一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法

2023-11-30 18:00:56 1

專利名稱：一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法
一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法
背景技術：
i^Wli^M (Paratyphus swine) X^W^^^M'^ (Swine salmonellosis), ± 要是由豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)引起的一種仔豬高熱傳染病，目前主 要通過接種疫苗進行預防。仔豬副傷寒主要是由豬霍亂沙門氏菌引起幼豬和架子豬的敗血症和腸炎，對成年 豬多呈隱性帶菌或為豬瘟的繼發感染菌，間或引起人類的食物中毒以及侵害其他動物。我國應用的仔豬副傷寒活疫苗CVCC500株(原C500株)(房曉文，李陽隴，黃昌 炳，鄭明，馮文達，孫偉等.仔豬副傷寒弱毒菌苗的研究，畜牧獸醫學報，1979)，對仔豬有堅 強免疫力，毒力穩定、安全，在豬沙門氏菌病防控中發揮了重要作用。但仍存在以下突出問 題1.疫苗採用普通肉湯作為培養基，該培養基主要成分牛肉浸液的質量受牛肉的種類、 年齡、新鮮及消化程度影響大，造成批次間不穩定。2.疫苗採用1.5%明膠、5%蔗糖為保護 劑，組方簡單，凍幹存活率低，保護功能較差(尤其在較高溫度下)。目前國內14個生產仔 豬副傷寒活疫苗的獸用生物製品企業，凍幹存活率一般為50% 60%，需要-15°C以下保 存。存活率低使疫苗中含有大量死亡菌體，死亡菌體崩解產生的內毒素，是產生過敏反應的 因素之一，另外低溫保存給邊遠地區儲運和使用帶來困難。據報導，每年0. 07% 0. 的 豬接種後出現嘔吐、痙攣、全身發疳、死亡等症狀。本發明的目的是研究一種合成培養基、耐熱保護劑及其相配套的凍幹曲線，製備 一種凍幹菌存率高，能在2 8°C長期保存的仔豬副傷寒活疫苗。

發明內容
本發明的技術方案是將種子液按培養基總量的 2%接種於液體培養基中， 37°C發酵或通氣培養18 21h，培養過程中根據需要加入適量消泡劑，並根據pH升高情況 加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH值。培養結束後立即加入經過滅菌並預熱至37°C的凍 幹保護劑，充分混勻後按規定頭份分裝。分裝過程中應注意保溫振搖均勻，每頭份活菌數不 少於 3X109CFU。1生產菌株(1)菌株來源豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株(即原C500株)，由中國獸醫藥品監察所鑑定、保 管和供應。其原始菌種系豬霍亂沙門氏菌CVCC79101株(來自蘇聯獸藥監察所，編號為 133/8。特性該菌種肉肝胃培養物50X IO4CFU活菌致死小鼠，5000X IO4CFU活菌致死海豬， 1.5X IO8CFU活菌靜脈注射致死仔豬。血清型6，7:C:1，5。)經0. 05% 1 %醋酸鉈的普 通肉湯傳500代，每間隔50代逐步提高醋酸鉈濃度，人工致弱而來。(2)菌株特性1)毒力用體重18 22g(30 35日齡)小白鼠皮下注射1 X IO8CFU活菌 (0. 2ml)，90%以上存活；豚鼠(350 400g)皮下注射15 X IO8CFU活菌，90%以上存活；家 兔(體重1.5 2. Okg)皮下注射100 X IO8CFU活菌(1ml)，100%存活；仔豬(體重15kg以
3上)靜脈注射30X IO8CFU活菌(Iml)，100%存活。2)菌株穩定性在普通瓊脂上連傳20代，或在仔豬連通過3代，毒力不返強。3)免疫原性以25X IO8CFU活菌免疫家兔(體重1. 5kg)，一個月後攻擊2 4MLD(最小致死劑量)強毒菌，保護80%以上；以25 X IO8CFU活菌免疫仔豬(體重12kg)， 靜脈注射致死劑量強毒，保護60%以上(中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生 物製品規程二〇〇〇版.化學工藝出版社，2000，以下稱《規程》)。2.疫苗製造及半成品檢驗(1)生產用種子製備將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)凍幹菌種用普通肉湯稀釋後，接種普通瓊脂平 板，37°C培養18 20h，選取中等大小的典型菌落(菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略 溼潤的光滑型)5 10個，混合接種於普通瓊脂斜面3 5支，37°C培養24h，經純粹檢查合 格後作為一級種子。在2 8°C保存，應不超過2個月。取一級種子按2%接種普通肉湯， 37°C培養24h，純粹檢查合格後，作為種子液。(2)培養基本發明所採用的培養基是普通肉湯培養基(中國獸藥典委員會.中華人民共和國 獸藥典二〇〇五版三部.北京中國農業出版社，2006年，以下稱《中國獸藥典》)或/和合
