一種鬆口蘑人工菌塘的誘導方法
2023-06-24 08:21:01
專利名稱：一種鬆口蘑人工菌塘的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種鬆口蘑人工菌塘的誘導方法，尤其是一種適合非實驗室操作的實驗方法。
背景技術：
鬆口蘑[Tricholoma matsutake(S.Ito.et.Imai)Sing.]—世界上最名貴的菌根型食用菌之一，是國家二級保護植物。在我國主要分布於東北地區的吉林、黑龍江，西南地區的雲南、四川，其它如山西、安徽、臺灣、西藏等省區也有零星分布。國外主要分布於日本、朝鮮、俄羅斯等國。鬆口蘑是一種富含蛋白質、多種維生素和大量糖類的美味食品，世界上以日本人最喜歡食用鬆口蘑，近年來由於環境的惡化和需求量的擴大，日本本土產量已遠遠不能滿足其國內市場的需要，因此每年都大量從外國進口。鬆口蘑出口已成為其產地的一個重要產業，經濟效益相當可觀。
關於鬆口蘑的人工栽培研究已經進行了一個世紀之久，但是迄今為止，除了形成幾個子實體原基(OgawaHamada，1975)外，尚沒有栽培成功的例子見諸報端。近年來，關於無菌條件下鬆口蘑人工菌根苗誘導成功的報導有很多(Yamada et al.，1999a；Guerin-Laguette et al.，2000a；Vaario et al.，2000)，這種人工菌根苗可以進行野外栽培，然而，儘管大多數菌根真菌在侵染宿主植物根部後都能夠進行擴展生長(Read，1991；Guerin-Laguette et al.，2000b；Wu et al.，2001)，可鬆口蘑菌絲體即便是其在宿主植物根內形成哈蒂氏網後仍很難進一步生長，移栽後的菌根苗會出現菌絲退化現象，並且菌根也僅能存活4個月左右(Yamada et al.，2001)。這種有限生長的外延菌絲根本無法形成天然條件下鬆口蘑子實體形成的關鍵場所—菌塘，因而也就無法繼續進行子實體的誘導實驗。
菌塘是由密生的白色或灰白色菌絲體與植物根系及土壤顆粒相互交錯紐結而成的團狀結構(Ogawa，1975a；Hosford et al.，1997；Yamada et al.，1999b)，鬆口蘑整個生活史及其子實體的產生都是在菌塘上完成的(弓明欽等，2002)。Ogawa(1975a)在觀察野外鬆口蘑菌塘的擴展生長時發現，為了維持菌落的進一步生長發育，與宿主植物相連的菌絲體需要有一個臨界生物量。由此可見，人工菌根苗形成後菌絲體在基質中能否順利生長擴展形成可以滿足子實體發生的菌塘，對於鬆口蘑人工栽培的成功與否是十分關鍵的問題。
日本東京大學的研究人員對於快速誘導鬆口蘑人工菌根及工人菌塘的形成作了很深入的研究(Ogawa et al.，1974，1975b；Guerin-Laguette et al.，2001)，他們已報導在無菌土壤或人工基質條件下，將鬆口蘑菌液接種於發芽1個月的赤松苗木上3～4個星期後，赤松的側根上就能形成很典型的哈蒂氏網，誘導出人工菌根。他們這一快速人工菌根誘導技術還獲得了日本國專利(鈴木和夫等，1999)。同時，他們還發現，界面活性劑及植物油對於鬆口蘑菌絲體的生長具有促進作用(Vaario et al.，2002；Guerin-Laguette et al.，2003)，這一發現對於鬆口蘑人工菌塘的誘導有著很大的意義。然而，這些誘導方法都存在著一定的缺陷—如Yamada(1999b)和Guerin(2003)等都是對誘導用容器使用了高壓滅菌法進行消毒，由於大容量的塑料容器或比較廉價的塑料器皿大都不耐高溫，用γ-射線消毒是一種解決問題的辦法(寺村智，2000)，但費用高，一般實驗室或實驗站不可能有這樣的設施。所以這些誘導法雖然在理論上可行，但實際操作上卻存在很大難度。
發明內容
本發明的目的在於克服了上述技術中存在的不足之處，提出一種在以橄欖油為主要添加物的土壤中誘導菌絲體生長且適合非實驗室操作的鬆口蘑人工菌塘的誘導方法。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案是a)容器先用洗滌劑洗淨、衝洗並晾乾；b)在經70％酒精表面消毒的工作檯上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸鈉溶液先後對容器內壁以及容器蓋進行噴霧消毒，並保留消毒液5-20分鐘，用量為5-20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置於經表面消毒的工作檯上，自然乾燥30-40分鐘；d)容器乾燥後，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v幹土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5-2.0％(油v/幹土v)並經高壓滅菌的培養土直接裝入容器中，再接入鬆口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20-30℃黑暗條件下進行誘導培養。
所述的培養土包含自然土與人工基質混合物。
