使用質譜分析法分析脂質的方法與流程

2023-05-29 14:55:11 1

本申請案主張2014年6月13日申請的美國臨時申請案第62/012,257號的優先權益，所述臨時申請案的全部內容以引用的方式併入本文。

技術領域

本發明大體上涉及質譜分析法，且更明確地說，涉及用於分析脂質的方法和設備，所述對脂質的分析涉及異構脂質的檢測和/或脂質分子內的雙鍵位置。

背景技術：

質譜分析法(MS)是一種用於對有機化合物進行量化和結構分析的重要手段。已開發高等技術以在檢測之前通過在質譜儀或串聯質譜儀(MS/MS)內將分子解離成較小碎片來分析較大和較複雜的分子。對碎片的分析可提供詳細的結構信息，所述信息不可通過檢驗完整的分子獲得。已開發各種技術用於誘發解離。一個早期的實例是碰撞誘導解離(CID)，其中使樣本離子與氣體原子或分子接觸以誘發解離。另一實例是電子捕獲解離(ECD)，其中使樣本分子與具有動能約0電子伏(eV)到約3eV的電子接觸(對於具有動能大於約5eV到約10eV的電子，也稱為「熱」ECD(HECD))。在ECD中，在樣本離子捕獲電子及在捕獲位點處發生電荷中和時，樣本離子被碎片化，從而產生發生鍵斷裂的激發基物質(excited radical species)。ECD已經調適以通過增大電子動能到3eV以上來分析較小帶電離子，稱為電子誘導解離(EID)。其它已報告的解離技術包含使用試劑的電子轉移解離(ETD)和使用具有動能大於3eV的電子的電子脫離解離(EDD)。也可利用質子轉移反應(PTR)來降低離子的電荷態，其中質子從一種帶電物質轉移到另一帶電物質。

解離技術經論證非常適用於有機化合物的MS分析，所述有機化合物包含例如肽、蛋白質、聚糖和翻譯後修飾肽/蛋白質等生物分子物質。然而，對於某些類型的分子樣本和其結構細節的MS分析仍然有大量的限制。舉例來說，傳統質譜分析法技術有時不足以區別一份樣本中的兩種或更多種異構物質。此類信息通常較重要，因為且不管異構物質的結構類似性，所述異構物質的生物活性可發生大幅度變化。此外，特定異構體的存在和/或異構體的相對豐度對於醫療診斷可能較重要。舉例來說，區域異構體是含有相同核心結構和側鏈的分子，但側鏈可布置在多於一個的位置中。某些區域異構體可充當疾病的重要生物標記且/或基於(例如)組織中的各種區域異構體(即，大腦與腎臟)的相對豐度來提供關於深層生物分子活動的信息。然而，常規的基於MS的技術不能夠產生具有充足的信息和經降低的複雜度的質譜以允許分辨許多區域異構體樣本的異構物質。

說明性區域異構體樣本涉及兩種最常見的磷脂醯膽鹼(PC)：區域異構體1-棕櫚醯-2-油醯-sn-磷脂醯膽鹼(POPC)和1-油醯-2-棕櫚醯-sn-磷脂醯膽鹼(OPPC)。

雖然MS/MS的正模式和負模式均已展示有希望基於存在於POPC和OPPC的MS/MS碎片化譜中的診斷性碎片離子來個別地量化POPC和OPPC，但仍然難以量化含有兩種異構體的混合物中的特定物質，因為所述兩種異構體的碎片化行為基本上相同。此外，當前沒有色譜分離可用。實際上，當OPPC和POPC均存在時，其MS/MS碎片化譜經卷積使得這些脂質區域異構體通常以串聯方式分析和量化(即，不列出每一特定異構體的豐度)。類似地，許多其它異構脂質(包括(但不限於)三醯甘油(TAG)和二醯基甘油(DG))在存在於混合物中時也難以個別地量化。

在另一實例中，MS和/或MS/MS技術能夠產生允許確定脂質的類別、碳鏈長和不飽和度(即，雙鍵)的譜。然而，仍然難以實現對樣本分子內的實際碳-碳雙鍵位置的確定。雙鍵的數目和位置可顯著影響對分子的化學反應性或醫療重要性的理解。使用MS識別分子中的雙鍵的數目和位置的一種技術涉及臭氧誘導解離(OzID)，其涉及臭氧與樣本分子反應而以特定特徵方式裂解碳-碳雙鍵。然而，在某些分析性條件下，OzID可能需要手動幹預和先驗了解樣本分子中的碳-碳雙鍵的存在。已使用高能CID來確定脂質分子內的雙鍵位置。然而，實際上難以採用CID，因為所述技術並不能夠有效地產生診斷性碎片離子。由此，從所得譜確定雙鍵位置的可信度不足以使所述分析在分析上適用。