成培養基。本發明所述的合成培養基配方及配製方法如下胰酪蛋白腖 2%，酵母浸出粉3% 4 %，氯化鈉0.05%，磷酸二氫鉀 0. 0077%，磷酸氫二鈉0. 0867%，注射用水；按配方依次稱取培養基成分加入到注射用水中，充分溶解後用2mol/L的氫氧化 鈉溶液調節PH值為7. 2 7. 4，116°C滅菌30min，臨用時，無菌操作加入終濃度的50% 葡萄糖溶液，混勻。(3)保護劑的配製1)保護劑的配方水溶性明膠10g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) Ig,山梨醇50g，蔗糖50g，199培養基5g， L-穀氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀1. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。2)配製方法溶液1 在潔淨燒杯中，加入注射用水(100°C )適量，按配方依次稱取水溶性明 膠、PVP、山梨醇，加入燒杯中，邊加入邊用玻璃棒攪拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至 500ml，經 116°C 滅菌 30min。溶液2 按配方依次稱取蔗糖、199培養基、L-穀氨酸鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀 於燒杯中，加入注射用水使其充分溶解後，定容至500ml，0. 22 μ m濾膜的除菌濾器過濾除 菌。3)配苗前，在無菌條件下，將溶液1和溶液2等體積混勻，即成。(3)制苗用菌液製備將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)種子液按培養基總量的 2%接種於液體 培養基(普通肉湯培養基或本發明提供的液體合成培養基)中，37°C發酵或通氣培養18 21h，培養過程中根據需要加入適量消泡劑，並根據pH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖
4以控制PH值。培養結束後，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經過滅菌處理並 預熱至37°C的耐熱保護劑懸浮，充分混勻後按規定頭份分裝。分裝過程中應注意保溫振搖 均勻。凍幹分裝後迅速進行冷凍真空乾燥，按《中國獸藥典》規定的方法、使用本發明提 供的凍幹曲線2(見圖2)進行。(4)半成品檢驗純粹檢驗取菌液用普通瓊脂平板，按《中國獸藥典》規定的方法進行，應純粹。活菌計數取樣用普通瓊脂平板培養計活菌數，按《中國獸藥典》規定的方法進行， 作為計算凍幹活菌率的基數及配苗時參考。凍幹後檢驗純粹檢驗按《中國獸藥典》規定的方法進行，應純粹。頭份、活菌率的計算用普通瓊脂平板培養計活菌數，按附錄《中國獸藥典》規定的 方法進行。以3瓶中最低菌數計算核定該批疫苗每瓶的使用頭份，同時按附註方法計算凍 幹後的活菌率，以確定使用方法。活菌率在50%以上的疫苗，可用於注射或口服；低於50% 的疫苗，僅限於口服。3成品檢驗性狀白色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液後迅速溶解。純粹檢驗按《中國獸藥典》規定的方法進行檢驗，應純粹。活菌計數按瓶籤註明頭份，用普通瓊脂平板做活菌計數(按《中國獸藥典》規定的 方法進行)，每頭份含活菌數應不少於3X 109CFU。安全檢驗按瓶籤註明頭份，將疫苗用普通肉湯或蛋白腖水稀釋，皮下注射體重 1.5 2. Okg兔2隻，各1.0ml(含2頭份)，觀察21日，應存活。剩餘水分測定按《中國獸藥典》規定的方法進行測定，應不超過4. 0%。真空度測定按《中國獸藥典》規定的方法進行測定。貯藏與有效期2 8°C保存，有效期至少為18個月。本發明的優點本發明涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法。在本發明提供的生產方法中採用 了合成培養基和耐熱凍幹保護劑及其相適應的凍幹曲線一整套技術，提高豬霍亂沙門氏菌 CVCC79500株培養菌數，保證批次間穩定性，減少凍幹過程的損失率，降低菌體死亡和代謝 副產物產生的過敏反應，將成品疫苗的保存溫度提高到2 8°C，有效期達到18 24個月， 並可實現較高溫度短期保存(37°C保存7日，活菌減少率低於20% )。


圖1 凍幹曲線1示意圖。-35°C進箱；_40°C維持約4h ；產品由_40°C升至-10°C， 維持IOh ；板層溫度提高到28°C，維持8h。全程約28h。圖2 凍幹曲線示意圖。2 :0 5°C進箱；以每minl°C降至_40°C或以下，維持約4h ； 板層控制-10°c，維持14 16h ；每間隔2h升溫10°C，在28°C維持6h出箱。全程約28h。本發明所使用的凍融菌存率、凍幹菌存率及活菌減少率計算方法凍融菌存率(％) = 化凍後每頭份(或每ml)活菌數/預凍前每頭份(或每ml)活菌數*100%
