小鼠FcγRⅢ線性配體結合表位的製作方法

2023-05-26 17:14:41

專利名稱：：小鼠FcγRⅢ線性配體結合表位的製作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學、免疫學和生物信息學領域，特別是涉及小鼠FcyRIII(FcGammaReceptorHI)線性配體結合表位。二.
背景技術：
：Fc受體(FcR)為特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細胞表面分子，小鼠FqR有四種類型，分別為FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)、FcyRIII(CD16)和FcyRIV，其胞外區結構相似，均含有兩個(FcyRn和FcYRIII)或三個(FcYRI)Ig樣結構域，屬Ig超基因家族，而跨膜區和胞內區則存在明顯差異。FcyRIII是高度糖基化膜蛋白，為中低親和力IgG受體，在生理條件下只能結合IgG複合物或多聚體。moFcyRin胞內區與FcRY鏈二聚體、T細胞受體(Tcellrec印tor，TCR);鏈二聚體或FcRY鏈-TCR;鏈異源二聚體相連，通過這些亞基的ITAM基序進行信號轉導，FcR"/鏈或TCR;鏈為FcyRm在細胞表面表達所必需，只有通過共轉染FcRY鏈或TCR;鏈，才能在細胞表面表達FeyRIII。Y-chain具有信號傳導功能，通過二硫鍵與FcYRIII結合，介導FcyRIII的表達。Fc受體廣泛表達於免疫輔助細胞和效應細胞，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細胞免疫的聯繫紐帶，在機體免疫調節中起關鍵作用。抗體介導的炎性反應可通過激活型和抑制型FcR進行調節，因此FcR是治療過敏和自身免疫性疾病理想的藥物靶標。根據FqR功能的不同，提高或降低FcyR-IgG結合的親和力可以達到相應的FcYR免疫治療目的。激活型受體的胞內區(FcyRIIA)或者FcRY鏈(FcYRI、FcyRIII、boFcy2R、moFcyRIV、FcaRI和FcsRI)含有基於酪氨酸的受體活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，能激活免疫效應細胞，誘導吞噬作用(phagocytosis)、抗體依賴細胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)、補體依賴細胞毒作用(complement-dependentcellularcytotoxicity,CDCC)、細胞裂解(cytolysis)、分泌細胞因子和其它炎性因子以及調節淋巴細胞增殖和分化等多種免疫學效應。可溶性FCYR重組蛋白在體外可阻斷免疫複合物與B細胞的結合，因此在體內可與免疫細胞表面FcyR競爭結合IgG，抑制免疫複合物對細胞的激活；同理，高劑量的非特異IgG也可與體內免疫複合物競爭結合表達FcYR的免疫細胞，靜脈內免疫球蛋白治療方法(intravenousimmunoglobulintherapy,IVIG)己應用於血小板減少(immunethrombocytopenicpurpuria，ITP)、全身性紅珍H良痛(systemiclupuserythematodes，SLE)和多組織硬化(multiplesclerosis,MS)等疾病的免疫治療。IgGFc-FcyRIII晶體結構的解析以及對信號轉導機制的了解為發現新的特異、高效藥靶提供了更多的信息和途徑，人們利用肽庫篩選、組合化學(combinatorialchemistry)、生物信息學以及合成多肽等篩選和鑑定了多種IgGFc片段的抑制性多肽，其中抑制Fc-FcyR結合的TG19320三肽四聚體在小鼠體內顯現對腎小球腎炎良好的抑制功效。Medgyes瞎在人IgGlFe片段中鑑定了誘導細胞信號傳導的功能性多肽，來源於CH2區Pro234-Ser298的多肽與細胞表面FcyRIIB特異結合，可誘導細胞分泌細胞因子和ERK的磷酸化，並能抑制BCR介導的Ca^反應。然而，小分子多肽對受體的親和力遠遠低於完整的抗體分子，多肽親和力的提高等問題尚有待解決。三.
