抗人cd52單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途的製作方法

2023-05-31 07:41:01 1

專利名稱：抗人cd52單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種可以特異性識別人CD52分子，用於白血病的診斷、預 後判斷，清除正常免疫細胞或治療白血病和自身免疫性疾病的抗人CD52 單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途。
技術背景白血病是威脅人類生命健康的主要幾種疾病之一，在我國發病率大約 為2.76/100000人。其中急性淋巴細胞白血病多見於兒童，急性髓系白血 病多見於成年人，而慢性白血病多發於40歲以上人群。它是一類起源於造 血(或淋巴)幹細胞的惡性疾病。由於幹細胞受損，白血病細胞失去進一 步分化成熟的能力，或者增殖與分化能力不平衡，而停滯在細胞發育的不 同階段，具體表現為細胞在體內無限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白血 病與其它癌症一樣， 一直因為沒有特應性的標誌導致無法用常規藥物準確 殺傷白血病細胞。白血病細胞與正常細胞的區別目前認為主要在於某些生 物分子的表達量不同，利用這些特徵，特別是與造血幹/祖細胞的區別可以 在一定程度上殺傷白血病細胞而不影響造血的重建。特異性識別某種細胞 膜表面分子的抗體正是實現這一目的的最好工具，目前利用抗體治療白血 病主要是通過以下三種途徑抗體結合白血病細胞後通過補體依賴的細胞 毒和抗體依賴細胞介導的細胞毒直接殺傷白血病細胞；抗體結合白血病細 胞表面分子，通過所引發的下遊信號誘導白血病細胞分化或凋亡；通過抗 體的耙向作用將殺傷性藥物或效應物帶入白血病細胞內達到局部殺傷的目 的等。人類CD52分子屬於 一 個未命名的短鏈 GPI (Glycosy1-phosphatidylinositol，糖基磷脂醯肌醇)錨定糖蛋白家族。 它由一條很短的肽鏈組成，只有12個胺基酸殘基(GQNDTSQTSSPS)，在C 末端通過GPI錨定分子連接於細胞膜表面，N末端3位天冬醯胺連接有一個複雜的糖基。CD52分子是一種分布比較廣泛的抗原，分布於造血系統的淋 巴細胞，單核細胞，嗜酸粒細胞上和單核細胞分化的樹突狀細胞。在雄性生殖系統中的附睪和輸精管上皮細胞也有CD52分子的表達。在很多淋巴系 細胞惡性腫瘤和某些急性髓系白血病細胞上也都有CD52分子不同程度的表 達。Quigley應等報導，在92%-100%的毛細胞白血病細胞上都有CD52分 子表達。最近有報導，血液中存在從細胞表面脫落的可溶性CD52分子可以 作為慢性淋巴細胞白血病的標誌。CD52在集落形成細胞上沒有顯著表達， 而在某些被認為是淋巴樣祖細胞的CD34+A:D38+細胞上有表達，Hale G等 總結了 5000多例用抗CD52單抗處理的幹細胞移植研究中證明CD52抗原在 造血幹/祖細胞(CD34+/CD38-)上沒有表達。CD52分子本身的功能目前並不清楚，其很多間接功能都是通過其相應 抗體獲得的，且都與其自身結構特性有關。作為GPI錨定蛋白，CD52分子 被其抗體結合後導致細胞膜重排盡而引發下遊信號，對細胞產生影響。另 外CD52分子在細胞表面往往呈高度有序排列，並且其分子很小，非常有利 於補體的激活。體內應用CD52抗體的實驗證明，在體內由CD52抗體介導 的靶細胞殺傷主要是通過補體介導的細胞毒作用(CDC)和抗體介導細胞依 賴的細胞毒作用(ADCC)實現的。而CD52的高表達和有序排列都利於這些 作用在體內的發揮。最近還有很多證據表明CD52分子對惡性白血病細胞可能是必須的高 度糖基化帶來的負電荷具有抗粘附作用，增加了白血病細胞的遷移能力； CD52陰性細胞致瘤率降低而回輸體內CD52分子會重新出現；CD52分子在 同一個個體中在惡性細胞表面的表達顯著高於正常細胞。以上這些事實均表明CD52分子對於有目的的免疫細胞清除或白血病 治療都是一個良好的靶點，並且對於造血幹/祖細胞影響較小，特異性識別 CD52分子的抗體具有巨大的潛在藥用價值。目前白血病治療主要採用控制增殖、誘導凋亡的化療藥物，包括烷化 劑、抗代謝藥物等。這些藥物在殺死白血病細胞的同時，對正常造血細胞也 有嚴重損傷，故對機體存在嚴重的毒副作用。此外，白血病細胞常會對化 療藥物產生耐藥，同時化療後復發率較高，嚴重影響臨床化療藥物治療的 有效性。