凍幹菌存率(％) =凍幹後每頭份(或每ml)活菌數/凍幹前每頭份(或每ml)活菌數*100%
活菌減少率(%) =耐老化試驗前每頭份(或每ml)活菌數一耐老化試驗後每頭份(或每ml)活菌數/耐老化試驗前每頭份(或每ml)活菌數*l00%實施例1將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)種子液按培養基總量的 2%接種於本發 明所提供的合成培養基(液體培養基)中，37°C發酵或通氣培養18 21h，培養過程中根 據需要加入適量消泡劑，並根據PH升高情況加入適量滅菌的40%葡萄糖以控制pH值。培 養結束後，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經過滅菌並預熱至37°C的本發明 提供的耐熱凍幹保護劑，充分混勻後按規定頭份分裝。分裝過程中應注意保溫振搖均勻，並 迅速進行冷凍真空乾燥，按《中國獸藥典》規定的方法、使用本發明提供的凍幹曲線2(見圖 2)進行，每頭份含活菌數應不少於3X109CFU。實施例2將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)種子液按培養基總量的 2%接種於普通 肉湯培養基(《中國獸藥典》記載的配方)中，37°C發酵或通氣培養18 21h，培養過程中 根據需要加入適量消泡劑，並根據PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH值。培 養結束後，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經過滅菌並預熱至37°C的耐熱保 護劑，充分混勻後按規定頭份分裝。分裝過程中應注意保溫振搖均勻，並迅速進行冷凍真空 乾燥，按《中國獸藥典》規定的方法、使用本發明提供的凍幹曲線2(見圖2)進行，每頭份含 活菌數應不少於3X 109CFU。實施例3成品檢驗性狀白色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液後迅速溶解。純粹檢驗按《中國獸藥典》規定的方法進行檢驗，應純粹。活菌計數按瓶籤註明頭份，用普通瓊脂平板做活菌計數(按《中國獸藥典》規定的 方法進行)，每頭份含活菌數應不少於3X 109CFU。安全檢驗按瓶籤註明頭份，將疫苗用普通肉湯或蛋白腖水稀釋，皮下注射體重 1.5 2. Okg兔2隻，各1.0ml(含2頭份)，觀察21日，應存活。剩餘水分測定按《中國獸藥典》規定的方法進行測定，應不超過4. 0%。真空度測定按《中國獸藥典》規定的方法進行測定。貯藏與有效期2 8°C保存，有效期至少為18個月。實施例4耐熱保護劑配方及凍幹曲線的篩選通過10種保護劑基質的「凍融」試驗和「凍幹」試驗，初步明確了各種保護劑基質 的適用濃度，穀氨酸鈉(0.5%、2%)、蔗糖(5%、7.5%)凍融試驗菌存率最高；1.5%明膠5%蔗糖保護劑中加入0.5% 199培養基或0.5%穀氨酸鈉可明顯提高凍幹菌存率(均達 71%) ；1.5%明膠+5%蔗糖+5%山梨醇可使凍幹菌存率達75%。1. 5%明膠、5%蔗糖中添 加0. 5% 2%穀氨酸鈉均有明顯提高菌體耐老化作用，使疫苗37°C保存7日的活菌減少率 分別為46 %、47 %和43 %、48 %，而明膠蔗糖對照為65 %。據此設計了 4種耐熱保護劑配方 1、2、3和4，與豬霍亂沙門氏菌菌液等量混合，分別用凍幹曲線1、2進行凍幹，結果表明耐熱 保護劑配方1及凍幹曲線2凍幹效果最好。為了提高目前我國仔豬副傷寒活疫苗的菌存率，並方便疫苗的保存及運輸，我們 進行了該疫苗耐熱保護劑研究，現將結果報告如下。1 材料1. 1豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)(2006. 8. 29凍幹，0. 3ml/支)，由中國獸醫藥 品監察所提供。1. 2仔豬副傷寒合成培養基(批號0102)由本發明人提供及配製。1. 3保護劑基質水溶性明膠(批號115K0144)購自Sigma公司；PVP購自BASF公司；199培養基 (批號282288)購自GIBCO公司；甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、穀氨酸鈉、磷酸二氫鉀、磷 酸氫二鉀均為分析純，進口分裝，購自北京拜爾迪生物公司。1. 4 凍幹機，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1豬霍亂沙門氏菌制苗用菌液製備種子液按《規程》進行製備。將種子液按2%接種250ml合成培養基三角瓶6個， 置37°C、200r/min振蕩培養12h，菌液經3500r/min離心20min，收集所有的沉澱菌體，用 200ml滅菌pH 7. 