因此，仍需要經改善的對異構脂質的量化，伴以經增強的對物質之間的區別，且需要簡單確信地確定有效MS或MS/MS工作流中的雙鍵位置的能力。

技術實現要素：

根據申請人的當前教示內容的設備、系統和方法允許使用質譜分析法對分析性樣本中的脂質進行分析，包含確定脂質的異構混合物內的異構物質和脂質分子內的雙鍵位置。分析性樣本中的離子化脂質分子可通過使所述離子化脂質分子與質譜儀的反應裝置內的電子(即，電子束)接觸而經歷解離反應以形成所述脂質分子的各種碎片。所述電子可具有約4電子伏(eV)到約12eV的動能。可通過質譜儀的檢測器檢測碎片以產生針對分析性樣本的譜。由根據申請人的當前教示內容的解離反應產生的碎片尤其有助於辨別包含異構體的混合物的分析性樣本中的脂質異構體及確定所述分析性樣本中的脂質分子的雙鍵的位置。

根據一個方面，申請人的教示內容中的某些實施例涉及一種用於分析樣本的方法。根據所述方法，一份(例如)含有或疑似含有多種脂質異構體的樣本可經離子化以便形成一或多種脂質離子。所述方法還可包含對脂質離子進行分離。在一些實施例中，脂質離子可經傳輸穿過微分遷移譜儀以發生分離。

在一些方面，將樣本離子化可包含使樣本與陽離子化試劑反應。舉例來說，陽離子化試劑可包含鈉、鉀銀和鋰中的任一者的鹽。在另一實例中，將樣本離子化可包括使樣本與銀和鋰中的一者反應。

在各個方面中，脂質異構體可選自包括脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、糖脂(saccharolipids)、聚酮化合物、固醇脂、孕烯醇酮脂(prenol lipids)、PC、OPPC和POPC的群組。在一些方面，脂質異構體的醯基或烷基鏈可包含至少一個雙鍵(即，不飽和碳)。

根據申請人的當前教示內容的各個方面，某些實施例涉及一種質譜分析法方法，包括將包括多種異構脂質的樣本曝露於陽離子化試劑，以便穩定所述多種異構脂質的構形。所述方法可進一步包括將所述經穩定的異構脂質傳輸穿過離子遷移譜儀以便實行所述多種一或多種經穩定的異構脂質的分離。

在一些實施例中，一種使用質譜儀分析樣本(例如，含有或疑似含有至少一種脂質的樣本)的方法可包含：將所述樣本離子化以形成多種前體離子；執行離子-電子反應以將所述多種前體離子的至少一部分碎片化為多種碎片離子，所述離子-電子反應包括利用帶電物質來輻照所述多種前體離子以使脂質的兩種異構形式(如果存在於樣本中)碎片化成碎片離子，使得與一種異構體相關聯的碎片化模式不同於與另一異構體相關聯的碎片化模式；及在質譜儀的檢測器處檢測所述多中碎片離子的至少一部分以形成至少一個用於所述樣本的質量分析的質譜。

在一些實施例中，一種使用質譜儀分析含有或疑似含有至少一種脂質的樣本的方法可包含：將樣本離子化以形成多種單電荷前體離子物質；執行離子-電子反應以將所述多種前體離子物質的至少一部分碎片化成多種產物離子物質，所述離子-電子反應包括利用具有約4eV到約12eV的動能的電子來輻照所述多種產物離子；及在質譜儀的檢測器處檢測所述多種產物離子物質的至少一部分以形成至少一個用於所述樣本的質量分析的質譜。

在各個方面中，所述電子可具有約3eV、4eV、約5eV、約6eV、約7eV、約8eV、約9eV、約10eV、約11eV、約12eV、約13eV、約14eV、約15eV、約16eV、約17eV、約18eV、約19eV、約20eV和任何在這些值的任何兩者之間(包含端點)的值或範圍的動能。在各個方面中，所述電子可具有約4eV到約12eV的動能。在一些方面中，所述電子可具有約5eV到約8eV的動能。

在一些實施例中，所述離子-電子反應可包含電子捕獲解離(ECD)、熱電子捕獲解離(HECD)、電子轉移解離(ETD)、電子電離解離(EID)、有機物中的電子誘導離子激發(electron-induced excitation of ions in organics，EIEIO)和電子脫離解離(EDD)。在EIEIO中，雖然無電子捕獲事件發生，但分析物離子(通常為單電荷)經歷電激發和振動激發，從而引起有區別的碎片離子形成。在一些實施例中，所述離子-電子反應可以流通(flow-through)模式或捕獲(trapping)模式實施。在一些實施例中，所述離子-電子反應可發生在傅立葉變換離子迴旋共振單元、數字保羅阱(Paul trap)、線性離子阱和嵌合體阱(Chimera trap)中(如以下本文所描述)。

在各個方面中，根據申請人的當前教示內容的分析樣本的方法可產生針對樣本內的分子的譜。經分析的脂質的雙鍵可根據所述多種碎片離子的間距指示在所述譜上。在各個方面中，14原子質量單位(amu)間距可指示單鍵，且12amu間距可指示雙鍵。

在各個方面中，根據申請人的當前教示內容的分析樣本的方法可產生允許確定異構物質的譜。舉例來說，所述譜可展示異構物質的特有碎片的相對密度。所述相對密度可指示所述異構物質的相對豐度。