所述的人工基質包含蛭石和珍珠巖。
根據權利要求1所述的一種鬆口蘑菌塘的誘導方法，其特徵在於，所述的培養土含有0.5％-2.0％橄欖油，優選為1％。
所述的培養土是在高壓滅菌鍋中溫度為121度、時間持續40-60分鐘的條件下進行消毒。
本發明的優點是1)成功的進行了鬆口蘑人工菌塘的誘導2)方法簡便，適合非實驗室操作3)成本低廉，適合在鬆口蘑產區進行實際推廣應用，以增加該食用菌的產量4)添加物為自然食用物質，適合應用於鬆口蘑人工子實體誘導的研究具體實施方式
下面對本發明的實施例做進一步詳細描述a)容器先用洗滌劑洗淨、衝洗並晾乾；b)在經70％酒精表面消毒的工作檯上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸鈉溶液先後對容器以及容器蓋進行噴霧消毒，並保留消毒液5-20分鐘，用量為5-20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置於經表面消毒的工作檯上，自然乾燥30-40分鐘；d)容器乾燥後，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，無水乙醇v/v幹土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5-2.0％(油v/幹土v)並經高壓滅菌的培養土直接裝入容器中，再接入鬆口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20-30℃黑暗條件下進行誘導培養。
所述的培養土包含自然土與人工基質混合物。
所述的人工基質包含蛭石和珍珠巖。
所述的培養土是在高壓滅菌鍋中溫度為121度、時間持續40-60分鐘的條件下進行消毒。
1)容器消毒將試管(Φ3.5mm×L17mm)先用洗滌劑洗淨、衝洗並晾乾。在經70％酒精表面消毒的超淨工作檯上，首先用70％酒精噴灑內壁並放置5分鐘後，晾30分鐘，然後再分別用0.05-1.0％次氯酸鈉溶液噴灑內壁並放置5分鐘，同樣晾30分鐘。兩次操作中消毒液用量為5ml/100ml容器。
2)檢測消毒液濃度對種子發芽的影響將上述方法消毒的試管作為培養容器，在每個試管中倒入經高壓滅菌的含葡萄糖5g/l的瓊脂(1.0g/l)培養基30ml，每個濃度四個重複。首先觀察五周試管內的汙染情況，然後在試管中接入種子進行發芽實驗，每個管中接入消毒後的赤松種子2粒，分別觀察其汙染率以及種子的發芽旅。
從表1中可以看出，次氯酸鈉溶液濃度為零時，一周後四個管中有三個產生了汙染，兩周後所有試管全部汙染；而當溶液濃度為0.05-1.0％時，所有試管到第五周末都沒有產生汙染，且到第八周結束時，發芽率分別為1.0％--50％；0.5％-62.5％；0.1％-72.5％；0.05％-87.5％。
表1次氯酸鈉溶液消毒試管觀察記錄表
「----」四個試管都無汙染；「-+++」三個有汙染，一個沒有；「++++」四個都有汙染當次氯酸鈉溶液濃度為0.05％時，赤松種子的發芽率為87.5％，這個數值非常接近於高壓滅菌時的發芽率(90％，實驗數據)，但當溶液濃度為1.0％時發芽率僅為50％。由此可見，當次氯酸鈉溶液濃度為0.05％時，種子的發芽率幾乎沒有受到影響，且發芽用容器的消毒效果也達到了最佳。
3)鬆口蘑菌絲體生長的誘導取培養土若干(60℃，24小時)，加入蒸餾水—使土壤含水量為20％(v/v)、及事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v幹土)混溶過的橄欖油—使土壤中油的含量分別達到0％，0.5％，1.0％，2.0％(油v/幹土v)等四個濃度梯度。攪拌均勻後，121℃高壓滅菌40分鐘。超淨工作檯中量取滅菌後的混合培養土10ml直接倒入1)所述方法消毒後的直徑6cm的玻璃培養皿中，同時接入直徑8mm的兩個圓形菌塊，供試菌株為W2，F2和A，每種處理四個重複，用保鮮膜封纏3圈，封好後進行暗培養(23±2℃)。兩個月後測定菌絲體麥角固醇含量。
菌塊接入土壤中三天後即可觀察到菌絲的生長。一個月後，每個培養皿中都以兩個菌塊為中心形成了兩個圓形菌落，對照與油/土培養條件下都是如此，所不同的是，對照培養土中的菌絲生長稀疏，而添加橄欖油的培養土中菌絲生長緻密。兩個月後收集菌絲體時發現，油/土培養基質中的菌絲與土壤緊密結合在一起，兩個菌塊都形成了兩個圓形團狀物，生長狀況極其酷似野外的鬆口蘑菌塘。另外，麥角固醇含量測定結果也顯示(見表2)，油/土混合培養基質中的菌絲體生物量明顯高於對照。且隨著橄欖油濃度的增加，麥角固醇含量呈正相關。所以，當土壤中添加橄欖油濃度為0.5-2.0％時，對鬆口蘑菌絲體的生長都有良好的促進作用，且濃度越高促進作用越強。
表2不同橄欖油濃度的培養土中菌種的麥角固醇含量(μg/g幹土)
注數據來源於四個重複的平均值4)檢測不同濃度橄欖油的油/土混合基質對赤松苗生長的影響橄欖油/土壤混合培養基質設置0％，0.5％，1.0％，2.0％，(油v/幹土v)四個濃度梯度。將無菌赤松苗移入消毒後並裝有經滅菌的各混合基質的玻璃管(Φ3.5mm×L17mm)中，每種處理四個重複，用塑料薄膜將管口封好後，放入組培室培養架上，光照強度2000lux，溫度24±3℃，光照12h/天，四周後記錄赤松苗生長情況並稱量其地上部與地下部乾重。