2磷酸鉀緩衝液(附錄1)懸浮，充分混勻後，作為制苗用菌液。2. 2凍融試驗2. 2. 1保護劑配製2. 2. 1. 1大分子保護劑配製稱取明膠6g及PVP12g，分別用注射用水定容至100ml，配製成6%明膠及12% PVP 貯液，2MNa0H調整pH值至7. 2，116°C滅菌30min。然後各取5ml用等量滅菌pH7. 2磷酸鉀 緩衝液稀釋成3%明膠及6% PVP。2. 2. 1. 2小分子保護劑配製稱取甘露醇10g、山梨醇10g、蔗糖15g、海藻糖15g、穀氨酸鈉15g和199培養基 2g，分別用pH 7. 2磷酸鉀緩衝液(磷酸氫二鉀1. 25g、磷酸二氫鉀0. 52g溶解於IOOOml注 射用水中，116°C滅菌30min，pH值為7. 2)定容至100ml，0. 22 μ m濾膜過濾除菌。然後按上 法用滅菌PH 7. 2磷酸鉀緩衝液稀釋成使用濃度。2. 2. 2 凍融分別取2. 1項製備的菌液Iml與22種單基質保護劑等量混合後(保護劑終濃度 如表1所示)，先置2 8°C 20min，後置_40°C冷凍保存4h。同時設不含保護劑基質的磷 酸鉀緩衝液作對照。將各凍存菌液融化後，連同凍融前及對照樣品按《中國獸藥典》進行活 菌計數，並計算凍幹菌存率。2. 3凍幹試驗
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2. 3. 1保護劑配製按2. 2. 1項進行。2. 3. 2凍幹分別取2. 1項製備的菌液IOml與14種保護劑等量混合後(保護劑終 濃度如表2所示)，定量分裝(2ml/瓶)，按《中國獸藥典》附錄進行凍幹。同時設1. 5%明 膠5%蔗糖作對照。分別取凍幹前、後以及凍幹後置37°C保存7日樣品進行活菌計數。2. 4耐熱保護劑配方及凍幹曲線優化2. 4. 1保護劑配製依據凍融和凍幹試驗結果，將能夠提高凍幹菌存率及疫苗耐老 化性能的保護劑基質，設計成4組耐熱保護劑(分別標記為配方1、2、3和4)，其配方及配製 方法見附錄3。2. 4. 2凍幹分別取2. 1項製備的菌液50ml與4組保護劑等量混合後，定量分裝 (2ml/瓶)，按凍幹曲線1及凍幹曲線2進行凍幹。分別取凍幹前、後以及凍幹後置37°C保 存7日樣品進行活菌計數。通過比較結果選擇最佳耐熱保護劑和凍幹曲線。2.結果2. 1凍融試驗凍融試驗結果見表1。表1凍融試驗中活菌計數及菌存率結果 注凍融菌存率計算方法按本發明提供的計算方法計算(下同)。表1結果顯示，在10種單基質中，穀氨酸鈉(0. 5%、2% )、蔗糖(5%、7. 5% )菌 存率最高，可達60%以上；海藻糖(5% )、甘露醇(5% )、明膠(1.5%、3% )、199培養基 (0. 5% )次之，菌存率達50% 60%。
2. 2凍幹試驗樣品凍幹前後及耐老化試驗檢測結果見表2。表2樣品凍幹前後及耐老化試驗檢測結果 注凍幹後樣品及耐老化試驗樣品用生理鹽水恢復至原量後進行檢測，其凍幹菌 存率及活菌減少率按本發明提供的計算方法計算(下同)。表2結果顯示，1. 5%明膠5%蔗糖保護劑中加入0. 5% 199培養基或0. 5%穀氨酸 鈉可明顯提高凍幹菌存率(均達71%) ；1.5%明膠+5%蔗糖+5%山梨醇可使凍幹菌存率 達75 %。1. 5 %明膠、5 %蔗糖中添加0. 5 %、2 %穀氨酸鈉均有明顯提高菌體耐老化作用，使 疫苗37°C保存7日的活菌減少率分別為43%、48%。另外PVP (0. 1%)、199培養基(0.5%) 也有一定提高菌存率及耐老化作用。2. 3耐熱保護劑及凍幹曲線優化不同保護劑配方及凍幹曲線的凍乾結果見表3。表3不同保護劑配方及凍幹曲線的凍乾結果(活菌數108CFU/ml) 表3結果顯示，採用耐熱保護劑配方1與凍幹曲線2凍幹豬霍亂沙門氏菌 (CVCC79500株)效果最好，凍幹後不結晶，凍幹菌存率達86. 9% ；37°C保存7日不萎縮，活 菌減少率為15.0%。明顯優於明膠蔗糖對照(其凍幹菌存率為63.0%與55. ；37°C保 存7日後活菌減少率為71. 7%與68. 8% )。3小結與討論3. 1採用耐熱保護劑配方1與凍幹曲線2凍幹豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)效