在各個方面中，所述多種碎片離子可包含自由基碎片和非自由基碎片。在一些方面中，對於分子上的每一解離位點，對應的自由基碎片和非自由基碎片可在根據一些實施方案所產生的譜上成對顯現。

在各個方面中，可引入氣體來與所述經碎片化的脂質分子的自由基碎片反應。在一些實施例中，所述氣體可包含氧、氮或氦。在一些實施例中，所述氣體可引入於所述離子-電子反應裝置內。在一些實施例中，所述氣體可在所述離子-電子反應裝置的下遊引入。在一些實施例中，所述氣體可引入約1毫秒到約100毫秒。

在各個方面中，在譜上，與所述氣體反應的碎片可顯現為氣體自由基碎片波峰。舉例來說，在所述氣體為氧的實施例中，與氧反應的碎片可顯現為氧自由基碎片波峰。氧自由基碎片波峰可與經移位32amu(對應於結合碎片的+O2)的未反應碎片的波峰對應。在各個方面中，其它氣體類型將基於其特定特性展現對應的amu移位。氧自由基碎片波峰可指示脂質分子中的哪些碎片為自由基。在各個方面中，氧自由基碎片特徵曲線可顯現為在經分析的脂質分子的雙鍵位置處分割的波峰。在各個方面中，氧自由基碎片特徵曲線可用作在質量分析的譜上所指示的雙鍵位置的冗餘檢查，所述質量分析中未引入氧氣。

在各個方面中，一種針對離子的反應設備可包含：第一路徑，其包括第一軸端和沿著第一中心軸與第一路徑軸端相隔一定距離安置的第二軸端；第二路徑，其包括第一軸端和沿著第二中心軸與第二路徑的第一軸端相隔一定距離安置的第二軸端，所述第一和第二中心軸大體上彼此正交且具有相交點；第一組四極杆電極，其以圍繞所述第一中心軸的四極杆定向布置且安置在所述第一路徑的所述第一軸端與所述相交點之間，所述第一組電極用於沿著所述第一中心軸的第一部分導引離子；第二組四極杆電極，其以圍繞所述第一中心軸的四極杆定向布置且安置在所述第一路徑的所述第二軸端與所述相交點之間，所述第二組電極用於沿著所述第一中心軸的第二部分導引離子，所述第一組電極與所述第二組電極隔開以便形成橫向於所述第一中心軸的空隙；電壓源，其用於將RF電壓提供到所述第一和第二組電極以產生RF場；控制器，其用於控制所述RF電壓；脂質離子源，其安置於或接近於所述路徑的第一或第二軸端處，所述第一路徑的第一或第二軸端用於沿著第一中心軸朝向所述第一路徑的所述第一或第二軸端中的另一者引入脂質離子；以及帶電物質源，其安置於或接近於所述第二路徑的第一或第二軸端處，所述第二路徑的第一或第二軸端用於沿著所述第二中心軸引入具有動能約4電子伏到約12電子伏的電子，所述帶電物質通過所述空隙朝向所述相交點行進。

申請人的教示內容中的這些和其它特徵闡述於本文中。

附圖說明

所屬領域的技術人員將理解，以下描述的圖式僅出於說明的目的。所述圖式並不希望以任何方式限制申請人的教示內容的範圍。

圖1描繪本發明的一實施例的實施方案的示意圖。

圖2描繪根據本發明的一實施例的橫截面圖。

圖3A描繪圖2的沿著線I-I的橫截面圖。

圖3B描繪圖2的沿著線II-II的橫截面圖。

圖4描繪根據本發明的一實施例的電子注射的實例的簡化側視圖。

圖5描繪針對根據申請人的教示內容的各種實施例的方面而解離且隨後檢測的脂質物質的數據。

圖6描繪針對根據申請人的教示內容的各種實施例的方面而從POPC分子解離且隨後檢測的烷基鏈碎片(碎片離子)的數據。

圖7描繪針對根據申請人的教示內容的各種實施例的方面在檢測之前具有及沒有自由基碎片與氧氣反應的情況下經解離且隨後檢測的POPC樣本的數據。

圖8描繪針對根據申請人的教示內容的各種實施例的方面而解離且隨後檢測的POPC和OPPC混合物的數據。

圖9描繪其中可根據申請人的教示內容的各種實施例執行磷脂識別的方式。

具體實施方式

應了解，為了清楚起見，以下討論將闡明申請人的教示內容的實施例的各個方面，同時，每當方便或適宜省略某些具體細節時便省略某些具體細節。舉例來說，在替代實施例中，相同或類似特徵的論述可以略微簡化。為簡潔起見，眾所周知的構想或概念也可不進行任何詳細論述。所屬領域的技術人員應認識到，申請人的教示內容中的一些實施例可能不需要每個實施方案中特定地描述的某些細節，所述細節在本文經闡述僅為提供對所述實施例的徹底理解。類似地，很明顯，可在不脫離本發明的範疇的情況下易於根據公共常識對所描述的實施例進行更改或變化。實施例的以下詳細描述不應視為以任何方式限制申請人的教示內容的範圍。

