人口腔鱗癌cal-27耐藥細胞株的培養方法及培養所得的細胞株的製作方法

2023-05-30 13:53:21

專利名稱：人口腔鱗癌cal-27耐藥細胞株的培養方法及培養所得的細胞株的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法及培養所得的細胞株。
背景技術：
在我國，口腔頜面部的惡性腫瘤以癌為最常見，肉瘤較少。在癌瘤中又以鱗狀細胞癌為最多見，一般佔80%以上；其次為腺性上皮癌(如黏液表皮樣癌、腺癌、腺樣囊性癌、惡性多形性腺瘤、腺泡細胞癌等)及未分化癌。鱗狀細胞癌常向區域淋巴結轉移，晚期可發生遠處轉移。針對鱗狀細胞癌，雖然目前已經開發出了很多的治療藥物並且已經被有效應用於臨床上，然而，在眾多的化療過程中經常遇到耐藥和多藥聯用耐藥的情況。耐藥性一般由眾多因素導致，其中不容忽視的是個體化基因的差異，差異基因的篩查與深入的耐藥分子機制研究對未來的臨床治療有很深遠的意義。傳統誘導與篩選的方法建立的口腔鱗癌細胞株由於大劑量給藥對細胞狀態影響較大，造成差異基因的人為改變，不利於後期篩查。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服目前常規方法篩選得到的人口腔鱗癌耐藥細胞株容易因人為因素造成基因改變的缺陷，而利用人口腔鱗癌CAL-27細胞作為親本細胞，選用臨床常用腫瘤化療藥物作為篩選藥物，在體外模擬人體體內給藥後藥物的真實作用過程，從而建立起一套穩定有效的耐藥細胞株篩選體系和方法。本發明提供的技術方案之一是:一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法，其包括如下步驟:(I)在細胞培養皿中種植人口腔鱗癌CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁後待融合率達到30 40%時加入篩選藥物，初始濃度採用該藥物的IC2tl值，連續作用24 72小時後洗去死細胞並擴增存活的細胞；(2)待細胞重新處於對數生長期時，將細胞重複步驟(I)中所述洗去死細胞並擴增存活的細胞的操作，並將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存後復甦細胞，即製得人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態變差，所述第二定值的判斷標準是細胞在該第二定值的反覆作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖不受影響，細胞生長正常。本發明中，步驟(I)較佳地在細胞長至貼壁後待融合率達到35 40%時加入篩選藥物；步驟(I)較佳地在連續作用36 48小時後洗去死細胞並擴增存活的細胞；所述的篩選藥物為臨床上常用的腫瘤化療藥物，較佳地選自5 -氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉬(CDDP)和羥基喜樹鹼(HCPT)中的任一種；所述的藥物的IC2tl值為臨床上常規的概念，指誘導腫瘤細胞凋亡20%時該藥物的濃度。本發明中，步驟(2)所述將細胞經過凍存後復甦細胞的操作較佳地為在細胞生長良好，細胞對藥物耐受增加，基本不出現凋亡時，將細胞凍存3個月後復甦細胞。本發明中，較佳地，在步驟(I)之前還包括如下步驟:(a)取生長狀態良好、處於對數生長期的人口腔鱗癌CAL-27細胞，用胰酶消化計數；(b)在細胞培養容器中種植8組細胞，每組3個重複樣品，每個樣品加入細胞數為8000個，待細胞生長至貼壁；(C)在含10%FBS的高糖DMEM完全培養基中添加步驟(I)所述篩選藥物形成濃度梯度，並加入對應組別的樣品細胞中，使該篩選藥物對細胞發揮作用，待藥物作用48小時後，加入MTT孵育4小時，然後加入三聯溶解液(10% SDS，5%異丁醇，0.01mol/L HCl)溶解，取樣於0D595nm檢測讀值，計算IC5tl濃度，並根據IC5tl濃度的值計算該篩選藥物的IC2tl濃度。

本發明中，步驟(a)所述用胰酶消化計數的操作中，所取的CAL-27細胞的數量與所用的胰酶數量之間的比例為本領域常規，只要胰酶能將待消化的細胞全部覆蓋浸潤即可；優選地，所取的CAL-27細胞的數量與所用的胰酶數量之間的比例為:每3X106個細胞用lmllOmol/ml的胰酶消化。本發明中，步驟(b)所述的細胞培養容器為本領域常規，優選96孔板。本發明中，優選地，步驟(c )所述的篩選藥物為5-氟尿嘧啶(5-Fu )、順鉬(⑶DP )和羥基喜樹鹼(HCPT )中的任一種。本發明中，優選地，步驟(c)所述的濃度梯度包括如下濃度:0yg/ml、0.02yg/ml、0.04 μ g/ml、0.08 μ g/ml、0.16 μ g/ml、0.32 μ g/ml、0.64 μ g/ml、1.28 μ g/ml。本發明中，優選地，步驟(C)所述的計算IC5tl濃度的方法採用《定量藥理學》(孫瑞元著，人民衛生出版社出版，1987)中所述的改良寇氏法，所述的改良寇氏法如表I所示:表權利要求
1.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法，其特徵在於，其包括如下步驟: (1)在細胞培養皿中種植人口腔鱗癌CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁後待融合率達到30 40%時加入篩選藥物，初始濃度採用該藥物的IC2tl值，連續作用24 72小時後洗去死細胞並擴增存活的細胞； (2)待細胞重新處於對數生長期時，將細胞重複步驟(I)中所述洗去死細胞並擴增存活的細胞的操作，並將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存後復甦細胞，即製得人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態變差，所述第二定值的判斷標準是細胞在該第二定值的反覆作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖不受影響，細胞生長正常。
2.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特徵在於，其是保藏號為CCTCC NO:C2012149的人口腔鱗癌CAL-27-5-Fu耐藥細胞株。
3.如權利要求2所述的人口腔鱗癌CAL-27-5-FU耐藥細胞株的子代細胞。
4.如權利要求2所述的人口腔鱗癌CAL-27-5-FU耐藥細胞株在製備於哺乳動物中產生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。
5.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特徵在於，其是保藏號為CCTCC NO:C2012150的人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株。
6.如權利要求5所述的人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株的子代細胞。
7.如權利要求5所述的人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株在製備於哺乳動物中產生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。
8.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特徵在於，其是保藏號為CCTCC NO:C2012151的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株。
9.如權利要求8所述的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株的子代細胞。
10.如權利要求8所述的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株在製備於哺乳動物中產生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法及所得的細胞株。該方法包括(1)在細胞培養皿中種植CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁後待融合率達到30～40%時加入篩選藥物，初始濃度採用該藥物的IC20值，連續作用24～72小時後洗去死細胞並擴增存活的細胞；(2)待細胞重新處於對數生長期時，重複(1)中所述洗去死細胞並擴增存活的細胞的操作，並將篩選藥物的濃度提高一倍作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存後復甦細胞，即得。所述的耐藥細胞株具有臨床上的人口腔鱗癌的生物學性狀，是研究人口腔鱗癌細胞的耐藥機制的理想模型。
文檔編號C12R1/91GK103205397SQ20131001772
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者王海峰, 姚遠頲, 費倩嵐, 談竹君, 勞昕元 申請人:上海黃離生物科技有限公司