果良好。3. 2某些單保護劑基質(如0. 5%和2%穀氨酸鈉、5%和7. 5%蔗糖、5%海藻糖、 5%甘露醇、1. 5%和3%明膠、0. 5% 199培養基)可以提高豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500 株)在「凍結-解凍」的活性恢復率，可能是由於它們含有的糖醇羥基、或某些胺基酸成 分和菌膜表面的氨基基團發生類似水合反應，形成範德華表面張力，減少了冰晶對菌體 損傷° Scott (Scott, W. J. , In Recent Resear in Freezing and Drying. 1960,188 202. ) > Cho and Obayashi(Cho, CandObayashi, Y. , Bulletion of the World Health Orgination. 1956，14 :657.)曾報導使用穀氨酸鈉，在冷凍乾燥過程中對病毒囊膜起到同 樣作用。3. 3在明膠大分子中添加少量PVP，可以更好的發揮保護劑與填充劑作用，因為 PVP可以抑制凍幹過程中系統PH值降低(華澤釗.冷凍乾燥新技術.北京科學出版社， 2006. 1.)。3. 4該耐熱保護劑中大分子物質主要形成耐熱框架，形成間接的隔熱層；小分子 物質主要與菌體形成懸液，起直接作用。實施例5凍幹保護劑使用方法
用耐熱保護劑將離心後菌體重懸浮成不同菌液濃度進行配苗，結果，菌液濃度 100. 3X IO8 312X108CFU/ml，凍幹菌存率達75. 7% 89. 8%，37°C保存7日後活菌減少 率為13% 18%，優於其它濃度範圍。耐熱保護劑與菌液感作時間試驗表明，2 8°C作 用24h，凍幹菌存率達85. 3% 93. 1%，高於其它作用時間。7ml西林瓶疫苗分裝量3ml或 4ml，其凍幹菌存率與2ml基本一致，而且耐老化試驗中活菌減少率比2ml下降3 8個百 分點。為了明確耐熱保護劑在使用中相關參數，進行了配苗比例、保護劑感作時間以及 苗液分裝量比較試驗。現將結果報告如下。1 材料1. 1豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)，由中國獸醫藥品監察所鑑定、保管和供應。1.2普通瓊脂(批號20090102)、普通肉湯培養基(批號20090102)、20%鋁膠生 理鹽水(批號20090102)，由中國獸醫藥品監察所培養基組供應。1. 3仔豬副傷寒合成培養基、仔豬副傷寒耐熱保護劑，由本發明人配製。1. 4 凍幹機，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1豬霍亂沙門氏菌制苗用菌液製備種子液按《中華人民共和國獸用生物製品規程(2000版)》(以下簡稱《規程》[1]) 進行製備。將種子液按2%接種250ml合成培養基三角瓶6個，置37°C、200r/min振蕩培養 12h，菌液經3500r/min離心20min，收集所有的沉澱菌體，用200ml滅菌磷酸鉀緩衝液(稱 取磷酸氫二鉀1. 25g、磷酸二氫鉀0. 52g溶解於IOOOml注射用水中，116°C滅菌30min，pH值 為7. 2)懸浮，充分混勻後，作為制苗用菌液。2. 2耐熱保護劑的配苗試驗用適量預熱至37°C的耐熱保護劑懸浮制苗用菌液成3組不同濃度第1組菌液濃 度約 700 X IO8 900X 108CFU/ml ；第 2 組菌液濃度約 300 X IO8 400 X 108CFU/ml ；第 3 組 菌液濃度約100 X IO8 200 X 108CFU/ml。然後定量分裝(2ml/瓶)，每組70瓶，按凍幹曲 線2進行凍幹。分別取凍幹前、後，以及凍幹後置37°C保存7日樣品進行活菌計數。試驗共 進行3次。2. 3耐熱保護劑與菌體感作時間的試驗用耐熱保護劑將沉澱將制苗用菌液懸浮成200 X IO8 300X 108CFU/ml，置2 8°C感作0、24、48h，然後定量分裝(2ml/瓶)，每組70瓶，按凍幹曲線2進行凍幹。分別取 凍幹前、後以及凍幹後置37°C保存7日樣品進行活菌計數。試驗共進行3次。2. 4耐熱保護劑活疫苗分裝量的比較試驗將2. 3項3次試驗半成品，分別以2ml、3ml、4ml量分裝，各分裝70瓶，按凍幹曲線 2進行凍幹。分別取凍幹前、後以及凍幹後置37°C保存7日樣品進行活菌計數。3 結果3. 1耐熱保護劑配苗比例試驗不同菌液濃度凍幹比較結果見表4表4不同菌液濃度凍幹比較結果 表4結果顯示，菌液濃度在100 X IO8 300 X 108CFU/ml，凍幹菌存率高，而37°C保 存7日耐老化結果基本一致。因《規程》要求每頭份不少於3X109CFU/ml，考慮到疫苗的頭 份數，因而適宜菌液濃度為200 X IO8 400 X 108CFU/ml。3. 2耐熱保護劑與菌體感作時間試驗結果見表5。表5保護劑與菌液感作時間比較試驗 表5結果顯示，保護劑與菌液在2 8°C感作24h，凍幹菌存率高於其它時間；而 37°C保存7日耐老化試驗結果基本一致。3.3耐熱保護劑活疫苗分裝量比較試驗結果見表6。表6疫苗分裝量比較試驗 表6結果顯示，7ml西林瓶疫苗裝量3ml或4ml，其凍幹菌存率與2ml基本一致，且 置37°C保存7日的活菌減少率相對降低3 8個百分點。4結論與討論4. 1配苗比例是影響耐熱保護劑作用的重要因素，菌液濃度高，保護劑分子有效保 護菌體的資源相對不足。通過比較試驗，確定適宜配苗濃度為200X IO8 400X 108CFU/ml。4. 2適當延長耐熱保護劑與菌液混合作用時間，有利於保護劑分子充分滲入菌體 內，提高菌體的抗凍能力。