發明內容本發明要解決的主要技術問題是提供一種小鼠FcyRIII線性配體結合表位，為鑑定本發明的多肽在體外的抑制活性，分別進行了多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制和小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制，表明線性表位多肽對小鼠FcyRIII親和小鼠IgG顯現出良好的抑制功效。本發明的技術方案是利用DNASIS軟體將mFcyRIII與boFcyRIII和huFcYRIII的胺基酸序列進行比對分析，並參照huFcYRIII的晶體結構，在EC2結構域設計合成小鼠FcyRIII多肽6條，Dot-blot分析表明，小鼠Fc/RIII的119-130位多肽為CSFFHNEKSVRYH，該多肽是特異結合小鼠IgG的有效多肽，為小鼠Fc7RIII的線性配體結合表位，位於受體EC2結構域CC'環。本發明的小鼠FcyRin受體線性配體結合表位的胺基酸序列為H-Cys-Ser-Phe-Phe-His-Asn-Glu-Lys-Ser-Val-Arg-Tyr-His-OH。所述的線性配體結合表位為合成多肽。所述的線性配體結合表位多肽鏈N端氨基化或乙醯化，或C端羧基化或醯胺化。編碼所述的小鼠FcyRIII受體線性配體結合表位的核苷酸序列。為鑑定本發明的多肽在體外的抑制活性，分別進行了多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制和小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制。在進行本發明多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制中，將小鼠FcYRIII胞外區cDNA亞克隆到原核表達載體pET-28a，在大腸桿菌中高效表達了小鼠mFcyRIII胞外區，以快速稀釋復性方法從包涵體變性蛋白中回收了具有良好結合活性的小鼠FcrRIII胞外區重組蛋白，用ELISA方法測定了本發明多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制效率。為進行多肽對小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制，將小鼠FcyRIII受體分子表達在細胞表面，將小鼠FcyRIII編碼區cDNA及小鼠y-chain編碼區cDNA亞克隆到表達載體pcDNA3，共轉染COS-7細胞，通過G418抗性篩選和連續克隆化，獲得了在COS-7細胞表面穩定表達受體分子的小鼠FcYRIII轉染細胞株，其IgG-RBC玫瑰花環形成率可達95%，用玫瑰花環抑制試驗檢測本發明多肽對小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制效果。本發明的積極有益效果1.本項發明利用生物信息學、多肽合成、細胞免疫學和分子生物學等技術，以化學合成多肽分析鑑定小鼠FcyRIII的線性配體結合表位，進行了多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制，表明線性表位多肽對小鼠FcyRIH親和小鼠IgG顯現出良好的抑制功效，參見圖6;還進行了多肽對小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制，用玫瑰花環抑制試驗檢測本發明多肽對小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制效果，其IgG-RBC玫瑰花環形成率可達95%，參見圖10、圖11。2.本發明是首次開展對小鼠FcR線性配體結合表位的探索研究，用合成肽的方法精確定位了小鼠FcvRin配體結合表位，構建了小鼠FcYRIII、Y-chain共轉染穩定表達細胞系，對深入了解FcyR-IgG相互作用的分子基礎有重要意義，為小鼠FcR耙標藥物的分子設計提供新的思路。3.小鼠FcyRIII線性配體結合表位多肽的發明，為尋找療效高而副作用小、治療自身免疫病的藥物提供了新思路，對解決目前困擾人類身體健康的自身免疫性疾病具有重要意義。四.圖1.是顯示FeYRIIIEC2結構域胺基酸序列比對結果圖2.是顯示重組質粒pETmRIIIPCR、酶切鑑定結果圖中，1:PCR產物；2:酶切產物；Ml:DL2000DNAmarker;M2:i-EcoT14IDNAmarker。圖3.