印跡(Western blotting)法，觀察是否表達了SRY蛋白。
4、SRY核酸疫苗的製備和動物免疫按常規方法對含有質粒pVAX-SRY的菌株進行大量培養並提取質粒，溶入生理鹽水中，測定OD260和OD280值，按1OD＝50μgDNA/ml進行計算，將質粒溶液濃度調定為1mg/ml。
將25隻雌性BALB/C小鼠分為四組pVAX1肌注組、pVAX-SRY肌注組、pVAX1陰道組、pVAX-SRY陰道組、陰性對照組，分別進行免疫，每組5隻。其中對於肌注組，每次免疫前24小時在後腿股四頭肌內注射0.25％普魯卡因50μl，免疫時注射質粒溶液50μl，其後於初免後第3周和第7周各加強免疫一次。對於陰道組，免疫時向陰道內滴加質粒溶液50μl，其後於初免後第3周和第7周各加強免疫一次。對各組在免疫前及初次免疫後的第1、3、4、7、9周時由眼眶靜脈採血分離血清，採用ELISA法檢測血清抗SRY蛋白的效價。
5、生育實驗及性別控制效果的驗證在各組鼠籠中分別放入一隻成年雄鼠，檢查雌鼠陰拴出現後移出雄鼠，待雌鼠生產後檢查仔鼠性別，並與陰性對照組進行比較。
二、小鼠SRY蛋白疫苗的製備及免疫1、SRY蛋白製備1)、質粒pSecTag-SRY的構建酶切pMD-SRY用內切酶Ecor I和Not I雙酶切質粒pMD-SRY，分離並純化SRY cDNA。
酶切pVAX1用內切酶Ecor I和Not I雙酶切質粒pSecTag並純化。
連接反應建立連接酶反應體系，將SRY cDNA克隆到質粒pSecTag中。
轉化並篩選重組子將重組子轉化到感受態的E.coli DH5α中，用氨苄青黴素篩選獲得陽性克隆，並進行酶切鑑定。
2)、SRY蛋白的表達及回收和純化復甦SKBR-3細胞，經5代傳代培養，將細胞濃度調整為2×106/ml，將純化好的質粒pSecTag-SRY用脂質體轉染法轉染SKBR-3細胞，繼續培養96小時，將培養液離心，回收上清，在高壓液相層析(HPLC)上柱洗脫，收集47.5kDa蛋白峰。
2、動物免疫1)將SRY蛋白與弗氏完全佐劑充分混合、乳化備用。
2)將15隻雌性BALB/C小鼠分三兩組皮下注射組、陰道滴加組、陰性對照組，分別進行免疫，每組5隻。兩組都於初免後第3周和第7周各加強免疫一次。對各組在免疫前及初次免疫後的第1、3、4、7、9周時由眼眶靜脈採血分離血清，採用ELISA法檢測血清抗SRY抗體的效價。
3、生育實驗及性別控制效果的驗證在各組鼠籠中分別放入一隻成年雄鼠，檢查雌鼠陰拴出現後移出雄鼠，待雌鼠生產後檢查仔鼠性別，並與陰性對照組進行比較。
權利要求
1.一種基於SRY基因的哺乳動物生雌性控方法，其特徵在於使用以SRY蛋白為靶抗原的疫苗免疫雌性動物或以SRY蛋白為靶抗原對動物進行免疫，獲得能特異識別SRY蛋白的免疫物質，在體外或體內處理胚胎。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於使用以SRY蛋白為靶抗原的核酸疫苗或蛋白質疫苗免疫動物；或製備抗SRY抗血清或抗SRY抗體或抗SRY單克隆抗體等免疫物質，將其加入胚胎培養液中作用於胚胎，或將其置入雌性動物子宮中作用於胚胎。
3.一種如權利要求1所述的對哺乳類動物進行性別控制的核酸疫苗，其特徵在於該疫苗以真核表達載體為基本骨架，同時含有某種哺乳動物的SRY蛋白編碼cDNA。
4.如權利要求3所述的核酸疫苗，其特徵在於該核酸疫苗是人工合成的或者通過生物體生產而成的DNA質粒。
5.如權利要求3或4所述的核酸疫苗，其特徵在於該疫苗通過以下方法得到通過分子克隆的方法獲得某種哺乳動物的SRY cDNA，將其插入到真核表達質粒中得到重組質粒並轉化到大腸桿菌中，用真核細胞瞬時表達的方法確認該重組質粒可以表達SRY蛋白，經大腸桿菌培養擴增後提取質粒，純化後溶於生理鹽水或含有不同佐劑的生理鹽水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
6.一種如權利要求3或4或5所述的核酸疫苗的生產方法，其特徵在於該生產方法是通過分子克隆的方法獲得某種哺乳動物的SRY cDNA，將其插入到真核表達質粒中得到重組質粒並轉化到大腸桿菌中，用真核細胞瞬時表達的方法確認該重組質粒可以表達SRY蛋白，經大腸桿菌培養擴增後提取質粒，純化後溶於生理鹽水或含有不同佐劑的生理鹽水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
7.一種如權利要求1所述的對哺乳類動物進行性別控制的蛋白疫苗，其特徵在於該疫苗由純化的某種哺乳動物的SRY蛋白與佐劑組成。
8.如權利要求7所述的蛋白疫苗，其特徵在於該疫苗是人工合成的或者通過生物體生產而成的蛋白質。
9.如權利要求7或8所述的蛋白疫苗，其特徵在於該疫苗通過以下方法之一得到方法一通過分子克隆的方法獲得某種哺乳動物的SRY cDNA，將其插入到原核或真核表達質粒中，將該重組質粒轉化或轉染到原核或真核細胞中，以細胞內或分泌的形式表達SRY蛋白，以生物化學的方法收集所表達的蛋白並進行純化，然後溶於生理鹽水或含有不同佐劑的生理鹽水中，得到所需要的SRY蛋白疫苗。方法二用生物化學的方法從雄性哺乳動物組織中直接分離。
10.一種如權利要求3或4或5或6或7或8或9所述的疫苗的使用方法，其特徵在於該使用方法是以注射、噴射、口服的方式經鼻、眼、生殖道、腸道通過滲透、吸收、物理或化學介導的方法使上述疫苗進入機體；或者是上述疫苗被其它物質包裹或混合後進入機體。
全文摘要
本發明涉及一種基於SRY基因的對哺乳類動物進行生雌性控的方法，其特徵在於使用以SRY蛋白為靶抗原的疫苗免疫雌性動物，誘導其對SRY蛋白產生特異性免疫反應。在生殖過程中，母體內免疫系統能特異性識別表達SRY蛋白的雄性胚胎，並通過細胞毒作用等方式清除或損傷雄性胚胎，但對雌性胚胎不產生影響；或使用抗SRY抗血清、抗SRY抗體或抗SRY的單克隆抗體在體外或體內處理胚胎，殺死雄性胚胎或阻滯其發育，從而達到生雌性控的目的。本發明所使用的疫苗可以是核酸疫苗，也可以是蛋白疫苗，本發明同時也涉及這兩類疫苗的製備、生產和使用技術。
文檔編號A61P15/00GK1623604SQ200410032070
公開日2005年6月8日 申請日期2004年4月1日 優先權日2004年4月1日
發明者魏宏泉, 許越琰 申請人:魏宏泉, 許越琰