但若細菌暴露在空氣中的時間過長，某些菌體體內產生的過氧化 氫蓄積對菌體有毒害作用，造成死亡。耐熱保護劑與菌體感作時間結果表明，當菌體與保護 劑2 8°C作用24h，其凍幹菌存率最高，為85. 3% 93. 1 %，而耐老化試驗結果基本一致 (活菌減少率達10% 20% )。4. 3充分利用西林瓶的空間，提高疫苗分裝量，是降低成本，提高疫苗頭份數的重 要手段，研究結果發現，在7ml西林瓶中分裝量達3 4ml，其凍幹菌存率與2ml分裝量基本 一致，而其耐老化結果中活菌減少率相對降低3 8個百分點，主要由於瓶中菌液的高度增 加，凍幹過程中延長了冷凍時間、升華時間以及解析乾燥時間。實施例6耐熱保護劑的應用試驗採用篩選出耐熱保護劑1及凍幹曲線2試製仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗 (CVCC79500株)3批。凍幹後疫苗不結晶，37°C保存7日不萎縮，其純粹、活菌計數、安全性、 剩餘水分和真空度均符合規定。凍幹前活菌計數分別為5. 2X IO9CFU/頭份、6. 2X IO9CFU/ 頭份和5. 6X IO9CFU/頭份；凍幹後活菌計數分別為4. 52X IO9CFU/頭份、5. 22X IO9CFU/頭 份和4. 76 X IO9CFU/頭份，凍幹菌存率分別為87%、84%和85% ；置37°C保存7日，活菌計 數分別為3. 84 X IO9CFU/頭份、4. 36 X IO9CFU/頭份和4. OOX IO9CFU/頭份，活菌減少率分別 為15%、16.3%和15.9%，用37°C保存7日的耐熱保護劑活疫苗免疫兔，30日後攻毒均可 保護4/5 5/5，對照5/5死亡。運用優化的耐熱保護劑和凍幹曲線試生產3批仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗 (CVCC79500株)，參照《規程》進行檢驗，現將試驗結果報告如下。1 材料1. 1仔豬副傷寒合成培養基及耐熱保護劑，本發明人配製及提供。
1.2 菌種生產用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)；檢驗用菌種為豬霍亂沙門氏菌 (CVCC79102株)，均由中國獸醫藥品監察所鑑定、保管和供應。1.3培養基普通瓊脂(批號0102)、普通肉湯培養基(批號0102)、20%鋁膠生理鹽水(批 號0102)、純粹檢驗用硫乙醇酸鹽培養基(T.G)、酪腖瓊脂(G.A)和葡萄糖蛋白腖湯(G.P) (批號0102)，由中國獸醫藥品監察所培養基組供應。1.4 動物小鼠ICR系，30 35日齡、體重18 22g，清潔級；大耳白兔體重1. 5 2. 0kg， 普通級；由中國獸醫藥品監察所實驗動物組採購並提供。1. 5 凍幹機，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。1. 6 水分測定儀，METTLER TOLEDO。1. 7真空度測定儀，76-1型高頻電火花真空度測定儀。2 方法2.1菌液製備及配苗種子液按《規程》[1]進行製備。將種子液按2%接種250ml合成培養基三角瓶6 個，置37°C、200轉/分振蕩培養12h，菌液經3500轉/分離心20min，棄去培養液，菌體沉 澱換以250ml耐熱保護劑懸浮混勻，取樣進行半成品檢驗(活菌計數及純粹檢驗)，懸浮菌 液置2 8°C保存24h。2. 2 凍幹待半成品檢驗合格，定量分裝(3ml/瓶)。按凍幹曲線2進行凍幹。試生產3批仔 豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗(CVCC79500株)。2. 3 檢驗2. 3. 1按《規程》進行性狀、純粹、活菌計數、安全性、剩餘水分和真空度等檢驗。2. 3. 2耐老化試驗將實驗室製備的3批疫苗，每批隨機抽取疫苗8瓶，其中3瓶分別進行活菌計數， 以其平均數作為耐老化試驗前的活菌數標準。另5瓶置37°C保存7日，任取其中3瓶，分別 按上述方法進行活菌計數。然後計算疫苗的活菌減少率。2. 3. 3效力試驗從37°C保存7日的3批疫苗中，每批隨機抽取疫苗5瓶，按瓶籤註明頭份，注射組 用20%鋁膠生理鹽水混合稀釋成1頭份/ml ；灌服組用生理鹽水混合稀釋成1頭份/2ml ； 大腿內側肌肉注射和經口灌服體重1. 5 2. OKg家兔各5隻，1頭份/只，30日後，連同條 件相同的不接種對照兔5隻，各皮下注射經肉肝胃(膜)消化湯培養2代的豬霍亂沙門氏 菌(CVCC79102株)菌液1. Oml (含3MLD的活菌)，觀察30日，記錄存活情況。3 結果3. 1菌液製備結果見表7。表7菌液製備及半成品檢驗結果
3.2疫苗檢驗結果見表8、表9、表10。
