木質纖維素生物質的快速且低成本的酶促完全轉化的製作方法
2023-05-26 20:32:51
木質纖維素生物質的快速且低成本的酶促完全轉化的製作方法
【專利摘要】提供用於改進加工木質纖維素生物質的方法。使熱水預處理的木質纖維素生物質在高初始纖維素酶載量(至少15FPU/g?DM)下進行分步水解和發酵(SHF)或預水解並進行同步糖化和發酵(SSF)。隨後回收纖維素酶，並與較低劑量補充的新鮮的酶一起用於隨後的水解循環。水解循環之間損失的酶活性被改進的整個工藝優勢抵消。
【專利說明】木質纖維素生物質的快速且低成本的酶促完全轉化
【技術領域】
[0001]本發明大體上涉及加工木質纖維素生物質的方法，其包括預處理生物質的分步水解和發酵(SHF)和同步糖化和發酵(SSF)，特別是，涉及通過在非常高的初始纖維素酶載量下的酶促水解和纖維素酶回收來改進加工效率。
【背景技術】
[0002]木質纖維素生物質提供有前景的石油替代物，提供可再生且〃碳中和(carbonneutral)"的燃料如生物乙醇和其它傳統石油基產品如塑料的來源。木質纖維素生物質可被酶促水解，以提供隨後用於各種生物合成工藝的可發酵碳水化合物。
[0003]由於其複雜的化學結構，通常只有在一些使得纖維素纖維易於被酶催化的預處理後，木質纖維素才能通過目前已知的酶活性來有效地水解。此類預處理工藝通常包括加熱至較高溫度(100至250°C)。降低成本或以其他方式增加生產規模的商業可行性的生物質預處理和加工方法已引起強烈的興趣。
[0004]嚴重影響木質纖維素生物質加工的總成本的一個因素是纖維素酶的成本。因此，更有效地利用纖維素酶或改進可發酵碳水化合物的總產率的預處理木質纖維素生物質的酶促水解方法是有利的。
[0005]已受到相當大關注的一類改進是用於回收酶或以其他方式降低酶消耗的策略。
[0006]之前關於纖維素酶回收的研究表明回收主要取決於兩個因素-α)水解程度和
(ii)使用的原料的木質素含量。作為一般趨勢，據報導，在原料水解更完全的情況下，改進回收中的酶回收。然而，由於原料變得水解更完全，這種改進的纖維素酶回收的傾向被纖維素酶對木質素的非特異性結合增加的相關傾向所抵消。不同回收策略的比較表明，原料的木質素含量是控制纖維素酶回收的唯一最重要的變量。參見參考文獻I。
[0007]已經提出了許多纖維素酶回收策略。在未通過化學處理脫木質素的原料中，現行的方法是在原料水解的中間程度下回收酶。首先從水解反應混合物中過濾或以其他方式回收纖維素殘餘物，然後與新鮮原料接觸，使得以高達50-70%的水平回收纖維素酶活性。參見參考文獻2和3。
[0008]在通過化學處理脫木質素的原料中，以前的研究指出，在「完全」水解後，其中沒有纖維素殘餘物剩下，可獲得最大的酶回收。參見參考文獻I。然而，最近的研究表明，組合使用脫木質素的底物和表面活性劑時，最佳的纖維素酶回收要求從上清液和纖維素殘餘物兩者中回收，即最佳的回收要求小於"完全"的原料水解程度。參見參考文獻4和5。
[0009]之前開發纖維素酶回收策略的努力集中在降低酶載量。稀釋酶體系通常被認為是可取的。在較高的酶載量下，任何給定原料在酶促水解反應中任何給定時間點的水解程度增加了。參見參考文獻6。然而，該效果是對數性的，意味著為了獲得給定時間點下轉化率的較小差異要求大的酶載量差異。因此，為了優化酶促水解時間而不產生過度的酶成本，現有技術之前認為比較稀釋的酶濃度是可取的。參見參考文獻7。商業規模的生物乙醇生產的技術經濟模型之前表明，大約10FPU/g乾物質(DM)預處理生物質的纖維素酶載量是理想的，因為這被認為是在合理成本下提供合理水解時間內最高的葡萄糖產量。參見參考文獻30
[0010]之前認為> 10FPU/g DM預處理生物質的纖維素酶載量在商業規模生物乙醇生產中是不可取的。在連續水解回收系統中總成本和葡萄糖產量的一個廣泛的比較表明，在使用未脫木質素的原料時，20FPU/g DM的高酶載量相對於更稀釋的10FPU/g DM的載量不具有優勢。參見參考文獻2。