發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種可特異性識別正常細胞和白血病細胞表達的人CD52分子，並可用於白血病和自身免疫性疾病的診斷、預 後判斷，清除正常免疫細胞或殺傷白血病細胞的抗人CD52單克隆抗體雜交 瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途，提供的單克 隆抗可以在體外抑制多種白血病細胞系的增殖並誘導其凋亡；提供的抗人 CD52單克隆抗體輕鏈可變區基因和重鏈可變區基因及其表達產物，兩者重 組後表達產生的抗CD52 ScFv片段，能夠特異性結合人CD52分子並能夠降 低鼠源性抗人CD52抗體的免疫源性。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是 一種抗人CD52 單克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCC NO. 2175。一種抗人CD52單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0: 2175雜交瘤分泌。所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬於IgG2a亞型。抗人CD52的工程抗體，由保藏號為CGMCC N0: 2175雜交瘤細胞系經 反轉錄-聚合酶鏈式合成反應製備產生。所述的抗人CD52的工程抗體，由SEQ ID NO. 2重鏈可變區胺基酸序列 和SEQ ID N0.4輕鏈可變區氮基酸序列組成。所述的抗人CD52的工程抗體，編碼所述SEQ ID NO. 2重鏈可變區氨基 酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼所述SEQ ID NO. 4輕鏈可 變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，分別含有SEQ ID NO. 1所 述的重鏈可變區VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3所述的輕鏈可變區VL 基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T載體。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，含有SEQ ID NO.l所述的 重鏈可變區VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述的輕鏈可變區VL基因核 苷酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。所述的抗人CD52的單克隆抗體、工程抗體或載體在製備白血病診斷試 劑、免疫抑制類藥物或治療白血病的藥物中的應用。一種免疫檢測試劑盒，上述的單克隆抗體或工程抗體或載體。所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性疾病；或評價惡性腫瘤或自身免疫性疾病的發展和預後；或指導惡性腫瘤或自身免疫性疾 病的治療中的用途。抗人CD52的工程抗體由保藏號為CGMCC NO: 2175 (保藏於中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC NO: 2175，保藏日2007-9-18) 雜交瘤經反轉錄-聚合酶鏈式合成反應製備產生，屬於IgG2a亞型，該抗體 能特異性結合人CD52分子，在體外對於多種白血病細胞系具有一定的生長 抑制和促凋亡作用。因CD52分子在多種白血病細胞表面均呈高密度有序排 列，還非常有利於ADCC和CDC作用的發揮，是一種良好的靶向治療位點。 因此抗人CD52單克隆抗體是一種具有巨大潛力藥用抗體。人體對鼠源性抗 體的免疫反應(HAMA反應)是鼠源性抗體應用於臨床治療的主要障礙，而 基因工程抗體較好的解決了這個問題，它既保留了鼠源單抗的特異親和力， 又大大降低了鼠單抗的異源性，因而具有廣闊的應用前景。我們應用RT-PCR技術，成功的從雜交瘤細胞中克隆到抗人CD52抗體 的輕重鏈可變區基因，並將抗CD52抗體的輕重鏈可變區基因克隆到原核 表達載體，構建抗人CD52抗體的單鏈抗體，降低鼠源性抗人CD52抗體的 免疫原性，並在大腸桿菌中進行高效分泌性表達，從而提高其產量，降低 生產成本。單鏈抗體的優勢在於較全抗分子量小，穿透能力強，構建周期 短，抗原性低，易於基因工程操作，為進一步研究其它工程抗體奠定基礎。 可在大腸桿菌中表達，易於大量生產，生產成本低。所述的抗人CD52單克隆抗體在白血病和自身免疫性疾病的診斷，病程 評價，預後判斷和指導治療中的應用。CD52高表達在很多白血病惡性細胞表面。有文獻表明，在病人體內， 惡性細胞表面的CD52密度遠遠大於體內的正常細胞，CD52抗原具有的高度糖基化帶來的細胞表面負電荷的增加被認為與細胞的惡性程度城正相關 性。還有觀察報導惡性細胞表面CD52抗原分子可能脫落於血液中，檢測病 人血清中的可溶性CD52分子可以作為診斷白血病的一個標誌。CD52還表達在正常淋巴細胞表面，單核細胞核和多種抗原提呈細胞表 面，CD52表達量的多少可以對細胞的分類和免疫力的判斷提供重要指標。當準備使用CD52抗體藥物治療疾病時，檢測細胞表面的CD52表達情 況可以為治療提供數據支持，治療過程中繼續檢測細胞表面的CD52表達情況或者表達CD52的細胞群狀況有助於幫助了解治療效果和病程進展。