本文提供用於將分析性樣本的脂質離子(「前體離子」)解離成碎片(「碎片離子」)及對所述碎片進行分析的方法和系統。根據申請人的教示內容的各個方面，所述方法和系統可實現將分析性樣本的脂質離子碎片化成碎片離子，所述碎片離子可表達於MS譜上，所述MS譜允許詳細確定前體離子的化學結構，而這可能難以通過常規的MS技術實現。在各個方面中，根據申請人的教示內容的方法和系統可使質譜儀能夠解析樣品的異構脂質(例如POPC和OPPC)和/或樣本內的脂質分子的雙鍵的位置，所有均作為非限制性實例。

參考圖1，描繪經配置以執行一些實施例的各個方面的離子反應單元的通用示意圖。如下文所論述，所述離子反應單元可根據本教示內容併入質譜儀內。如圖1中所展示，離子反應單元1可具有作為輸入的一系列反應物，包含離子2和帶電物質3。離子2可為帶正電荷(陽離子)或負電荷(陰離子)的任何離子。可採用多種不同類型的離子2來源。合適的離子源的一些實例尤其包含(但不限於)電噴霧電離(ESI)源、解吸電噴霧電離(DESI)源或聲波噴霧電離(SSI)源、大氣壓化學電離(APCI)源、基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)源和化學電離(CI)源。在一些實施例中，離子2可在被注入離子反應單元1中之前(例如)使用四極杆質量選擇裝置進行質量選擇。

帶電物質3可為帶正電荷或帶負電荷的電子或離子。當所述帶電物質為電子時，電子源可為例如鎢絲或鍍釷鎢絲等燈絲或例如Y2O3陰極等其它電子源。所述反應裝置可填充有冷卻氣體，例如氦(He)或氮(N2)。所述冷卻氣體的典型壓力可在10-2到10-4託之間。

在離子反應單元1內部，離子2和帶電物質3相互作用。取決於所利用反應物的性質，所述相互作用可致使引起產物離子(碎片離子)5的形成的數個現象發生。依據情形指示，產物離子5可接著連同潛在的其它未反應的離子2和/或可能帶電的物質3一起從離子反應單元1提取出或噴出。所提取的產物離子5可被導引到質量分析器6。質量分析器6可包含多種元件，包含用於檢測離子且產生用於獲得產物離子5的質譜的信息的檢測器。可使用所屬領域中已知的多種質量分析器。合適的質量分析器的實例為四極杆飛行時間質譜儀或其串聯配置。

根據申請人的教示內容的各個方面，上文參考圖1所論述得示範性系統可用於分析樣本內所含有的一或多種離子化異構脂質。根據本教示內容的某些方面，樣本內含有的脂質分子(M)可(例如)通過使脂質分子與陽離子化試劑(X+)反應而加以離子化，以便形成陽離子化脂質分子([M+X]+)。作為舉例，所述脂質分子可經質子化以便形成質子化脂質分子([M+H]+)。作為替代方案，陽離子化脂質分子可通過將脂質分子與金屬離子(例如鈉、鉀、銀或鋰)相關聯而形成，以便分別產生例如[M+Na]+、[M+K]+、[M+Ag]+和[M+Li]+等陽離子化脂質金屬離子加合物(均作為非限制性實例)。根據本教示內容的某些方面，樣本內所含有的脂質分子(M)可(例如)通過去質子化技術加以離子化，以便形成陰離子化脂質分子([M+H]-)。因此，在一些實施例中，離子2可包含陽離子。在一些實施例中，離子2可包含陰離子。在一些實施例中，離子2可包含單電荷離子。

在一些實施例中，離子2可包含陽離子，且帶電物質3為電子。因此，陽離子可捕獲電子且進行電子解離，其中離子2與帶電物質3之間的相互作用引起產物離子(碎片離子)5的形成，所述產物離子為初始離子2的碎片。在一些實施例中，離子2可包含陰離子，且帶電物質3為電子。陰離子可捕獲電子且進行電子解離，其中離子2與帶電物質3之間的相互作用引起產物離子(碎片離子)5的形成，所述產物離子為初始離子2的碎片。從所述離子反應單元噴出的物質流可包含離子2或產物離子5或(在一些情況下)帶電物質3中的一或多種或其混合物。

在一些實施例中，離子反應單元1中的離子-電子反應可包含電子捕獲解離(ECD)、熱電子捕獲解離(HECD)、電子轉移解離(ETD)、電子電離解離(EID)、有機物中的電子誘導激發(EIEIO)和電子脫離解離(EDD)。在一些實施例中，可使用EIEIO，其中電子碰撞可誘發分子內部狀態的電激發和振動激發，從而產生解離。此外，在EIEIO中，電子未由前體離子2捕獲，且由此，EIEIO可應用於單電荷分子。例如ECD等常規的解離技術可能僅應用於多電荷前體離子。然而，根據申請人的教示內容，EID和EIEIO可應用於從所述樣本產生的單電荷前體離子。