[0011]我們已經發現，通過使用高的初始酶載量(至少17FPU/g DM)，然後在從之前循環中回收的纖維素酶活性的每個水解循環中補充較低劑量的酶，可進行具有整體優勢的依靠SHF或SSF的商業生物乙醇生產中的纖維素酶回收。在這些高纖維素酶水平下,非特異性木質素結合似乎變得飽和。可僅使用低水平的新鮮酶補充，在多個水解循環中保持高酶劑量水平。這些高纖維素酶活性水平大大縮短水解時間，導致資本成本降低和生產規模能力增加。高纖維素酶活性水平還導致更完全的轉化％，降低所生產的每升乙醇的生物質成本。使用預處理的未脫木質素的木質纖維素原料獲得了有效的結果。在一些情況下，可如此大大改進水解產率和回收纖維素酶活性至如此高程度，以使與在商業酶供應商推薦的低酶水平下所獲得的相比，降低每升乙醇最終的酶消耗。
[0012]發明簡述
[0013]提供用於改進生物乙醇生產中木質纖維素生物質加工的方法。使熱水預處理的木質纖維素生物質在高初始纖維素酶載量(至少15FPU/g DM)下進行分步水解和發酵(SHF)或預水解並進行同步糖化和發酵(SSF)。隨後回收纖維素酶，並與較低劑量補充的新鮮酶一起用於隨後的水解循環。水解循環之間的酶活性損失被改進的整個工藝優勢抵消。
[0014]附圖簡要說明
[0015]圖1顯示在72小時SSF工藝體系的實驗中乙醇產量作為時間和纖維素酶劑量的函數。
[0016]圖2顯示6小時水解後的葡萄糖濃度作為表示為FPU/g DM的纖維素酶劑量的函數。
[0017]圖3顯示實施例3中報導的實驗方案。
[0018]圖4顯示使用經優化用於木質纖維素生物質轉化且由N0V0ZYMES?提供的可商購的纖維素酶製劑來實施本發明的方法時，每個回收循環後獲得的乙醇濃度。
[0019]圖5顯示使用經優化用於木質纖維素生物質轉化且由GENENC0R?提供的可商購的纖維素酶製劑來實施本發明的方法時，表示每個回收循環後的纖維素酶活性回收的6小時預水解後的葡萄糖濃度。
[0020]一些實施方案的詳細說明
[0021]提供具有改進效率的生物乙醇生產中加工木質纖維素生物質的方法。
[0022]從2000年以來，最大的商業纖維素酶生產者已經集中研究以在第二代生物乙醇生產中降低生產成本和改進經優化用於轉化木質纖維素生物質的纖維素酶混合物的特定活性。特別是N0V0ZYMES?和GENENC0R?在2009-2010年分別以商標CELLIC CTEC2?和ACCELLERASE1500?推出新的商業纖維素酶混合物。
[0023] GENENC0R?在2009年推出專門為第二代生物煉製開發的可商購生物質酶的改進變型，並以商標ACCELLERASE1500?銷售。已表明其成功地水解包括甘蔗渣、玉米秸杆、小麥秸杆和針葉木漿的一系列預處理原料。ACCELLERASE 1500?的產品信息頁指出劑量優化範圍是0.1-0.5mL/g纖維素或大約0.05-0.25mL/g DM預處理生物質。
[0024]N0V0ZYMES?在2010年推出專門為第二代生物煉製開發的可商購生物質酶的改進變型，並以商標CELLIC CTEC2?銷售。已表明其成功地水解包括甘蔗渣、玉米秸杆、小麥秸杆和針葉木漿的一系列預處理原料。N0V0ZYMES?分發的產品信息材料，具體地是"FuelEthanol Application〃材料中提供的CELLIC CTEC2?的〃劑量指引〃，指出從低到高的劑量範圍，其對應於0.015-0.06g酶/g纖維素或約0.0075-0.03g酶/g DM預處理生物質的範圍內的〃商業上可行的纖維素水解的目標〃。
[0025]〃纖維素酶活性〃是指纖維素中l，4-13_D-糖苷鍵的酶水解。在從細菌、真菌或其它來源中獲得的商業或其它纖維素酶製劑中，纖維素酶活性通常包含不同酶活性的混合，所述酶包括與β -葡糖苷酶一起分別催化1，4-β -D-糖苷鍵內水解和外水解的內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶(也稱為纖維素二糖水解酶)，所述P.葡糖苷酶將外切葡聚糖酶水解的低聚糖產物水解成單糖。經優化用於水解木質纖維素生物質的商業混合物經常還含有用於轉化木質纖維素生物質但本身不是纖維素酶的酶，如催化與木質纖維素材料中的纖維素有關且由各種單糖組成的雜聚合物半纖維素水解的半纖維素酶，所述單糖最特別是木糖，但還包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和其它糖。