圖1是抗人CD52單克隆抗體對白血病細胞系生長狀態的影響。 圖2是胎盼蘭拒染法檢測HI186對多種白血病細胞系的生長抑制作用。 圖3是Annexin V試劑盒檢測抗人CD52單克隆抗體誘導白血病細胞系 凋亡的作用。圖4是PCR擴增VL， VH基因片段電泳圖。1: VL 2: VH 3: Marker。 圖5是抗人CD52 ScFv表達載體PET22b (+) -ScFv結構示意圖。 圖6是PCR擴增單鏈抗體(ScFv)基因片段圖譜。1-3: ScFv 4: Marker。 圖7是ScFv表達產物的SDS-PAGE (10%)圖譜。1:未誘導菌體蛋白； 2:誘導後全菌蛋白；3: Marker; 4:包涵體及不溶性全菌蛋白；5:可溶性蛋白。圖8是抗人CD52-ScFv的Western blot分析。1:未誘導菌體蛋白；2: 誘導後全菌蛋白；3: Marker; 4:包涵體及不溶性全菌蛋白；5:可溶性蛋 白。圖9是競爭性免疫螢光抑制實驗。(1 ) HPB-ALL白血病細胞系檢測； (2):正常人外周血檢測。相同條件下，由於CD52-ScFV的競爭作用，鼠 源性抗體HI186的反應陽性率或螢光強度明顯下降。圖10是利用天然細胞膜表面的CD52分子與抗人CD52-ScFv進行的West blot分析。1:抗人CD52-ScFv; 2: Marker; 3:抗人CD52單克隆抗體。圖11是抗人CD52單克隆抗體檢測REH細胞表面的CD52表達情況。製備抗人CD52的工程抗體的雜交瘤保藏於中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心CGMCC N0: 2175，保藏日2007-9-18。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的可特異性識別正常細胞和白 血病細胞表達的人CD52分子，並可用於清除正常免疫細胞或殺傷白血病細 胞的抗人CD52工程抗體、載體、試劑盒及其用途作進一步的詳細說明一種抗人CD52單克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為 CGMCC NO. 2175。一種抗人CD52單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO: 2175雜交瘤分泌。所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬於IgG2a亞型。抗人CD52的工程抗體，由保藏號為CGMCC N0: 2175雜交瘤細胞系經 反轉錄-聚合酶鏈式合成反應製備產生。所述的抗人CD52的工程抗體，由SEQ ID NO. 2重鏈可變區胺基酸序列 和SEQ ID N0.4輕鏈可變區胺基酸序列組成。所述的抗人CD52的工程抗體，編碼所述SEQ ID NO. 2重鏈可變區氨基 酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼所述SEQ ID NO. 4輕鏈可 變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，分別含有SEQ ID NO. 1所 述的重鏈可變區VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3所述的輕鏈可變區VL 基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T載體。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，含有SEQ ID NO. 1所述的 重鏈可變區VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述的輕鏈可變區VL基因核 苷酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。所述的抗人CD52的單克隆抗體、工程抗體或載體在製備白血病診斷試 劑、免疫抑制類藥物或治療白血病的藥物中的應用。