一種米麴黴阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達的製作方法

2023-06-24 10:15:56 3

專利名稱：一種米麴黴阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及來源於米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種新型A 型阿魏酸酯酶(faeA)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
阿魏酸(ferulic acid)是肉桂酸的一種，化學名是(3-甲基_4_輕基)_3_苯基-2-丙烯酸，或者3-甲基-4-羥基肉桂酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，其在植物細胞壁結構中起著重要的作用，可以在植物細胞壁的木質素與木質素之間、木質素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構成一個骨架結構，使得整個細胞壁變得堅硬。在穀物的細胞壁中，阿魏酸的單體和多種二聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上。阿魏酸主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，並具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國、日本已允許用作食品添加劑，目前在醫藥、食品和化妝品工業中廣泛應用。
阿魏酸酯酶(EC. 3. I. I. 73)又稱肉桂酸酯酶、肉桂醯酯酶，是羧酸水解酶的一個亞類，也是一種胞外水解酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯鍵， 一方面促進半纖維素、木素與纖維素的分離，有利於纖維素的進一步利用；另一方面促進阿魏酸等酚酸類物質的分離。阿魏酸酯酶在生物乙醇生產、製漿造紙、動物飼料生產和生物合成中具有廣泛的應用價值。目前對於阿魏酸酯酶的研究，主要集中於對原始菌株培養條件的優化以增加產酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者採用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高阿魏酸酯酶的酶活。
近年來，隨著對自然界半纖維素資源的開發利用，尤其是反式阿魏酸優越的生理功能，人們對不同來源和不同特性的阿魏酸酯酶進行了深入地研究，阿魏酸酯酶的應用領域得到了不斷地拓展，除了在食品方面的利用，其在造紙、飼料、紡織、釀酒、醫藥、環境和能源等工業領域逐步開始了廣泛的應用。發明內容
本發明的目的是提供一種源於Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，為該阿魏酸酯酶的產業化生產奠定理論基礎。根據胺基酸序列以及底物特異性等，將阿魏酸酯酶分為A、B、C、D四類，Shin等研究表明這四類阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根據同源比對，Aspergillus oryzae CICC 40186分泌的為A型阿魏酸酯酶，命名為Aor FaeA，其相應的基因命名為Aor faeA。
A. oryzae菌株購於中國工業微生物菌種保藏中心(China Center of Industrial CultureCollection，CICC)，編號為 40186。
本發明的技術方案一種源自A. oryzae CICC 40186的新型的A類阿魏酸酯酶 (Aor FaeA)，其基因(Aor faeA)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ ID NO 10
所述的由成熟肽cDNA序列所推導的Aor FaeA胺基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組阿魏酸酯酶的活性測定方法以對硝基苯酚阿魏酸酯(pNPF)作為反應底物，反應體系為200 μ L，緩衝體系為25mmol/LpH6. 4的磷酸緩衝液(含2. 5% Tritonx-100)，對硝基苯酚阿魏酸酯(溶於DMS0)終濃度為O. 6mmol/L，加入100 μ L的酶，測定產物對硝基苯酚在410nm處吸光度。同時設置空白對照(100 μ L粗酶液於沸水浴中滅、酶3min，其他操作步驟同上)。醋酶活力定義在上述反應條件下，每分鐘催化底物水解生成IymoL對硝基苯酚所需要的酶量為一個活力單位(U)。所述的Aor faeA成熟肽cDNA序列的克隆和表達的方法如下(I)從已報導的Aspergillus oryzae RIB 40基因組信息中找出編碼米麴黴A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然後對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下FAE-F :5，GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3，FAE-R :5』 GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3』提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T載體連接(pUCm-T-faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到AorfaeA成熟肽cDNA序列。(2)將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA(圖I)，並對重組質粒進行序列測定。(3)GS115/faeA的構建、表達、產物純化及活性測定用Sac I對pPIC9K_faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。本發明的有益效果本發明提供了一種來源於A. oryzae CICC 40186的新型的阿魏酸酯酶成熟肽基因cDNA序列的克隆及表達的方法，生物信息學分析表明該阿魏酸酯酶屬於此類酶的A類，所以命名為Aor FaeA，其相應的基因命名為Aor faeA。本發明為該酶的產業化生產奠定了理論基礎，有較大的工業化生產和應用潛力及經濟價值，也為其他菌株新型阿魏酸酯酶的研究奠定了理論基礎。


圖I :重組質粒pPIC9K_faeA的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例1A. oryzae CICC 40186 faeA成熟肽cDNA序列的克隆以A.oryzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和FAE-F為引物進行第一輪PCR，其反應條件為940C 5min，30 個循環(94°C 30s，51。。30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ;以 FAE-F 和 FAE-R 為引物進行第二輪 PCR，其反應條件為94°C 5min，30 個循環(94°C 30s,54°C 30s, 72°C lmin)， 72°C IOmin0將兩輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶並與pUCm-T連接 (pUCm-T-Aor faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。
實施例2Aor faeA成熟肽基因在畢赤酵母GSl 15中的表達
將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切， 回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA，並對重組質粒進行序列測定。
用Sac I對pPIC9K_faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選， 得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA。該基因工程菌用I. 0%甲醇誘導表達96h，採用紫外吸收法測得發酵液中重組阿魏酸酯酶活性達68IU/mL。
權利要求
1.一種來源於Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類阿魏酸酯酶,其核苷酸和胺基酸序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
2.A. oryzae CICC 40186新型A類阿魏酸酯酶基因序列克隆及表達的方法 (1)從已報導的Aspergillusoryzae RIB 40基因組信息中找出編碼黑麴黴A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然後對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下FAE-F :5，GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT 3，FAE-R :5』 GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG 3』提取 A. oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)說明書進行RT-PCR擴增；將兩輪PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pUCm-T載體連接(pUCm-T-faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到AorfaeA成熟肽cDNA序列； (2)將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoRI和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA(圖I)，並對重組質粒進行序列測定； (3)GS115/faeA的構建、表達、產物純化及活性測定用SacI對pPIC9K_faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。
全文摘要
一種米麴黴阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達。本發明提出了一種源於Aspergillus oryzae CICC 40186的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，相應的胺基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為Aor faeA。本發明還公開了產阿魏酸酯酶工程菌的構建以及重組阿魏酸酯酶的高效表達的方法，具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N9/18GK102978180SQ201210562540
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者鄔敏辰, 曾妍, 龔燕燕, 李劍芳 申請人:江南大學