在一些實施例中，離子反應單元1可配置為傅立葉變換離子迴旋共振單元、數字保羅阱、線性離子阱、嵌合體阱，或任何其它類型的經配置以促進帶電離子物質相互作用的裝置或阱。

在一些實施例中，帶電物質3為電子。在各個方面中，所述電子可具有約3eV、4eV、約5eV、約6eV、約7eV、約8eV、約9eV、約10eV、約11eV、約12eV、約13eV、約14eV、約15eV、約16eV、約17eV、約18eV、約19eV、約20eV和任何在這些值的任何兩者之間(包含端點)的值或範圍的動能。在各個方面中，所述電子可具有約4eV到約12eV的動能。在一些方面中，所述電子可具有約5eV到約8eV的動能。

根據申請人的教示內容的各個方面，用於將前體離子解離成碎片的所述電子的動能為約4eV到約12eV。優選地，用於將前體離子解離成碎片的所述電子的動能為約5eV到約8eV。對於某些類型的脂質分子，使用具有約4eV到約12eV的動能的電子的EID或EIEIO產生有助於確定其結構細節(包含雙鍵位置)的碎片。如果所述電子的動能低於約3eV，那麼會觀測到不充分的解離。如果所述電子的動能大於約12eV，那麼解離的增加和所得碎片產生難以分析且不產生具有充分可信度的結果的譜。

出人意料地，且如下文更詳細地描述，對使用具有約4eV到約12eV(且具體來說，約5eV到約8eV)的動能的電子的電子解離的使用可碎片化脂質分子以允許根據本文中的教示內容確定分子內的異構物質和/或雙鍵位置。

現參考圖2，描繪根據本發明的一實施例的一方面經配置以解離離子2的離子反應設備10(「嵌合體」阱)的側視圖。出於非限制性和說明性目的，離子反應設備10僅提供為能夠根據本教示內容解離離子的任何離子反應設備和/或離子反應單元。

在圖2中，展示為剪截面的離子反應設備10包含外圓柱形殼體29和環繞第一路徑11的內圓柱形殼體30，所述第一路徑具有第一中心軸12和第一軸端13以及第二軸端14。此路徑向離子2提供進入離子反應設備10的路徑。柵電極15、16位於第一路徑11的每一端處。柵電極15允許離子2進入設備10且柵電極16控制未反應的離子2或產物離子(碎片離子5)從設備10噴出。柵電極不必直接位於軸端處，而可恰好位於外部接近於所述軸端。如將了解，歸因於所述裝置的對稱性質，如果周圍離子傳輸裝置經恰當地配置，那麼所述離子的方向可通過離子2通過柵電極16進入且通過柵電極15離開而得以逆轉。設備10可包含安裝到內圓柱形殼體30的第一組四極杆電極17，電極17以四極杆型布置被布置在第一中心軸12周圍。雖然此處特定地實施四極杆，但也可利用任何多極杆的布置，包含六極杆、八極杆等。在所述圖中，僅描繪四個四極杆電極中的兩個，因為另外兩個電極位於所描繪的電極的正後方。四極杆電極17中所描繪的兩個電極中的電極具有相反極性。這些第一組四極杆電極17連接到射頻(RF)電壓源70和控制器72，所述控制器用來控制所述電壓源以將RF電壓提供到所述電極以產生RF場，所述RF場可將離子2朝向第一中心軸12(所述四極杆的中點)導引。所述控制器可包含合適的硬體和軟體，且或者如所屬領域中已知的經配置以將合適的信號施加到電壓源以供對所述電極施加所要電壓。

也安裝到內圓柱形殼體30的第二組四極杆電極18(僅描繪兩個，因為另外兩個位於四極杆電極18的正後方)位於與第一組四極杆電極17稍微有一定距離之處，所述距離在第一組電極17和第二組電極18之間形成基本上為圓筒形的空隙19。第一四極杆17和第二四極杆18共享相同中心軸12，且第一組四極杆17的杆與第二組四極杆18成一直線。第一四極杆17和第二四極杆18之間的空隙19中可產生四極場。此第二組四極杆電極18還附接到RF電壓源74和控制器76，所述控制器用來控制所述電壓源以將RF電壓提供到所述電極以產生RF場，所述RF場可用來將離子2和/或產物離子5朝向中心軸12(第二組四極杆電極18的中點)導引。所述內、外圓柱形殼體具有用於插入第二路徑20的切口，所述第二路徑具有第二中心軸21，所述中心軸具有第一軸端22和第二軸端23。此第二路徑20提供用於將帶電物質3傳輸到設備10中的路徑。第一和第二路徑大體上彼此正交，且會合於相交點24，此相交點在沿著第一中心軸12和第二中心軸21之處。