一種免疫檢測試劑盒，上述的單克隆抗體或工程抗體或載體。所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性疾病；或評價惡 性腫瘤或自身免疫性疾病的發展和預後；或指導惡性腫瘤或自身免疫性疾 病的治療中的用途。實施例1小鼠抗人CD52單克隆抗體的製備及螢光標記以分離的人扁桃腺細胞為抗原，常規方法免疫6周齡Balb/c小鼠，首 次基礎免疫使用福氏完全佐劑，每隔3周進行一次基礎免疫，共三次，2X 107細胞/只，次，最後一次基礎免疫後3周後脾內注射加強免疫，1X107 細胞/只；3天後取脾，與NS1小鼠骨髓瘤細胞進行融合，按常規雜交瘤制 備方法進行。融合12天後，收集單克隆生長的融合孔上清，利用間接免疫 螢光法，選擇CD52陽性的靶細胞系進行篩選鑑定，選擇反應性好，生長狀 態好的雜交瘤細胞進行亞克隆，得到穩定分泌抗人CD52單克隆抗體的雜交 瘤細胞株，命名為HI186，液氮凍存。於1996年提交國際白細胞分化抗原會議，被確認為識別人類CD52抗原。製備的抗人CD52單克隆抗體的雜交 瘤細胞系保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC NO: 2175採用小鼠腹腔內誘生法，將HI86細胞株接種Balb/c小鼠腹腔，1.5X 107隻，l周后採集腹水，經Protein G S印harose 4FF親和層析柱層析， 製備HI186抗體純品。利用共價連接的方法把螢光素偶聯到抗體上，經分離純化製備出偶聯 複合物，即螢光標記抗體。實施例2抗人CD52單克隆抗體檢測白血病細胞系細胞表面的CD52表達情 況取生長良好的REH細胞離心收集，用PBS調製IX 107ml，每10(^1加 入流式管， 一管加入PE標記CD52抗體， 一管加入PE標記的小鼠IgGl同 型對照，室溫避光反應20分鐘。加入約2mlPBS洗一次，lOOOrpm離心lO 分鐘，棄上清，加入300plPBS，流式細胞儀檢測(見圖ll)。實施例3抗人CD52單克隆抗體可以在體外有效抑制白血病細胞系的生長取生長良好的CD52陽性白血病細胞系，用含20%FBS的RPMI1640 培養液調至1 X 105/ml，按每孔100^1加入96孔培養板。將細胞分為4組。 對照組l:不添加任何抗體；對照組2:加入20嗎/ml羊抗鼠第二抗體；實 驗組1:加入10jig/ml Campath-l;實驗組2:加入10pg/ml Campath-l和 20|ig/ml羊抗鼠第二抗體。置37'C， 5%二氧化碳培養箱培養24-144小時。(1) 細胞形態變化。白血病細胞系與HI186共培養後，可明顯表現出 分散形態，不再具有聚集生長的特徵。HI186單獨或聯合第二抗體作用時， 細胞數目雖然相對對照組有一定的減少，但細胞的聚集生長形態特徵仍可 見。見圖1。(2) 胎盼蘭拒染法檢測細胞生長。HI186可抑制多種白血病細胞系的 增殖。見圖2。實施例4抗人CD52單克隆抗體可以誘導白血病細胞系凋亡取生長良好的CD52陽性白血病細胞系，用含20%FBS的RPMI1640 培養液調至1 X 105/ml，按每孔100^1加入96孔培養板。將細胞分為4組。 對照組l:不添加任何抗體；對照組2:加入20ug/ml羊抗鼠第二抗體；實 驗組l:加入10|ag/mlHI186;實驗組2:加入10嗎/ml HI186和20|ig/ml羊 抗鼠第二抗體。置37匸，5%二氧化碳培養箱培養48小時。收集細胞，PBS 洗滌，Annexin- V試劑盒(Annexin- V -FLOUS staining Kit; ROCHE)檢測細 胞早期凋亡。經檢測，HI186對白血病細胞系作用48小時後，白血病細胞 的早期凋亡率明顯增高。見下表l，圖3。表1 Annexin V試劑盒檢測HI186單獨或聯合第二抗體作用於CD52陽性細胞系時誘實施例5抗CD52抗體的輕重鏈可變區基因克隆應用RT-PCR方法從抗人CD52抗體雜交瘤細胞(保藏於中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC NO: 2175，保藏日2007_9_18) 中克隆抗人CD52抗體的輕重鏈可變區基因-(1) RNA提取採用Trizol —步法，1)取雜交瘤細胞約106，加入 lmlTrizol，吹打混勻，室溫靜置5分鐘。2)加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩15 秒，室溫靜置2-3分鐘。3) 12000rpm， 4°C，離心15分鐘。4)取上清，加 入0.5 ml異丙醇室溫靜置15分鐘。5) 12000rpm， 4°C，離心15分鐘。