是顯示mFcYRlII誘導表達及Westernblot鑑定結果圖中，M:蛋白marker;1:pET-28a，誘導後；2:pETmRlII，誘導前；3:pETmRlII，誘導後；4:pETmRIII，誘導後；5:pETmRIII，誘導前。圖4.是顯示mFcYRlII蛋白可溶性分析及純化結果圖中，M:蛋白marker;1:裂解液上清；2:包涵體；3:純化後蛋白圖5.是顯示ELISA檢測復性蛋白mRIII的活性曲線圖6.是顯示mRlII3多肽對小鼠IgG與可溶性mFcYRlII結合的抑制曲線圖中，1:BSA曲線，2:controlpeptide曲線，3:mRlH3曲線圖7.是顯示真核表達質粒pc3mY、pc3mRI11的PCR和酶切鑑定結果圖中，Ml:DL2000Marker(2000,1000,750,500,250);1:mR-YPCR擴增產物；2:pc3my被HindIII和XhoI酶切的產物；3.mRIIIPCR擴增產物；4.pc3mRIH被HindIII和EcoRI酶切的產物；M2:人-EcoT14IDNAmarker100bp。圖8.是顯示mFcYRIH、nry-chain共轉染細胞的免疫螢光檢測結果圖中，A:轉染pc3huRI1的COS-7細胞(200x);B:未轉染的COS-7細胞(200".圖9.是顯示mFcyRin、my-chain共轉染細胞的PCR檢測結果圖中，Ml:DL2000Marker(2000,1000,750，500,250);1:mRyyPCR擴增產物；2:mRIIIPCR擴增產物.圖lO.是顯示穩定表達mFcYRIII細胞株玫瑰花環檢測結果A:轉染pc3mRIH的COS-7細胞(200x);B:未轉染的COS-7細胞(200x)。圖ll.是顯示mRIH3多肽抑制小鼠IgG與穩定表達在COS-7細胞上mFcYRIII的結合五.具體實施例方式實施例一mFcYRIII多肽設計利用DNASIS(Ver.2.5，Hitachi)軟體將boF(7RIIIA(X99695)與huFcyRIIIA(NP—000560)、huFcyRinB(NP—000561)和moFc7RI11(NPJ)34318)的胺基酸序列進行比對(參見圖l)，參照huFcYRIIIB(Sondermannetal.，2000;Radaevetal.，2001)的晶體結構，設計合成mFcyRIII多肽6條，分別覆蓋其EC2結構域的A-B、B-C、C-C，、D-E、E-F和F-G環，除moRIIK和moRin6多肽N端含有Cys外，其餘4條多肽N端均加入Cys，用於載體蛋白偶聯。實施例二n1Fc7Rin多肽的合成程序及篩選程序利用Symphony12通道多肽合成儀(ProteinTechnologiesInc.)在Fmoc-胺基酸-王樹脂(Fmoc-AminoAcidsattachedtoWangResin,上海吉爾)上以固相多肽合成方法(solid-phasepeptidesynthesis)合成多肽，多肽合成按標準操作規程進行。具體流程如下設計合成多肽序列—p印tide程序分析—設計合成程序—按樹脂的取代值計算並稱取Fmoc-AA-Wang-resin或Rinkresin—DMF溶漲樹脂—*加20%piperidine脫Fmoc保護，攪動6min—^q下一位胺基酸和HBTU進行醯化反應，N2攪動反應30min"^用Kaiser法或TNBS法測試反應的完成情況—*DMF洗5次，每次lmin—重複帶有*的步驟，在樹脂上連接下一位胺基酸，直到該多肽序列合成完成—用TFA法裂解肽鏈與樹脂的連接—冷乙醚沉澱TFA多肽—SephadexG-25脫鹽純化—HPLC和LC-MS分析鑑定和純化多肽—多肽與載體的偶聯—Dot-ELISA測試小鼠lgG與多肽的結合—測試多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制—測試多肽對lgG-細胞表面受體結合的抑制。小鼠FcYRIII多肽按5-20nmol/條合成，在其N端均含有Cys殘基，可與SMCC雙功能試劑形成二硫鍵，偶聯於載體蛋白。合成多肽經HPLC和LC-MS鑑定，其結構正確，純度均可達到80%以上。實施例三小鼠FcYRIII多肽的偶聯應用異型雙功能試齊USulfo-SMCC(MW:436.37,SpacerArmLength:11.6A，Pierce)通過將載體蛋白BSA上的-NH2和多肽N端Cys的-SH相連，形成人工結合抗原多肽BSA-Pep。