較易於描繪於圖3A和3B(其為分別沿著圖2的線I-I和II-II截取的橫截面圖)中，第一組四極杆電極17中的四個電極中的每一者可與第二組電極18中的四個電極中的一者配對，例如，其中每一電極對中的每一電極25a、25b分別具有相反極性且跨越電極對中的另一電極25b、25a的相交點直接相對。具有電極26a、26b的電極對存在類似關係。相同關係適用於第一組電極17中其餘的兩個與第二組電極18中的其餘的兩個電極配對的電極。所述電極的此定向使產生於相交點24與第二路徑20的第一軸端22之間的RF場與產生於相交點24與第二路徑20的第二軸端23之間的RF場呈逆相。因為所述電極的此配置，所以中心軸21上不存在RF場。第二路徑20的第一軸端22含有電子燈絲27或使所述電子燈絲與其接近，所述電子燈絲將用於產生用於發射到朝向相交點24的第二路徑20中的電子。第一軸端22也可含有合適的電極柵28或使所述電極柵與其接近，所述合適的電極柵用於控制電子進入設備10的入口。例如永久磁體等磁場源(未展示)可經配置以實施平行於第二路徑20的磁場。此磁場在實施其中帶電物質為電子的ECD、熱ECD、EID、EDD、EIEIO和負ECD時適用。應用於四極杆的RF頻率可在約400kHz到1.2MHz的範圍內，RF頻率優選地為大約800kHz。

根據本教示內容的某些方面，離子反應設備10(「嵌合體」阱)可與連接到氣體源(未展示)的氣體容器成流體連通關係且/或位於所述氣體容器內。氣體的非限制性實例包含氧、氮和氫。雖然氧氣可在此用作實例，但實施例不受如此限制，因為所述氣體可為能夠根據一些實施方案操作的任何類型的氣體。在各個方面中，可引入氧氣以與離子反應設備10內所產生的產物離子的自由基碎片反應。舉例來說，自由基碎片[fragment●]+可與所述氧氣反應以產生含氧碎片[fragment●+O2]+。在一些實施例中，氧氣流可由所屬領域的技術人員已知的脈衝閥控制。在一些實施例中，可對所述氧氣施以脈衝約1毫秒到約100毫秒。在一替代實施例中，可在離子反應設備10的下遊例如在所述質譜儀的離子阱中引入所述氧氣。所述氧自由基碎片反應可通過脈衝閥和/或通過離子反應設備10內的某一電壓和/或下遊裝置予以控制，以控制所述碎片穿過所述氧氣的行進時間。舉例來說，穿過離子阱的行進時間可使用線性加速度(LINAC)電壓予以控制。在不需要氧自由基碎片反應的實例中，可通過施加高LINAC電壓實施快速提取或行進時間。在需要促進氧自由基碎片反應的替代實例中，可通過施加低(或無)LINAC電壓實施較慢提取或行進時間。

現參考圖4，展示呈離子反應裝置40的側視圖的另一實施例的描述，其中僅注入帶電物質3(確切地說，電子)。離子反應裝置40含有具有第一中心軸42的第一路徑41，路徑41具有第一軸端43和第二軸端44。電極柵45、46位於第一路徑41的每一端處，所述電極柵允許控制來自離子反應裝置40的離子的進入和噴出。設備40可包含通常為L形、圍繞第一中心軸42布置的第一組四極杆電極47。在圖4中，僅描繪四個四極杆電極中的兩個，另外兩個電極位於所描繪的電極的正後方。在四極杆電極47中所描繪的兩個電極中，電極具有相反極性。也通常為L形的第二組四極杆電極48(僅描繪兩個，另外兩個在正後方)位於與第一組四極杆電極47相距微小距離之處，所述距離在第一組47和第二組48電極之間形成穩固的基本上為圓筒形的空隙49。在四極杆電極48中所描繪的兩個電極中，電極具有相反極性。以上所描繪的第一組四極杆電極47和第二組四極杆電極48中的每一者中的電極在極性上與彼此相反。如所屬領域的技術人員應理解，每一組四極杆電極中未展示的兩個電極會具有與四極杆電極極性一致的極性，例如圖3A和3B中所展示的配置。

第二路徑50具有第二中心軸51，所述第二中心軸具有第一軸端52和第二軸端53。此第二路徑提供用於將帶電物質傳輸到設備40中的路徑。所述電極的此定向使產生於(第一路徑41和第二路徑50的)相交點與第二路徑50的第一軸端52之間的RF場與產生於(第一路徑41和第二路徑50的)相交點與第二路徑50的第二軸端53之間的RF場呈逆相。第二路徑50的第一軸端52含有電子燈絲57或使所述電子燈絲定位於與其接近，所述電子燈絲將用於產生電子60以供發射到第二路徑50中。第一軸端52也可含有合適的電極柵58或使所述電極柵位於其附近且與其接近，以控制電子60進入設備40的入口。另一柵電極59呈現於或位於接近第二路徑50的第二軸端53之處。