6) 棄上清，加入lml75。/。的乙醇洗，7500rpm， 4。C，離心5分鐘。7)棄上清， 沉澱晾乾，加入30pLDEPC水溶解。(2) 逆轉錄為CDNA (40ul):取2. 5mMdNTP4y 1， 5xfirst strand buffer8ul， DTT4ul， 01igodT2ul，水16.6ul，混勻後加入RNA約 2ug， 65。C水浴5分鐘，快速冰浴2-3分鐘。加入50u/u lRNasin0. 4y 1， Superscript II (200u/u 1 ) 1 u 1混勻後37°C水浴>1小時。取出後70°C導細胞凋亡的結果，表中所示為早期凋亡陽性率。對照組 第二抗體抗人CD52單克隆抗體抗人CD52單克隆抗體+第二抗體3. 49% 2. 62% 2. 72% 8. 43%水浴10分鐘。一20。C保存。(3) PCR擴增抗CD44抗體的輕重鏈可變區基因 輕鏈可變區基因PCR擴增反應體系(50ul):設計通用簡併引物，上遊引物5， 一GAC ATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH — 3，；下遊引物5' —CCG TTA GAT CTC CAR BTT KGT SCS — 3，。以cDNA為模板，高保真PfuDNA聚合 酶擴增。PCR循環程序為94°C 5分鐘;94。C30秒，55。C30秒,72。C30秒， 共30個循環；最後72。C延伸10分鐘。重鏈可變區基因PCR擴增反應體系(50ul):上遊引物5， 一CAGGTS MAR CTG CAG SAG TCW GG — 3，;下遊引物5， 一TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC—3，。以cDNA為模板，高保真PfuDNA聚合酶擴增。PCR循環程序為94°C 5分鐘；94°C, 30秒，55C，30秒，72。C，30秒，共35個循環；最後72。C延 伸10分鐘。(4) 測序載體的構建Simple-T載體購自大連寶生物公司。將輕重 鏈可變區基因PCR產物回收，與Simple-T載體連接後，按常規方法氯化鈣 轉化，以lOOyg/ml氨苄濃度篩選陽性克隆，送測序，該基因完全符合蛋 白資料庫中抗體所具有的若干保守的框架胺基酸的特點，該序列為抗體基 因序列。分別命名為T-VH及T-VL，見圖4。實施例6單鏈抗體基因表達載體PET22b(+)ScFv的構建根據輕、重鏈可變區的酶切圖譜及構建載體PET22b(+)的酶切位點，設計併合成了用於VH， VL基因擴增和拼接的引物。 VH上遊引物5' —GAC TCG CCATGG ACC AGG TGC AGC TGC AGG AA—3，； VH下遊引物5' —ACC TCC AGA GCC TCC ACC TCC AGA TCC ACC TCC ACC TGA GGA GAC GGT GAC AGG—3'。VL上遊引物5' —GGA TCT GGA GGT GGAGGC TCT GGA GGT GGA GGC TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG一3';VL下遊引物5， 一CTCGAG CCG TTT GAT TTC CTG—3，。引入克隆用的Nco I /Xho I限制性酶切位點及單鏈抗體的linker序列 (採用最廣泛的(GGGGS) 3為linker)。從所構建的T-VH及T-VL載體中PCR 擴增VH， VL片段，回收後，經重疊延伸拼接法(SOE)通過PCR直接合成ScFv 基因，見圖5。將PET22b(+)載體及回收的ScFv基因分別用Nco I /Xho I 雙酶切，回收後按常規方法進行連接和轉化構建抗人CD52 ScFv表達載體 PET22b(+)ScFv。陽性克隆用NcoI/XhoI雙酶切鑑定後測序確定。正確的 克隆用於表達。測序結果表明正確，按胺基酸序列推測738bp，ScFv約為 26. 8KD的蛋白，見圖6、圖7。實施例7抗人CD52ScFv抗體片段的表達、純化(1)抗人CD52單鏈抗體(ScFv)在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE 分析在3ml含100 u g/ml氨苄青黴素的LB培養基中接種一陽性單菌落， 37"C震蕩培養過夜後，接種30 u 1於3ml含100 y g/ml氨苄青黴素的LB培 養基中，28。C震蕩培養約4小時後，加IPTG至終濃度為0. lmmol/L， IPTG 誘導7小時後收穫菌液，加入細菌滲透性釋放液(Tris-HC1 25mM， EDTA lmM， PMSF0. lmM，蔗糖(20%, w/v)， NaCl 200mM) 20ml， 4。C輕搖1小時。