表8仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗檢驗結果(一) 表9仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗檢驗結果(二) 表8、9結果顯示，3批仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗純粹，性狀、剩餘水分、真空 度、安全檢驗符合《規程》要求。表10疫苗凍幹前後活菌數及耐老化試驗結果 表10結果顯示，3批耐熱活疫苗凍幹菌存率達80%以上(分別為87%、84%及 85% ) ；37 保存7日，活菌減少率低於20% (分別為15%、16. 3%及15. 9% )。
3. 3效力試驗結果見表11。表11 3批耐熱保護劑疫苗家兔效力檢驗結果 表11中顯示，3批耐熱保護劑活疫苗37°C保存7日後，以1頭份口服及肌肉注射 免疫家兔攻毒均可保護4/5 5/5，效力確實。4 結論耐熱凍幹保護劑1和凍幹曲線2，適用於仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗 (CVCC79500株)的生產。實施例7耐熱保護劑保存期試驗將3批耐熱保護劑置2 8°C保存0日、10日、20日、30日和40日，分別製備凍幹 疫苗，測定其凍幹菌存率及凍幹後置37°C保存7日耐老化試驗的活菌減少率。結果保存40 日的耐熱保護劑製備的疫苗凍幹菌存率為83. 7% 87. 5%，置37°C保存7日耐老化試驗活 菌減少率為12.6% 17. 1%，與新鮮配製的保護劑(製備的疫苗凍幹菌存率達82. 9% 87. 0%，37°C保存7日耐老化試驗活菌減少率為15. 0% 16. 3% )結果基本一致。為確保 效果，耐熱保護劑2 8°C有效期定為30日。1 材料1. 1耐熱保護劑3批，批號分別為0101、0115、0210，由本發明人提供及配製。1. 2生產用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)由中國獸醫藥品監察所鑑定、
保管和供應。1. 3 凍幹機，Edwards 公司 Lyofle X 2. 0。1.4普通瓊脂(批號0102)、普通肉湯培養基(批號0102)由本發明人製備供應。2 方法2. 1耐熱保護劑保存溫度及時間將本發明人按本法製備的3批配製好耐熱保護劑，批號分別為01、02、03，每批 1000ml，置2 8°C保存40日，並在0日、10日、20日、30日及40日等時間階段分別取樣 50ml。2. 2菌液製備、配苗及凍幹
2. 2. 1種子液按《規程》方法進行製備。然後按2%接種500ml合成培養基三角瓶 6個(裝量250ml/瓶)，37°C、200r/min振蕩培養12h，菌液經3500r/min離心20min後，菌 體沉澱用200ml滅菌pH 7. 2磷酸鉀緩衝液懸浮混勻，作為菌液。2. 2. 2將50ml耐熱保護劑樣品，各加入50ml抗原液，充分混勻後，定量分裝(3ml/ 瓶)，按凍幹曲線2進行凍幹。2. 3活菌計數分別取凍幹前、後以及凍幹後置37°C保存7日樣品進行活菌計數。3 結果3批耐熱保護劑的保存期試驗結果見表12。表12耐熱保護劑的保存期試驗結果 結果顯示，3批耐熱保護劑置2 8°C保存40日凍幹菌存率為83. 7% 87. 5%， 置37°C保存7日活菌減少率為12. 6% 17. 1 %，與保存前的結果基本一致(凍幹菌存率為 82. 9% 87% ；活菌減少率為15% 16. 3% )。4 結論因耐熱保護劑置2 8°C保存40日與保存前的凍幹菌存率、活菌減少率結果基本 一致。為確保效果，將耐熱保護劑2 8 有效期定為30日。實施例8與同類產品的比較研究報告仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗(01、02和03)與常規仔豬副傷寒活疫苗(0205、 0306和0912)，進行凍幹菌存率、37°C保存7日耐老化試驗、安全和效力試驗比較。結果 3批耐熱保護劑活疫苗凍幹菌存率分別為87 %、84 %和85 %，而常規疫苗為52 %、57 %和 60% ；37°C保存7日耐老化試驗，耐熱保護劑活疫苗活菌減少率為15%、16%和18%，而常 規疫苗為75%、67%和73%;安全試驗中，常規疫苗1 2日內分別有1/5、2/5和1/5頭出現體溫升高、減食等過敏症狀，然後自行恢復，耐熱保護劑活疫苗均無不良反應，而口服免 疫兩者均無不良反應；效力試驗中，兩者攻毒保護結果基本一致。1 材料1.1 疫苗仔豬副傷寒耐熱保護劑活疫苗(CVCC79500株)，批號分別為01、02和03，均為15