偶聯歩驟為(1)稱取4mg無IgG的牛血清白蛋白(IgG-freeBSA，Sigma-Aldrich)溶於0.5ml偶聯緩衝液(O.lMPBpH7.2,0.15MNaCl,1|iMEDTA);(2)在50plDMSO中溶解lmgSulfo-SMCC(MW:436.37，Spacerarmlength:11.6A，Pierce),加入BSA溶液，充分混勻，室溫反應lh或37'C30min，並不時混勻；(3)4'C對偶聯緩衝液過夜透析，換液3次，去除多餘偶聯劑。該溶液即為SMCC活化BSA載體蛋白(SMCC-BSA)，用偶聯緩衝液調整蛋白濃度為5mg/ml;(4)稱取2mg多肽/條，以50nl二甲基甲醯胺(DMF)充分溶解，加入150nl含5mMEDTA的0.01MPB(pH7.2),製備多肽儲存液，濃度為IOmg/ml;(5)偶聯時，取10pl多肽儲存液(100照)，加入等體積含5mMEDTA的0.01MPB(pH7.2);與20piSMCC-BSA溶液(IOO嗎)充分混合，室溫反應4h，4。C過夜孵育；(6)以0.01MPB(pH7.2)調整偶聯多肽濃度至lmg/ml，用於小鼠IgG結合試驗。實施例四小鼠FcyRIII受體線性配體結合表位的初步鑑定Dot-blot:在硝酸纖維素膜(Millipore)上點印BSA偶聯多肽(lpg/dot)，以小鼠FcyRIII重組蛋白(moRIlI)和載體蛋白BSA作陽性和陰性對照；自然乾燥後，將印跡膜放入含0.2%明膠中37'C封閉1h;加入10pg/mlHRP標記小鼠IgG(HRP-IgG)溶液37'C孵育1h，以PBST充分洗滌；用AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)顯色試劑盒(中杉金橋公司)，參照操作說明進行顯色。結果判定時，以包被小鼠FcYRIII重組蛋白點呈現棕紅色顏色反應，BSA對照點不出現顏色反應進行判定(見表1)。tableseeoriginaldocumentpage8表中a:為了後續的連接多肽序列的N端括號內是另外加上的半胱氨酸殘基;b:Dot-blot檢測各條肽與小鼠IgG的結合."+"表明小鼠IgG與該肽特異結合，"-"表明小鼠IgG與該肽不結合；C:根據huFcYRIII的晶體結構預測的部位。實施例五線性配體結合表位多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制1.mFc/RIII與mFcY-cliaiii基因的克隆取小鼠外周血白細胞，用UNIQ-lO柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA，將分離的總RNA按照TAKARA3'FULLRACE試劑盒說明合成cDNA。反轉錄體系為30nl:TotalRNA(約1.5fig)4^L，OHgod(T)18(50pmol/fiL)3pL，5xM-MLVBuffer6pL,dNTPMixture(10mMeach)3fiL,RNaseInhibitor(40u/pL)0.75pL，ReverseTranscriptaseM曙MLV(RNaseH)(200u/ftL)0.75fiL，RNasefreeWater12.5jiL。將上述反應液混合後在PCR儀中按下面程序進行反轉錄反應42X:60min,72°C15min。以mFcRIII-F5'CAGGAATTCGCAGCTCTTCCGAAGGCT3'，mFcRIII-R5,GGCCTCGAGTTAGATGGAGGATGTAGTTG3'為引物，擴增全長mFcyRin基因序列，PCR反應體系為25uL:cDNA4jiL，TAKARALATaq0.25jiL，10xLAbuffer2.5jiL，200910065039.0說明書第7/14頁dNTP(2.5mMeach)2jiL，moFcRIII隱F(上遊引物)(20pmol/fiL)1moFcRIII-R(下遊引物)(20pmoI/nL)1nL，Water14.25jiL。PCR條件為94。C3min1個循環；94°C30sec，55'C鄰sec，72°C2min,共35個循環；72°C10min。將？01產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定，並回收目的片段。將目的片段與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌，構建克隆載體mRIII-T。以myF:5'-CCAGCGCACCCAGGATGAT-3'，myR:5'-AGCACAGAGGTGACCAAGAGG-3'為引物，擴增小鼠Y鏈(邁Y-chain)並構建克隆載體nry-T。