12000g 再次離心，分別收集上清和菌體。各取適量，加入20 u 1 2XSDS上樣buffer, IO(TC煮沸5min。取1上樣，10%SDS-PAGE檢測表達蛋白，考馬斯亮藍 染色。實驗證明實現了重組質粒pET22b (+) ScFv在大腸桿菌中的表達，738bp 片段表達出約28Kd的帶(His) 6的蛋白，見圖7。(2)抗人CD52單鏈抗體(ScFv)純化將按上步收集的菌體沉澱重 懸於1/10培養體積的冰預冷20匪ol/L Tris-HC1 (PH 7.2)，超聲破碎細 胞，13000 rpm， 4。C離心30 min，取上清用於純化。上步收集的上清直接用 於純化。蛋白採用Pharmacia公司的Chelating S印harose Fast Flow進行純 化，按操作手冊平衡鎳柱，掛鎳，清洗。將粗分離的樣品加入鎳離子親合層 析柱，使目的蛋白結合到柱子上，洗滌後，用6倍柱床體積的含500rnM咪 唑的Tris-HC1緩衝液洗脫，洗脫液用PBS緩衝液透析48小時。(3) Western blot鑑定主要參考分子克隆方法進行Western印跡，結果證明條帶為表達產物，見圖8。實施例8抗人CD52 ScFv抗體活性測定競爭性免疫螢光抑制試驗1) 細胞系檢測取CD52表達陽性細胞HPB-ALL細胞系，製成1乂106細胞懸液；加入不 同量的HI186-ScFv，室溫避光孵育l小時；再加入O. 5ugPE標記的HI186 單克隆抗體，室溫避光孵育20分鐘；加入2ml冷PBS緩衝液，重懸，1000 轉/分鐘離心5分鐘，棄上清；加入300ul含P/。多聚甲醛的PBS緩衝液， 流式細胞儀檢測。2) 正常人外周血檢測每管加入正常人抗凝外周血100u 1，加入不同量的HI186-ScFv，室溫 避光孵育1小時；再加入0. 5 u g PE標記的抗人CD52單克隆抗體，室溫避 光孵育20分鐘；加入2ml溶血素室溫避光反應10分鐘後1000轉/分鐘離 心5分鐘，棄上清；加入2ral冷PBS緩衝液，重懸，1000轉/分鐘離心5分 鍾，棄上清；加入300ul含P/。多聚甲醛的PBS緩衝液，流式細胞儀檢測。經抗人CD52 ScFv競爭後，HI186與HPB-ALL細胞繫結合的陽性率降 低為未競爭時的33%，與外周血白細胞反應時螢光強度明顯下降，證明抗人 CD52 ScFv可競爭性抑制HI186與HPB-ALL細胞系及正常人外周血白細胞的 結合，即抗人CD52ScFv能夠與細胞表面的CD52抗原特異性結合，見圖9。 結合變性細胞膜CD52分子活性的Western Blot檢測取生長良好的HPB-ALL細胞約1X107，用冰冷的PBS洗滌細胞，4°C， 3000g離心5分鐘。向細胞沉澱中加入200ul預冷的1X細胞裂解液裂解細 胞，4°C， 30分鐘。4。C離心，10000g， IO分鐘，取上清。儘快加入40ul6 X加樣緩衝液，沸水浴10分鐘。室溫10000g離心10分鐘，棄沉澱取上清。 上樣，每孔加50ul上清，進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束後，分別應 用抗人CD52單克隆抗體和抗人CD52 ScFv,進行western blot檢測。結果顯示抗人CD52 ScFv與抗人CD52單克隆抗體的反應性一致，均能 識別分子量大約為30KD的蛋白。SEQUENCE LISTING 〈110〉協和幹細胞基因工程有限公司〈120〉抗人CD52單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑 盒及其用途<130〉〈160〉 4<170〉 Patentln version 3.3〈210〉 1<211〉 342〈212〉 ■<213〉 小鼠(Mus musculus)〈220〉〈221〉 CDS〈222〉 (1)..(342)<400〉 1cag gtg cag ctg cag gaa tct gga gga ggc ttg gtg caa cct gga gga 48 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15tec atg aaa etc tct tgt get gcc tct gga ttc act ttt agt gac gcc 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30tgg atg gac tgg gtc cgc egg tct cca gag aag ggg ctt gag tgg gU Trp Met Asp Trp Val Arg Arg Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45144get