[0026]如現有技術眾所周知的，總的纖維素酶活性，包括不同纖維素酶的任何混合物，可便利地測定為稱為__濾紙單位__的單一活性表達。如本文所使用，術語__濾紙單位"(FPU)是指通過 Adney, B.和 Baker, J., Laboratory Analytical Procedure#006,^Measurementof cellulase activity", 1996 年 8 月 12 日，USA National RenewableEnergy Laboratory(NREL)的方法測定的濾紙單位,上述文獻以其整體方式通過引用明確地引入本文。本領域技術人員將容易理解，FPU提供纖維素酶活性的量度，但是其它的酶活性可有用地包括在纖維素分解酶的有效混合物中，包括但不限於半纖維素酶活性。
[0027]在丹麥Fredericia的INBIC0N?實驗室，我們測定經優化用於木質纖維素生物質水解並由GENENC0R?以商標ACCELLERASE 1500?銷售的商業纖維素酶製劑的以濾紙單位計的纖維素酶活性為約60 (FPU)/ml。因此，可將GENENC0R?建議的優化範圍重新計算為約3 — 15FPU/g DM預處理生物質。我們測定經優化用於木質纖維素生物質水解且由N0V0ZYMES?以商標CELLIC CTEC2?銷售的商業纖維素酶製劑以濾紙單位計的纖維素酶活性為約120FPU/g酶。因此，可將由N0V0ZYMES?建議的〃商業上可行的纖維素水解的目標.『劑量重新計算為約1.4FPU/g DM。
[0028]考慮到纖維素酶劑量對第二代生物乙醇生產的商業化可行性至關重要，現有技術之前已尋求使纖維素酶劑量最小化。例如參見參考文獻9。
[0029]相反地，我們已經發現，令人驚訝地，使用SHF或SSF時，使用高初始酶載量(至少15FPU/g DM)可獲得更大的整個工藝優勢。
[0030]在一些實施方式中，本發明提供一種高的酶劑量回收方案，由此在多個水解循環中保持至少15FPU/g DM或至少12FPU/g DM或至少10FPU/g DM的纖維素酶活性水平。僅需要在初始水解循環中添加高的酶劑量。通過從之前循環中回收纖維素酶活性和補充較低劑量的新鮮纖維素酶製劑，而在隨後的水解循環中保持高的酶水平。
[0031]相對於低劑量體系，高劑量體系即使在每升乙醇的酶消耗量增加的情況下，也提供整體優勢。使用高劑量體系導致水解時間急劇縮短。該水解時間的縮短提供生產規模的直接利益，因為降低了資本成本(可使用更小的水解罐)和增加了生產能力(實現更高的生物質生產能力)。此外，在高劑量體系中，更完全地水解木質纖維素生物質，以致轉化率接近100%。這反過來降低了每升乙醇的總生物質成本。在其它情況下，可如此顯著地改進水解產率和回收纖維素酶活性至如此高的程度，以致與使用商業酶供應商推薦的較低酶劑量下可獲得的相比，高劑量體系提供相當或甚至更低的每升乙醇的最終酶消耗量。
[0032]表1顯示在使用本發明方法的多個水解循環中可大致保持的理論高初始纖維素酶劑量的計算值，其中每升乙醇的酶成本與低劑量體系相當。所示的纖維素酶活性回收水平限定了在每個水解循環中通過低劑量補充可維持的高酶劑量的水平。所示的補充劑量簡單地是[1-(回收率％/100)]*(實現完全轉化所需的酶劑量)。理論高劑量計算基於假定水解中的轉化率為100%。因此，理論可持續高劑量應通過係數(高劑量下的實際轉化率)/100%來校正。相當的酶成本表示，通過10個具有補充的回收循環在完全轉化下生產每升乙醇的總酶消耗量相當於通過10個普通發酵循環在5FPU/g DM和在相當的DM下生產每升乙醇的總酶消耗量。〃普通發酵〃是指使用5FPU/g DM的經優化用於木質纖維素生物質水解且由N0V0ZYMES?以商標CELLIC CTEC2?提供的商業纖維素酶製劑在50°C下預水解經蒸汽預處理的小麥秸杆6小時，然後使用普通麵包酵母在30-33°C下SSF144小時的標準條件。
[0033]如下確定表1的計算:每升乙醇目標物的相當酶成本是在SSF體系中144小時，25% DM下，5FPU/g DM下的典型乙醇產量。該典型產量是70%的理論轉化率，其在參考DM水平下產生152升乙醇。