赤松苗在土壤中培養兩周後，橄欖油濃度為0.0-1.0％的試管中幼苗均長勢良好，而濃度為2.0％的則部分苗的葉尖有些變黃。到第四周結束時，0％濃度的四棵苗長勢良好；0.5％的四棵苗中兩株葉尖部分發黃，其餘長勢良好；1.0％濃度的苗生長情況同0.5％的相類似；而2.0％濃度的四棵苗則葉尖全部發黃，且部分苗的莖也變黃。另如表3所示，當添加橄欖油的濃度為2.0％時，赤松苗地上部和地下部的乾重值比其它幾種情況下的都低，且差異顯著。另外兩個濃度條件下，苗的地上部和地下部乾重值與不加油的基質相比不存在顯著性差異。所以，儘管當土壤中橄欖油添加濃度為2.0％與0.5％和1.0％相比鬆口蘑菌絲體生長量最大，但是這個濃度卻對赤松苗的生長有負面影響，而濃度為0.5％和1.0％時，赤松苗的生長與0.0％相比卻沒有受到影響。
表3在不同濃度的橄欖油/土壤混合基質中生長四周後的赤松苗乾重記錄表
注數據來源於四個重複的平均值5)通過鬆口蘑人工菌根苗的誘導驗證人工菌塘的功能取消毒後的長方形塑料培養平板(145mm×100mm×18mm)若干，向其中加入用3)方法配製並誘導1％濃度的橄欖油/土壤混合基質與鬆口蘑菌絲體的混合物60ml(約佔平板容量的1/2)，並將組織培養一個月的無菌赤松苗移入，用保鮮膜封好，再用錫泊紙將生長有菌絲體的土壤部分包嚴，以防光線影響菌根合成，使培養平板呈75度角斜放於組培室培養架上，培養條件為2000lux光照強度，24±3℃，12h光照/天。
在油/土混合基質中生長三個月的菌絲體進一步蔓延覆蓋了整個土壤表面，並與土壤緊密扭結在一起形成了團塊狀結構。接入的赤松苗兩個月後依然長勢良好，Olympus顯微鏡下觀察發現，苗的某些側根上沒有根毛，顔色呈暗棕色，且有疏鬆的菌絲連接於其上，表明有菌根形成。
權利要求
1一種鬆口蘑菌塘的誘導方法，其特徵在於a)容器先用洗滌劑洗淨、衝洗並晾乾；b)在經70％酒精表面消毒的工作檯上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸鈉溶液先後對容器內壁以及容器蓋進行噴霧消毒，並保留消毒液5-20分鐘，用量為5-20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置於經表面消毒的工作檯上，自然乾燥30-40分鐘；d)容器乾燥後，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v幹土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5-2.0％(油v/幹土v)並經高壓滅菌的培養土直接裝入容器中，再接入鬆口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20-30℃黑暗條件下進行誘導培養。
2根據權利要求1所述的一種鬆口蘑菌塘的誘導方法，其特徵在於，所述的培養土包含自然土與人工基質混合物。
3根據權利要求1所述的一種鬆口蘑菌塘的誘導方法，其特徵在於，所述的人工基質包含蛭石和珍珠巖。
4根據權利要求1所述的一種鬆口蘑菌塘的誘導方法，其特徵在於，所述的培養土含有0.5％-2.0％橄欖油，優選為1％。
5根據權利要求1所述的一種鬆口蘑菌塘的誘導方法，其特徵在於，所述的培養土是在高壓滅菌鍋中溫度為121度、時間持續40-60分鐘的條件下進行消毒。
全文摘要
本發明涉及一種鬆口蘑人工菌塘的誘導方法，其特徵在於a)容器先用洗滌劑洗淨、衝洗並晾乾；b)在經70％酒精表面消毒的工作檯上，用70％酒精和0.05－1.0％次氯酸鈉溶液先後對容器以及容器蓋進行噴霧消毒，並保留消毒液5－20分鐘，用量為5－20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置於經表面消毒的工作檯上，自然乾燥30－40分鐘；d)容器乾燥後，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v幹土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5－2.0％(油v/幹土v)並經高壓滅菌的培養土直接裝入容器中，再接入鬆口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20－30℃黑暗條件下進行誘導培養。本發明成功地進行了鬆口蘑人工菌塘的誘導，它具有方法簡便，適合非實驗室操作；成本低廉，適合在鬆口蘑產區進行實際推廣應用，以增加該食用菌的產量。
文檔編號A01G1/04GK1754422SQ20041004390
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月28日 優先權日2004年9月28日
發明者李玉花, 倫志明, 邢樹堂, 孫雪, 傅祿敏 申請人:東北林業大學, 李玉花