磁場產生器(未展示)按便於產生平行於所述第二路徑的磁場的方式予以定位和定向。所述磁場的方向可從第一軸端52到第二軸端53或者反過來。此磁場在實施其中帶電物質為電子的ECD、熱ECD、EID、EDD、EIEIO和負ECD時適用。在其中所述帶電物質為試劑陰離子且包含(例如)所發生的反應為ETD反應的情形的一些實施例中，不需要所述磁場源和磁場。網格61可經定位以充當柵極來控制靠近或接近於電子燈絲57的電子60流。所述RF場使得在進入設備40時集中的電子60在接近第一路徑41與第二路徑50的相交點時變得分散。隨著電子60通過所述相交點，所述RF場的極性的逆轉使得電子60再次變得集中。這產生垂直於所述第一路徑的更均一的電子分布，且增大設備40中的離子-電子相互作用的機率，這也可產生更好的敏感度。所述電子束產生局部化的引力勢。

根據本教示內容，根據一些實施方案配置的反應設備可在各種操作模式中操作。在連續操作模式中，在一個端部將離子流連續地引入所述反應設備中，且將電子以與所述離子流正交的流的形式引入所述反應設備中。位於離子路徑和電子路徑兩者的入口和出口處的柵極連續地開放。在離子與電子相互作用之後，所述離子中的一些即刻進行EID或EIEIO且碎片化。接著連續地從所述反應設備提取包含碎片化部分的產物離子以及未碎片化的前體離子以供隨後使用離子檢測器進行處理和分析。

在半連續模式中，所述設備經配置使得所述離子路徑的入口柵極連續地開放，而所述路徑的出口柵極在開放和閉合位置之間切換。所述電子路徑的入口柵極可連續地開啟。當所述離子路徑的出口柵極處於閉合位置時，離子不能夠通過所述出口柵極離開所述設備，且所述設備內發生離子積聚。以與傳入的離子流正交的方式連續地進入所述設備的電子在所述離子積聚時與其相互作用，所述離子中的一些發生EID或EIEIO，從而碎片化。一旦經歷足量時間，所述離子路徑的出口柵極則開啟以允許移除所述產物離子和積聚的未反應離子。這些離開的離子可接著使用離子檢測器在隨後階段中予以進一步處理和/或操控和/或進行分析。

在捕獲(「批量」)模式中，以一定方式利用所述設備，在所述方式中，所述入口和出口柵極按允許離子以非連續模式進入所述設備的方式進行操作。所述離子路徑的入口柵極開放，且所述離子路徑的出口柵極閉合，且離子經傳輸通過入口柵極進入所述設備。在此時間段期間，所述電子路徑的入口柵極閉合。一旦所述設備內積聚足量的離子，則所述離子路徑的入口柵極閉合，且所述電子路徑的入口柵極開啟以允許電子進入所述設備中，所述電子在設備中可與積聚的離子相互作用且引起解離反應(例如ECD、EID、EIEIO等)以碎片化所述離子。一旦所述反應經歷足夠的時間段，則所述電子入口柵極可閉合或所述電子束可關閉，且所述離子路徑的出口柵極開啟以允許提取可接著使用離子檢測器進行進一步處理和/或操控和/或分析的碎片化產物離子或未反應的前體離子。其中所述離子出口柵極閉合且其中所述離子與所述電子相互作用的持續時間可依據初始前體離子的電荷態而預先確定，或可基於經驗手動設置。

所述設備可整合成如所屬領域的技術人員已知的質譜儀或串聯質譜儀。本教示內容可併入其中的質譜儀的非限制性實例為四極杆飛行時間質譜儀。所述設備可用於分析使用本文描述的技術解離的不同類型的樣本，包含含有或疑似含有脂質分子的樣本。

實例

參考以下圖5到8中所呈現的實例和數據可更充分地理解申請人的教示內容，所述實例和數據通過分析根據本文中的教示內容的各個方面所解離的經解離碎片(即，碎片離子)來顯示對存在於樣本中的異構脂質和/或所分析的分子中的雙鍵位置的分析。從本說明書和本文所公開的本發明教示內容的實踐來考慮，申請人的教示內容的其他實施例對於所屬領域的技術人員來說將是顯而易見的。這些實例僅打算視為示範性的。

含有或疑似含有脂質的樣本(「樣本」)經離子化以產生單電荷前體離子。所述前體離子如下文較詳細論述經質量選擇且解離成碎片(碎片離子)。

實例1：確定雙鍵位置

參考圖5，樣本包含具有m/z約522amu的第一物質505和具有m/z約496amu的第二物質510的前體離子。可發現第一物質505和第二物質510為POPC樣本汙染物。所述前體離子經歷EIEIO，其致使碎片或碎片離子的形成。使用每一物質相應的譜515、520，從與299amu的m/z對應的波峰處開始對第一物質505和第二物質510中的每一者的烷基鏈進行重構。譜515、520中的箭頭表示非自由基物質，且箭頭+H(或+1)處的相鄰波峰指示自由基物質。所述自由基物質通過EIEIO產生，且所述非自由基物質通過H●損失反應形成。每一波峰由三個個體波峰組成：非自由基波峰、自由基波峰和(碳)C13波峰。

如譜520中所展示，觀測到關於第二物質510的14amu間距，指示所述烷基鏈並不具有任何雙鍵，這與第二物質510的已知結構相當。如譜515中所展示，觀測到一個12amu的間距，指示雙鍵的位置。所述雙鍵的此位置與第一物質505的已知結構相對應。