[0034]因此，所述相當目標是5FPU/152升乙醇或0.0328947FPU/升乙醇，其中g DM是常數。
[0035]參考DM水平下的100%轉化率是218升乙醇。利用在該SSF體系中超過15FPU的任何劑量可實現完全轉化的假設，我們計算了在10個具有酶補充的回收循環中使用的總酶。
[0036]我們得到[總酶FPU]/2180升乙醇=0.0328947FPU/升乙醇，其中g DM是常數。
[0037]術語[總酶FPU]是回收率％和由X給出的起始酶濃度的函數，其可求解以滿足條件[總酶]=(2180) * (0.0328947) = 71.7
[0038]如下確定X的計算:[((9個回收循環)*(1-回收率％補充)+l)*X] =71.7
[0039]因此，例如，在15FPU和58%回收率時的計算為:[總酶FPU] = 15+9* (6.3補充劑量)=15+56.7 = 71.7
[0040]類似地，例如，在18.1FPU和67%回收率時的計算為:[總酶FPU] = 18+9* (5.96補充劑量)=18.1+53.6 = 71.7
[0041]表1.由給定的平均纖維素酶實際回收率％下的以FPU/g DM計的給定補充劑量計算的在每升乙醇相當酶 成本下可持續的以FPU/g DM計的理論高纖維素酶劑量
[0042]
【權利要求】
1.一種加工木質纖維素生物質的方法，其包括 -提供熱水預處理的木質纖維素生物質 -使所述預處理的生物質進行使用至少15FPU/g DM的初始纖維素酶劑量的初始酶促水解，至轉化率為95%或更高，然後 -隨後的水解循環，其中將從一種水解混合物中回收的纖維素酶活性與l_6FPU/g DM的新鮮纖維素酶補充劑量一起使用，以水解隨後的水解混合物中的其他生物質， 其中從pH為7.5至9.5的來自上清液和來自水解殘餘洗滌物的一種水解混合物中回收纖維素酶活性，並再用於隨後的水解混合物，以使回收的纖維素酶活性的平均量為從其中回收活性的水解開始時的存在量的至少約58%，和 其中使在隨後的水解混合物中的回收酶和補充新鮮的纖維素酶的循環重複三次或更多次。
2.權利要求1所述的方法，其中隨後使所述水解混合物進行發酵至至少4重量％的乙醇濃度。
3.權利要求1所述的方法，其中在約60°C或更低的溫度下真空蒸餾後，回收纖維素酶活性。
4.權利要求1所述的方法，其中所述木質纖維素生物質是小麥秸杆。
5.權利要求1所述的方法，其中通過在水解之前使用回收的酶溶液浸潰新鮮的預處理生物質，在隨後的水解循環中包括回收的纖維素酶活性。
6.權利要求1所述的方法，其中所述初始纖維素酶劑量為至少18FPU/gDM。
7.權利要求1所述的方法，其中用於提供所述補充劑量的纖維素酶製劑與用於提供所述初始纖維素酶劑量的纖維素酶製劑不同。
8.權利要求1所述的方法，其中所述纖維素酶是經優化用於木質纖維素生物質轉化的可商購纖維素酶製劑。
9.權利要求1所述的方法，其中以自動水解的形式在pH2.5至8.0進行熱水預處理。
10.權利要求1所述的方法，其中進行熱水預處理至對數強度小於3.95。
11.權利要求1所述的方法，其中以SSF工藝形式進行水解。
12.權利要求1所述的方法，其中以SHF工藝形式進行水解。
13.權利要求1所述的方法，其中選擇所述補充劑量，以使在至少三個水解循環中保持酶劑量平均值為至少10FPU/g DM。
14.權利要求1所述的方法，其中選擇所述補充劑量，以使在至少三個水解循環中保持酶劑量平均值為至少12FPU/g DM。
15.權利要求1所述的方法，其中選擇所述補充劑量，以使在至少三個水解循環中維持酶劑量為至少10FPU/g DM。
16.權利要求1所述的方法，其中選擇所述補充劑量，以使在至少三個水解循環中維持酶劑量為至少12FPU/g DM。
【文檔編號】C12P7/00GK103930553SQ201180074749
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2011年10月6日 優先權日:2011年10月6日
【發明者】簡·拉森, 馬丁·丹·傑普森 申請人:因比肯公司