2.mFcyRin在大腸桿菌中的表達2.1mFcyRIII胞外區原核表達載體pETmRIII的構建以mRIII-T質粒為模板，以引物mRIU28a-F:5'-CAGGAATTCGCAGCTCTTCCGAAGGCT-3'，mRIII28a-R:5'-GGCCTCGAGTTAGATGGAGGATGTAGTTG-3'擴增mFc/RIII胞外區基因，在PCR產物兩端分別引入EcoRI和XAoI酶切位點。PCR反應體系為50uL:PremixTaq25jiL，模板DNA2nL，邁RIII28a-F(上遊引物)2jiL，邁RIII28a-R(下遊引物)2jiL，Water19pL。PCR條件為94°C3min1個循環；94"30sec，55°C30sec，72"Clmin，共35個循環；72'C10min。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定，並回收目的片段經五coRI和XAoI雙酶切，獲得的目的片斷插入表達載體pET28a相應酶切位點，重組pET28a轉化表達菌BL21(DE3),挑取單克隆提取質粒進行酶切鑑定，並命名為pETmRIII。2.2mRIII蛋白的表達將陽性重組質粒轉化到BL21(DE3)表達宿主菌中，挑取單菌落，接種到5mlLB(含IOOpg/mL卡那黴素)培養基中37'C振蕩培養過夜，次日以10y。的接種量轉入5邁l的LB培養基(含100jxg/mL卡那黴素)中，培養至OD600nm約0.6時，加IPTG(終濃度為1mmol/L)進行誘導，再於37。C培養3-7h，離心(4000r/minx20min)收集菌體，用含400pg/ml溶菌酶的PBS重懸菌體，30'C水浴30min裂解細菌，超聲波處理裂解菌體溶液(工作3s間歇8s，重複99次)，4'C12000r/min離心20min，分離細胞裂解液上清和沉澱，以SDS-PAGE鑑定表達結果。2.3Westernblot檢測IPTG誘導的pETmRIII全菌和未誘導全菌進行12%SDS-PAGE後，將電泳分離的蛋白帶電轉到PVDF膜，0.2%明膠封閉過夜，將膜放入PBST中洗6次，每次3min，加1:600倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的小鼠IgG37'C孵育1h,PBST洗膜6次，每次3min,AEC(3-Amino-9-e也ylcarbazole)顯色檢測目的蛋白。2.4包涵體純化誘導表達250ml細菌培養物，離心收集表達菌體。在20ml裂解緩衝液(10mMTrisPH8.0，150mMNaCl,10mMEDTA,10%甘油，2mMDTT，0.5mMPMSF,400ng/ml溶菌酶)中超聲破碎後，離心收集包涵體沉澱。用洗滌緩衝液(l%Triton-100,50mMTrisPH8.0,100mMNaCl,lOmMEDTA,2mMDTT)洗滌包涵體5次，每次25ml;然後用重懸緩衝液(50mMTrisPH8.0，100mMNaCl,10mMEDTA，2mMDTT)洗滌1次，最後離心沉澱即為純化後的包涵體。2.5mRIII蛋白的復性稀釋復性法將洗漆純化後的包涵體用2ml變性液(6mol/L鹽酸胍，50mmol/LTris誦ClpH8.0，10mmol/LEDTA,10mmol/LDTT,100mMNaCl，10%甘油)於4。C攪拌約10h溶解變性，離心去除不溶物，再用變性液將其稀釋至5ml，室溫放置0.5-1h;將變性液分四批逐滴加入250ml復性緩衝液(100mMTrispH8.0,400mML-精氨酸鹽酸鹽，2mMEDTA，5mM還原型谷光苷肽，0.5mM氧化型谷光苷肽，0.1mMPMSF，0.1mM疊氮化鈉)中，終濃度為0.1mg/mL，每次間隔12h，使復性時間達到60h。將250ml復性液8000r/min4'C離心25邁in，取上清，用5kDa濃縮管把上清復性液濃縮至所需濃度。2.6ELISA鑑定復性蛋白活性分別以10pg/mLmRIII復性前和復性後蛋白包被酶標板，0.2%明膠封閉。分別將不同濃度的辣根過氧化物酶標記的小鼠IgG(HRP-mlgG)(0.01-25ng/ml)溶液加入包被板中，檢測HRP-mlgG與酶標板上mRIII復性前和復性後蛋白的結合，比較復性前後蛋白的活性。以不結合小鼠IgG的BSA為陰性對照蛋白。2.7多肽抑制小鼠IgG與可溶性重組蛋白的結合以10ng/mlmFcyRIII重組蛋白包被酶標板，0.2%明膠封閉。分別將不同濃度的多肽(0.1-70pM)與等體積10jig/mlHRP-IgG溶液混合，置4"C反應2h;將多肽-IgG混合物加入mRIII重組蛋白包被板中，檢測小鼠IgG與酶標板上mRIII重組蛋白的結合，測定多肽對mRIII蛋白結合小鼠IgG的抑制效率。