實例2：確定雙烷基鏈分子中的雙鍵位置(POPC)

圖6描繪含有使用EIEIO解離的POPC的樣本的譜。POPC含有兩個烷基鏈，其中的一者具有雙鍵。一個電子可解離烷基鏈中的一者。圖6中所描繪的所得EIEIO譜指示兩列碎片的存在。如果所述烷基鏈中不存在雙鍵，那麼對於自由基碎片和非自由基碎片兩者，所述譜特徵曲線將包含14amu間距。局部譜特徵曲線將包含針對所述自由基碎片和非自由基碎片的雙波峰。如果所述烷基鏈中存在雙鍵，那麼對於自由基碎片和非自由基碎片兩者，此位置處的間距將為12amu。如圖6中所描繪，在雙鍵位置處觀測到12amu間距。

實例3：氧氣與自由基碎片的反應

現參考圖7，其中描繪含有使用EIEIO解離以產生自由基碎片的POPC的樣本的譜。在第一譜705中，所述自由基碎片未與氧反應，且在第二譜710中，所述自由基碎片與氧氣反應以產生氧自由基碎片。氧可與使用本文描述的技術(包含EIEIO)解離的POPC烷基鏈的自由基碎片反應。譜705、710包含具有自由基波峰和非自由基波峰(如上文例子1和2中)的局部波峰特徵曲線。如譜705中所展示，所述氧自由基碎片產生額外波峰，指示所述碎片為自由基。所述氧自由基碎片顯現為相對於尚未與氧反應的自由基碎片波峰的+32amu加合物。對於譜710中的POPC樣本，來自單鍵鏈的氧自由基碎片展示14amu間距，而來自雙鍵鏈的雙鍵的雙鍵位置在雙鍵位置處展示12amu間距。因此，所述氧自由基碎片特徵曲線在雙鍵位置處展示波峰分割。

實例4：POPC和OPPC識別

根據一些實施例製備和分析含有POPC和OPPC的混合物的樣本。所述樣本經離子化而產生使用EIEIO進行解離的POPC和OPPC前體離子。如圖8中所展示，EIEIO裂解沿著烷基鏈的碳碳鍵的大部分，包含POPC特有碎片(m/z：491.337)和OPPC特有碎片(m/z：465.321)。這些特有波峰的相對密度比指示POPC和OPPC的相對豐度。舉例來說，對於OPPC樣本，主要與POPC特有碎片相比較，觀測OPPC特有碎片。在另一實例中，對於POPC樣本，主要與OPPC特有碎片相比較，觀測POPC特有碎片。與例如CID等常規的解離技術相比，在圖8中所描繪的譜的相同範圍中，僅觀測四種碎片。

出人意料地，這些數據顯示：根據本文中的教示內容對使用具有動能約4eV到約12eV的電子的電子解離的使用可將脂質分子碎片化以允許確定分子內的異構物質和/或雙鍵位置。

實例5：磷脂識別

更普遍地，一般化的磷脂也可使用本申請案中所描述的教示內容(尤其利用EIEIO方法)識別。圖9中所提供的表展示針對包含OPPC和POPC的許多類型的磷脂的診斷性波峰的m/z值。磷脂的頭部基團可通過具有較低m/z值的波峰識別，其通常顯現為強波峰。舉例來說，具有m/z值184.073的波峰的存在指示所述磷脂為磷脂醯膽鹼(PC)。在另一實例中，具有m/z值142.026的波峰的存在指示所述磷脂為磷脂醯乙醇胺(PE)。具有m/z值207.998的波峰的存在指示所述磷脂為磷脂醯絲氨酸(PS)，且此物質通過鈉離子帶電。具有m/z值238.019的波峰的存在指示所述磷脂為磷脂醯環己六醇(PI)，且此物質通過鈉離子帶電。這些m/z值理論上由sn3位置(由圖9中所描繪的分子中所展示的經標註的「頭部基團」損失指示)的氧和碳之間的解離而給定。使用此規則，計算用於其它磷脂和帶電物質(即，質子、鈉、鉀和其它金屬離子)的診斷性m/z。一旦識別到所述磷脂頭部基團，將在所述譜中發現具有所述識別的頭部基團的sn2診斷性質量中的一者。在PC的頭部基團發現m/z 491.337的情況下，sn-2位置處的醯基鏈識別為18:1，即，所述醯基鏈具有18個碳原子作為所述鏈，且其含有一個雙鍵。為了識別sn-1位置，處的醯基鏈，計算「(前體m./z)-(sn-2診斷性m/z)」，且此值將在表1中找到。所找到的值指示醯基鏈處於sn-1位置。

本文所用的章節標題僅用於組織目的且不應視為限制。雖然結合各種實施例來描述申請人的教示內容，但並不打算將申請人的教示內容限制為這些實施例。相反，申請人的教示內容涵蓋所屬領域的技術人員應了解的各種替代方案、修改方案以及等效物。