頭份/瓶，由北京海澱中海動物保健科技公司實驗室製備。仔豬副傷寒活疫苗(以下簡稱「常規疫苗」)，批號分別為0205、0306和0912，均為 15頭份/瓶，由吉林正業塵物製品有限公司提供。1. 2檢驗用豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)，由中國獸醫藥品監察所鑑定、保管和提供。1. 3仔豬30日齡、體重12kg以上、斷乳，普通級，由中國獸醫藥品監察所實驗動物 組採購和提供。2 方法2. 1凍幹菌存率及耐老化試驗分別按各自《規程》製備仔豬副傷寒常規疫苗3批(01、02和03)和仔豬副傷寒耐 熱保護劑活疫苗3批(0205、0306和0912)。各取凍幹前和後、37°C保存7日樣品按現行《中 國獸藥典》附錄進行活菌計數。2. 2安全檢驗取耐熱保護劑活疫苗和常規疫苗各3批，每批10瓶，按瓶籤註明頭份，其中5瓶用 生理鹽水混合稀釋至2頭份/5. 0ml，灌服仔豬5頭，每頭5. 0ml，共30頭；另5瓶用20%氫 氧化鋁膠生理鹽水混合稀釋至2頭份/ml，耳後淺層肌肉注射仔豬5頭，每頭1. 0ml，共30 頭。同時設5頭不免疫仔豬對照，隔離飼養，觀察21日，記錄仔豬的採食、飲水和體溫情況。2. 3效力檢驗取耐熱保護劑活疫苗和常規疫苗各3批，每批10瓶，按瓶籤註明頭份，其中5瓶用 生理鹽水混合稀釋至1頭份/5. 0ml，灌服仔豬5頭，每頭5. 0ml，共30頭；另5瓶用20%氫 氧化鋁膠生理鹽水混合稀釋至1頭份/ml，耳後淺層肌肉注射仔豬5頭，每頭1. 0ml，共30 頭；同時設立5頭不免疫仔豬對照。在免疫後30日，各靜脈注射經肉肝胃(膜)消化湯培 養2代的豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)菌液2. Oml (含IMLD活菌)。隔離飼養，觀察21 日，記錄仔豬的存活情況。3 結果3. 1凍幹菌存率及耐老化試驗結果見表13表13 3批實驗室製品與常規疫苗的凍幹菌存率及耐老化試驗比較結果 *表中凍幹後及耐老化試驗樣品用生理鹽水恢復至原量後進行檢測，凍幹菌存率 及活菌減少率計算按本發明提供的方法進行。表13顯示，耐熱保護劑活疫苗的凍幹菌存率為84% 87% ；常規疫苗為52% 60% ；37 保存7日，耐熱保護劑活疫苗的活菌減少率為15% 18% ；常規疫苗為67% 75%。3. 2安全檢驗 表14顯示，耐熱保護劑活疫苗以2頭份肌肉接種仔豬，其採食、飲水、體溫均正常。
19 表15顯示，3批耐熱保護劑活疫苗與常規疫苗以1頭份口服及肌肉注射免疫仔豬， 攻毒均可保護4/5 5/5，無顯著差異。4 結論通過比較試驗，發現耐熱保護劑活疫苗與已有的仔豬副傷寒活疫苗相比，凍幹菌 存率高(達84% 87% ) ；37°C保存7日的活菌減少率低(達15% 18% )；其過敏反應 低；兩者效力檢驗結果一致。
而常規疫苗肌肉注射後1 2日部分豬出現體溫升高、減食等過敏症狀，但可自行恢復；口 服免疫豬，兩者結果一致，均無不良反應。3. 3效力檢驗表15 3批耐熱保護劑疫苗與常規疫苗的效力檢驗結果
護況 保情
觀間} 毒時日 攻察<
攻毒途徑弓劑量
觀間} 疫時H 免察C
疫量 免劑
疫徑 免途
豬數量 (頭)
批號
權利要求
一種仔豬副傷寒活疫苗，其特徵是該疫苗含有豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株及水溶性明膠、PVP、山梨醇、蔗糖、199培養基、L 穀氨酸鈉、磷酸氫二鉀及磷酸二氫鉀組成的耐熱凍幹保護劑。
2.一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法，其特徵是將種子液按培養基總量的 2% 接種於普通肉湯或本發明提供的液體合成培養基中，37°C發酵或通氣培養18 21h，培養 過程中根據需要加入適量消泡劑，並根據PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖以控制pH 值；培養結束後，3500r/min離心20min，去上清，菌泥立即加入經過滅菌並預熱至37°C的耐 熱凍幹保護劑，充分混勻，分裝後經冷凍真空乾燥而成，每頭份活菌數不少於3X 109CFU。
3.按照權利要求1和2所述的仔豬副傷寒活疫苗及其生產方法，其特徵是其中所使用 耐熱凍幹保護劑的最佳配方是水溶性明膠10g，PVP lg,山梨醇50g，蔗糖50g，199培養基 5g, L-穀氨酸鈉5g，磷酸氫二鉀1. 25g，磷酸二氫鉀0. 52g，注射用水1000ml。
全文摘要
本發明涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的生產方法。在本發明提供的生產方法中採用了合成培養基和耐熱凍幹保護劑及其相適應的凍幹曲線一整套技術，提高豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株培養菌數，保證批次間穩定性，減少凍幹過程的損失率，降低菌體死亡和代謝副產物產生的過敏反應，將成品疫苗的保存溫度提高到2～8℃，有效期達到18～24個月，並可實現較高溫度短期保存(37℃保存7日，活菌減少率低於20％)。
文檔編號A61K47/42GK101912608SQ20101025459
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者劉延亭, 孫曄, 朱良全, 王棟 申請人:北京海澱中海動物保健科技公司