gaa att 3ga_ aac aaa get aaa aat cat gta aca tac tat get gcg Ala Glu lie Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Val Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60192tct gtg咖ggg agg Ser Val Lys Gly Arg 65tlx txc atx tea aga gat gat tec aaa agt agt Phe Ser lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 70 75 80240gtc tac ctg cag atg aac age tta aga cct gaa gac act ggc att tat Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95288tac tgt acc acc etc gac aag tgg ggc caa ggc act cct gtc acc gtc Tyr Cys Thr Thr Leu Asp Lys Trp Gly Gin Gly Thr Pro Val Thr Val 100 105 110336tec tea Ser Ser342〈210〉 2〈211〉 114〈212〉 PRT〈213〉 小鼠(Mus musculus)〈400〉 2Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30Trp Met Asp Trp Val Arg Arg Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45Ala Glu lie Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Val Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95Tyr Cys Thr Thr Leu Asp Lys Trp Gly Gin Gly Thr Pro Val Thr Val 100 105 110Ser Ser〈210〉 3〈211〉 339〈212〉 DNA〈213〉 小鼠(Mus musculus)〈220〉〈221〉 CDS〈222〉 (1)..(339)〈400〉 3 g3C Eltt gtgAsp lie 1ValMeta_cc Thr 5C3gGinact ThrProetc Leuact Thr 10ttg Leuteg Sergtt Val3CCThratt lie 15Gly48Gin Progec Alatec Ser 20ate lietct Sertgc Cys鄉 Lystea Ser 25￡lgtSerGinage Seretc Leutta Leu 30gat Aspagt Ser96gat gga Asp Gly朋g Lys 35Thrtat Tyrctg Leuaat Asntgg Trp 40Leutta Leucag Gin郷 ArgCC3Pro 45ggc Glycag Gintct Ser144CC3 33gPro Lys 50cgceta Leuate liettt Phectg Leu 55gtg Valtct SergC3Alactg Leugac Asp 60tct Serggc Glygtc Valcct Pro192gSLC aggAsp Arg 65ttc Phegict Thrggc Gly縛t Ser 70gga GlySerggg GlyThrgat Asp 75Uc Pheaca Thrctg Leu卿 Argate lie 80240Asn Arggtg ValGluget Ala 85gag Glugat Aspttg Leugg3 Glyatt lie 90tat Tyrtat Tyrtgc Cystgg Trpc犯 Gin 95ggt Gly288aca cat Thr Histtt Pheccg Pro 100tgg Trpa_cg Thrttc Pheggt Glygga Gly 105ggc Glyacc Thr膽gC￡lgGing朋 Glu 110ate lieLys336egg Arg339〈210〉 4〈211〉 113 <212〉 PRT〈213〉 小鼠(Mus musculus) 〈400〉 4Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie Gly 15 10 15Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45Pro Lys Arg Leu lie Phe Leu Val Ser Ala Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie 65 70 75 80Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly lie Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Gin Glu lie Lys 100 105 110Arg
權利要求
1、一種抗人CD52單克隆抗體雜交瘤細胞系，其特徵是所述細胞系的保藏號為CGMCC NO.2175。
2、 一種抗人CD52單克隆抗體，其特徵是由保藏號為CGMCC NO: 2175 雜交瘤分泌。
3、 根據權利要求2所述的抗人CD52單克隆抗體，其特徵是所述的抗 體是鼠源性單克隆抗體，屬於IgG2a亞型。
4、 權利要求2的抗人CD52的工程抗體，其特徵是由保藏號為CGMCC N0: 2175雜交瘤細胞系經反轉錄-聚合酶鏈式合成反應製備產生。
5、 根據權利要求4所述的抗人CD52的工程抗體，其特徵是由SEQ ID NO. 2重鏈可變區胺基酸序列和SEQ ID N0.4輕鏈可變區胺基酸序列組成。
6、 根據權利要求5所述的抗人CD52的工程抗體，其特徵是編碼所述 SEQ ID NO. 2重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編 碼所述 >SEQ ID NO. 4輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示。
7、 含有權利要求4所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，其特徵是分 別含有SEQ ID NO. 1所述的重鏈可變區VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3 所述的輕鏈可變區VL基因核苷酸序列的cDNA的Si即le-T載體。
8、 含有權利要求4所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，其特徵是含 有SEQ ID NO. 1所述的重鏈可變區VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述 的輕鏈可變區VL基因核苷酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。
9、 權利要求2-3中任一項所述的抗人CD52單克隆抗體或權利要求4-5 中任一項所述的抗人CD52的工程抗體或7、 6中任一項所述的載體在製備 白血病診斷試劑、免疫抑制類藥物或治療白血病的藥物中的應用。
10、 一種免疫檢測試劑盒，其特徵是含有至少一種權利要求2 — 3 所述的單克隆抗體或權利要求4一6工程抗體或權利要求7 — 8的載體。
11、權利要求10所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性 疾病；或評價惡性腫瘤或自身免疫性疾病的發展和預後；或指導惡性腫瘤 或自身免疫性疾病的治療中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種抗人CD52單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途，能夠在體內外特異性結合人類CD52抗原，通過多種機制單獨或協調作用，有目的清除正常免疫細胞活殺傷白血病細胞。本發明涉及抗人CD52單克隆抗體HI186重鏈和輕鏈可變區基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在製備用於白血病或自身免疫病的診斷和治療藥物中的應用。重鏈和輕鏈可變區基因來自抗人CD52單克隆抗體。本發明採用基因工程技術成功製備人源化單鏈抗人CD52基因工程抗體，為白血病和免疫系統疾病的診斷和治療提供了一種新的有效藥物。
文檔編號C12N5/12GK101619305SQ20071005993
公開日2010年1月6日 申請日期2007年10月19日 優先權日2007年10月19日
發明者何大水, 鳴 佘, 立 周, 浩 屈, 廖曉龍, 毅 張, 張麗豔, 張宇光, 張金香, 朱衛彬, 王冬梅, 袁向飛, 郭桂慶, 黃麗華 申請人:協和幹細胞基因工程有限公司