不結合小鼠IgG的多肽和無關蛋白BSA為陰性對照。3.結果3.1pETmRIII表達載體的構建以重組質粒mRIII-T為模板，以引物mRIII28a-F和mRIII28a-R擴增mFcyRni胞外區基因，通過五coRI和XAoI雙酶切將mFcYRIIl胞外區基因定向插入表達載體pET-28a中。經過PCR鑑定和酶切鑑定，結果表明mFcYRIII胞外區基因已定向插入到表達載體中，獲得重組表達質粒pETmRin(參見圖2)。3.2mFcYRin蛋白的誘導表達、可溶性分析及Westernblot鑑定分別取IPTG誘導1h、2h、3h、4h後的表達產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE),在25.7)左右處均出現一條明顯的特徵蛋白質表達帶，並且IPTG誘導3h後蛋白質表達量趨於穩定。將菌體經超聲破碎，離心後得上清液和沉澱，上清未見到表達產物，表明體外重組表達蛋白主要以包涵體形式存在(參見圖2)。表達蛋白在PVDF膜上顯示一大小為25.7kD的蛋白印跡，而重組質粒誘導前細菌裂解液則沒有，表明表達蛋白能與小鼠IgG特異結合(參見圖3)。3.3mFcYRin蛋白的純化根據文獻報導，pH值偏鹼的變性液有利於復性，我們採用了pH8.0緩衝液對mFcyRIII包涵體進行六次超聲洗滌純化，SDS-PAGE分析顯示，洗滌後包涵體純度90%以上(參見圖4)，表明洗滌效果較好，為以後的復性奠定了基礎。3.4ELISA檢測復性蛋白的活性純化後的蛋白進一步經稀釋復性以獲得適當空間結構。為了檢測復性蛋白mFcyRIII與配體的結合活性，我們將復性後和復性前蛋白(包涵體)均以10pg/ml包被酶標板，用不同濃度的HRP-mlgG(0.01-25pg/ml)進行檢測，如圖5所示，隨著配體濃度的升高二者ELISA的OD值區別顯著變大，表明經稀釋復性後已獲得具有活性的蛋白(圖5結果為三次重複實驗的平均值)。3.5多肽抑制小鼠IgG與可溶性受體的結合用mRIH3多肽與HRP-mlgG相作用，測定其對可溶性1nFc7Rm結合小鼠IgG的抑制作用。在競爭ELISA中，mRIII3多肽能夠抑制小鼠lgG與可溶性mFcyRin的結合，抑制能力隨著mRIII3多肽濃度的增加而增強，但並不能完全抑制，而不結合小鼠IgG的對照多肽及BSA對HRP-IgG與可溶性受體的結合未產生明顯影響(參見圖6，圖6為三次重複實驗結果的平均值)。實施例六多肽抑制IgG與細胞表面受體的結合l.真核重組表達載體的構建和鑑定以RIII-T質粒為模板，以引物moRHI-pc+:5'-CGAAAGCTTAGAATGGCTTTGGACACCCA誦3'，moRIII-pc-:5'-TATCTCGAGGATGGGGTGTCACTTG-3'擴增mFcYRIII編碼區(ORF)全長cDNA(含信號肽序列)，PCR反應體系為50uL:PremixTaq25jiL，模板DNA2fiL，moRIII-pc+2fiL，moRIII-pc-2jiL，Water19pL。PCR條件為94。C3minl個循環；94。C30sec，55。C30sec，72°C1min,共35個循環；72。Cl0min。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定，並回收目的片段經歷'"dlII和^oI雙酶切，獲得的目的片斷插入表達載體pcDNA3相應酶切位點，重組pcDNA3轉化感受態大腸桿菌(JM109)，並以含50ng/mL氨苄青黴素的營養瓊脂平板培養。挑取單克隆提取質粒進行酶切鑑定，並命名為pc3mRHI。以RIII-T質粒為模板，以引物my-pc+:5'-CCAAAGCTTCCAGGATGATCTCAGC-3'，my-pc-:5'-TGAGAATTCTGCAGCCAAGCACGTC-3'構建並鑑定mv-chain真核表達載體pc3nty。2.細胞轉染2.1質粒製備用Qiagen質粒提取試劑盒提取純化真核表達質粒pc3mRI11。以戶FCH單酶切質粒pc3mRHI、pc3mY,經1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定，並回收目的片段用無菌水溶解，以核酸蛋白分析儀(Beckman公司)測定DNA含量。線性化表達質粒pc3mRI11、pc3mY用於pc3mRIII的穩定表達。2.2細胞共轉染與篩選利用脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑以線性化pc3mRIH、pc3my質粒共轉染COS-7細胞。轉染48h後消化轉染細胞，以20邁L含400jig/mLG418的DMEM/10完全培養基重懸細胞，然後轉至96孔培養板，每孔200fiL，置37°C50mL/LC02培養箱中培養，每34d換液1次。轉染後710d，待細胞克隆長至l/4l/2孔時，消化細胞克隆，將細胞轉至另一96孔培養板擴大培養，待長成細胞單層後，以免疫螢光檢觀iJmFcYRIII的表達，保留原96孔板細胞繼續培養。2.3轉染細胞的克隆以有限稀釋法對陽性轉染細胞克隆進行連續3次克隆化，建立穩定表達mFcYRIII的細胞株。將免疫螢光檢測陽性細胞克隆轉入24孔培養板中擴大培養，用含200jig/inLG418的DMEM/10選擇培養基稀釋細胞至510celIs/mL，接種96孔細胞培養板，每孔200^L，37°C50mL/LC02培養箱中培養1015d，以免疫螢光檢測mFcYRIII的表達。對mFcyRIII陽性細胞克隆進行2次和3次克隆化，使其克隆孔玫瑰花環形成率達95%以上，並在液氮中凍存克隆細胞。3.免疫螢光檢測將共轉染pe3mRin、pc3mY的COS-7細胞以lxl5密度種植在96孔板中，同時以未轉染pc3mRHI、pc3my的COS-7細胞作為對照，24h細胞貼壁後用PBS緩衝液衝洗3次，封閉液(0.002g/mL明膠)封閉30min,以FITC標記的小鼠IgG閉光孵育1h，PBS緩衝液衝洗後用雷射掃描共聚焦顯微鏡觀察mFcyRIII在細胞上的表達情況。4.共轉然細胞株PCR鑑定將共轉染pc3mRIH、pc3mY的COS-7細胞種植於細胞培養瓶中，待長至單層消化，提取細胞RNA，反轉錄成cDNA，用moRIII-pc+和moRIII-pc-，my-pc+和m，pc-為引物，分別擴增mFcyRIII與my-chain。5.玫瑰花環試驗參照張改平研究員論文中的玫瑰花環形成方法(該論文出處為ZhangG.1994.BovinelgGFcReceptors(PhDThesis),UniversityofHertfordshire,Hatfield.，p54-58)，以玫瑰花環試驗檢測mFcyRm在COS-7轉染細胞表面與其配體小鼠IgG的結合。採集健康雞抗凝外周血，1000r/min離心5min，分離雞RBC，用PBS洗滌3次，製備0.5%的RBC懸液；在96孔血凝板中，用PBS倍比稀釋小鼠IgG，50jiL/孔；加入0.5°/。的拙<:懸液，振蕩混勻；室溫靜置lh，觀察血凝結果，測定小鼠IgG的效價。在新鮮雞RBC懸液中加入半數凝集量的小鼠IgG溶液，混勻後，4'C孵育2h;1000r/min離心5min，棄上清，用PBS洗滌3次，去除未結合IgG;以無血清的DMEM/0培養基重懸小鼠lgG致敏的RBC，製備0.5。/。IgG-RBC懸液。在96孔板中培養pc3mRin、pc3mY共轉染細胞，待細胞長成單層，以預溫的無血清培養基DMEM/0培養基(37'C)漂洗細胞，加入DMEM/0培養基，每孔200fiL，37'C孵育2h，以洗脫結合在細胞表面的牛IgG;將10mL/L小鼠IgG-RBC懸液緩慢加到細胞單層，每孔50fiL;37'C孵育10min,室溫靜置35min:用PBS輕柔漂洗6次；用甲醇(含3mL/LH202)室溫固定細胞10min,PBS漂洗3次；每？L加PBS100(iL，在顯微鏡下觀察細胞表面形成的玫瑰花環。在細胞單層加入10ng/mLHRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，每孔50nL，37'C孵育30min;用PBST充分洗滌，以AEC染色試劑盒染色；用顯微鏡觀察玫瑰花環中RBC的顯色。6.線性配體結合表位多肽對IgG-細胞表面受體結合的抑制在半數凝集量的基礎上用DMEM/0培養基倍比稀釋小鼠IgG，分别致敏雞RBC;將不同致敏量的IgG-RBC加到穩定表達mFcYRIII的轉染細胞單層，進行玫瑰花環試驗，測定形成明顯玫瑰花環的IgG臨界致敏量。以臨界致敏量小鼠IgG致敏雞RBC，製備1%IgG-RBC懸液。用DMEM/0培養基倍比稀釋mFcYRIII多肽，分別與等體積1%IgG-RBC懸液混合，置4'C反應2h，以不同濃度的多肽(10-1280nM)結合小鼠IgG:將多肽-IgG-RBC混合物加到穩定表達mFcyRIII的轉染細胞單層，進行玫瑰花環試驗，分別計數3個視野(100x)內形成的玫瑰花環數。設定不含多肽的DMEM/0培養基對照形成的IgG-RBC玫瑰花環數為100%,計算mFcyRIII多肽對IgG-RBC玫瑰花環形成的抑制效率。不結合小鼠IgG的mR3'多肽為陰性對照多肽。7.結果7.1真核表達質粒pc3mRin與pc3mY的構建以克隆到T載體上的陽性質粒為模板，用引物moRin-pc+和moRIII-pc-，擴增到mFcyRIII編碼區(ORF)全長830bpcDNA(含信號肽)序列。將mFcyRIII全長cDNA亞克隆到pcDNA3的巨細胞病毒啟動子(Pcmv)下遊，經PCR鑑定及五coRl和J^oI雙酶切鑑定，成功構建了真核表達質粒pc3mRHI，以同樣方法構建真核表達質粒pc3mY，鑑定結果參見圖7。7.2mFcyRIII在COS-7細胞表面的表達及其與配體的結合共轉然細胞表達mFcYMII受體分子的共轉染細胞，以小鼠IgG-FITC進行免疫螢光檢領lj，在轉染細胞周圍明顯看到的綠色螢光，而未轉染的COS-7對照細胞不結合IgG-FITC沒有看到綠色螢光(參見圖8)，表明表達於轉染細胞表面的mFcyRIII受體分子能與小鼠IgG特異結合。7.3PCR鑑定mFcYRIII、nry-chain共轉染細胞株提取共轉染細胞RNA，反轉錄成cDNA，以moRIII-pc+、moRIII-pc-、m"pc+、my-pc-為引物，分別擴增得到mFcyRIII與mY-chain。表明基因mFcyRIII與my-chain巳成功整合到COS-7細胞中(參見圖9)。7.4穩定表達mFcyRIII轉染細胞株的建立以線性化表達質粒pc3邁RIH、pc3mY共轉染COS-7細胞，經G418選擇性培養、玫瑰花環檢測和連續克隆化，建立了穩定表達mFcyRIII的轉染細胞株，95V。以上的轉染細胞看到玫瑰花環，參見圖10A;而未轉染的COS-7對照細胞未看到螢光，參見圖10B，表明mFcyRIII受體分子有效表達於轉染細胞表面。7.5線性配體結合表位多肽對IgG-細胞表面受體結合的抑制以臨界致敏量小鼠IgG致敏雞RBC，製備1%IgG-RBC懸液。用DMEM/0培養基倍比稀釋mRIII3多肽，分別與等體積"/。IgG-RBC懸液混合，置4iC反應2h，以不同濃度的多肽(10-1280jiM)結合小鼠IgG;將多肽-IgG-RBC混合物加到穩定表達mFcYRIII的轉染細胞單層，進行玫瑰花環試驗，分別計數3個視野內形成的玫瑰花環數。設定不含多肽的DMEM/0培養基對照形成的IgG-RBC玫瑰花環數為100%,計算mRIH3多肽對IgG-RBC玫瑰花環形成的抑制效率。不結合小鼠IgG的多肽為陰性對照多肽(參見圖ll)。序列表河南省農業科學院小鼠FcYRIII線性配體結合表位分子生物學、免疫學和生物信息學技術1Patentlnversion3.2113PRT人工序列1CysSerPhePheHisAsnGluLysSerValArgTyrHis1510權利要求1.小鼠FcγRIII受體線性配體結合表位，其胺基酸序列為CysSerPhePheHisAsnGluLysSerValArgTyrHis。2.根據權利要求1中所述的小鼠FCYRIII受體線性配體結合表位，其特徵是:所述的線性配體結合表位為合成多肽。3.根據權利要求l中所述的小鼠Fc7RIII受體線性配體結合表位，其特徵是:所述的線性配體結合表位多肽鏈N端氨基化或乙醯化，或C端羧基化或醯胺化。4.編碼權利要求1所述的小鼠F(7RIII受體線性配體結合表位的核苷酸序列。全文摘要本發明涉及小鼠mFcγRIII線性配體結合表位，該表位的胺基酸序列為CysSerPhePheHisAsnGluLysSerValArgTyrHis。本發明以化學合成多肽分析鑑定小鼠FcγRIII的線性配體結合表位，進行了多肽對小鼠IgG-可溶性受體結合的抑制，表明線性表位多肽對小鼠FcγRIII親和小鼠IgG顯現出良好的抑制功效；通過多肽對小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制，用玫瑰花環抑制試驗檢測本發明多肽對小鼠IgG-細胞表面受體結合的抑制效果，其IgG-RBC玫瑰花環形成率可達95％。本發明首次開展的小鼠FcR線性配體結合表位的探索研究，用合成肽方法精確定位了小鼠FcγRIII配體結合表位，構建了小鼠FcγRIII、γ-chain共轉染穩定表達細胞系，對深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基礎有重要意義，為小鼠FcR靶標藥物的分子設計提供新的思路。文檔編號C07K7/00GK101565456SQ200910065039公開日2009年10月28日申請日期2009年5月27日優先權日2009年5月27日發明者喬松林,劉運超,俊席,張利娜,張改平,楊豔豔,麗王,王方雨,苗現偉,東趙,鄧瑞廣,郅玉寶,郭軍慶申請人:河南省農業科學院