一種生產人用狂犬疫苗的方法
2023-06-16 07:00:51 3
專利名稱：一種生產人用狂犬疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及疫苗的生產方法，特別是指一種人用狂犬疫苗的生產方法。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的病毒性傳染病。人一旦被病畜咬傷致病， 病毒率極高。及時注射疫苗和預防性接種疫苗是臨床上有效的防治狂犬病的有效手段。目前市場上存在的狂犬疫苗品種主要有4種第一種是雞胚、鴨胚疫苗，這種疫苗 產量較低，生產強度大，有外源毒性因子存在可能性；第二種是地鼠腎細胞原代培養疫苗， 同樣存在疫苗產量較低，生產強度大，有外源毒性因子存在可能性的問題；第三種是Vero 傳代細胞生產的疫苗，該品種可以解決產能問題，但不能保證細胞基質的安全性和致瘤性 的問題，因此該品種疫苗需保證DNA殘餘量不能超標；第四種是以二倍體細胞為基質的疫 苗，該疫苗由於使用了健康的人二倍體細胞，該細胞不含外源汙染因子和致瘤性，並且該細 胞的殘餘DNA無危險性，因而生產出來的疫苗具有免疫效果好，安全性高的優點。狂犬疫苗的產品質量取決於生產用的細胞基質、病毒毒種，產量取決於生產工藝。 中國專利公開號為CN1274607A的專利申請，公開了一種使用轉瓶工藝生產狂犬疫苗的方 法，病毒株為CTN株，該專利由於採用的是轉瓶工藝，因而產能較低；中國專利公開號為 CN1712068A的專利申請，公開了應用二倍體細胞生產狂犬疫苗的方法，生產工藝為轉瓶，病 毒株為aG株和CTN株，該專利由於採用的是轉瓶工藝，因而產能較低；中國專利公開號為 CN101028514A的專利申請，公開了利用生物反應器培養Vero細胞生產狂犬疫苗的方法，病 毒株為PV株，該專利由於使用的細胞基質是Vero細胞，因而存在DNA殘餘的生物安全性 問題，也沒有使用生物反應器的線性放大技術；中國專利公開號為CN101716341A的專利申 請，公開了利用二倍體細胞生產狂犬疫苗的方法，細胞基質為MRC-5、IMR-90、WI 38、2BS、 KMB17，病毒株為PM株。我國一直以來投入大量人力物力致力於防治狂犬病，也取得了一定的成效。然而 狂犬疫苗生產技術發展到現在，仍然存在產能過低，疫苗質量不高的問題。
發明內容
本發明目的在於提供一種生物反應器線性放大技術利用健康人二倍體細胞生產 狂犬疫苗進行規模化生產的新方法。
本發明的方法採用三級或三級以上生物反應器線性放大技術培養人二倍體細胞株，在 每一級的生物反應器中的人二倍體細胞株達到106/ml後進行下一級的生物反應器的接種； 在最後一級生物反應器中人二倍體細胞在微載體上生長到密度達到106/ml以上後，再將狂 犬病毒毒株接種；接種病毒株使得該病毒在細胞上進行增殖，然後收穫病毒原液，將收穫的 病毒原液進行滅活、濃縮、純化處理過程後，製備成人用狂犬疫苗。本發明的可以採用的狂犬病毒毒株為PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA中 的任——種；所用的健康人二倍體細胞株為MRC-5、MRC-9、HFL1、IMR-90、WI38、2BS、KMB17、
3CCC-HPF-1P5的任——種。作為本發明的改進，本方法亦可採用狂犬病毒毒株為PM病毒株；所用的健康人二 倍體細胞株為MRC-9、HFL1、CCC-HPF-1P5的任——種。作為本發明的改進，本方法亦可採用的狂犬病毒毒株為Flury病毒株；所用的健 康人二倍體細胞株為LYSSAVAC細胞株。在本發明的生產方法中，生物反應器進行線性放大的方式是將前一級生物反應器 中的細胞通過洗脫後經管道抽取流動的方式接種到下一級生物反應器中。在本發明的生產方法中，所用的細胞培養生物反應器為攪拌式生物反應器。生物 反應器中的微載體為顆粒狀微球微載體或者多孔性微載體。
具體實施例方式第一實施方式
(1)、復甦人二倍體細胞(WI-38)，接種到方瓶中；
(2)、待細胞長滿方瓶後，按1:3的比例放大傳代；
(3)、待細胞生長到一定數量時，接種到7.5L生物反應器中；生物反應器的工作體積 5L，配有2-20g/L微載體；
(4)、待7.5L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到50L生物反應器中；生物反應器的工作體積35L，配有2-20g/L微載體；
(5)、待50L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種到 500L生物反應器中；生物反應器的工作體積350L，配有2-20g/L微載體；
(6)、待500L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種PV 病毒株毒禾中；
(7)、每天收穫上清液300L，同時取樣檢測滴度；
(8)、連續收穫20-25天病毒原液；
(9 )、將病毒原液經過過濾、濃縮、純化後，製成狂犬疫苗。第二實施方式
(1)、復甦人二倍體細胞(2BS)，接種到方瓶中；
(2)、待細胞長滿方瓶後，按1:3的比例放大傳代；
(3)、待細胞細胞密度達到106/ml以上，將細胞接種到14L生物反應器中；生物反應器 的工作體積10L，配有2-20g/L微載體；
(4)、待14L生物反應器內的微載體長滿細胞，即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到100L生物反應器中；生物反應器的工作體積70L，配有2-20g/L微載體；
(5)、待100L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到1000L生物反應器中；生物反應器的工作體積700L，配有2-20g/L微載體；
(6)、待1000L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種PV 病毒株毒禾中；
(7)、每天收穫上清液650L，同時取樣檢測滴度；
(8)、連續收穫20-25天病毒原液；
(9 )、將病毒原液經過過濾、濃縮、純化後，製成狂犬疫苗。
4
第三實施方式
(1)、復甦人二倍體細胞(2BS)，接種到方瓶中；
(2)、待細胞長滿方瓶後，按1:3的比例放大傳代；
(3)、待細胞生長到一定數量時，將細胞接種到14L生物反應器中；生物反應器的工作 體積10L，配有2-20g/L微載體；
(4)、待14L生物反應器內的微載體長滿細胞時即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到100L生物反應器中；生物反應器的工作體積70L，配有2-20g/L微載體；
(5)、待100L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到1000L生物反應器中；生物反應器的工作體積700L，配有2-20g/L微載體；
(6)、待1000L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種 CTN病毒株毒種；
(7)、每天收穫上清液650L，同時取樣檢測滴度；
(8)、連續收穫20-25天病毒原液；
(9 )、將病毒原液經過過濾、濃縮、純化後，製成狂犬疫苗。第四實施方式
(1)、復甦人二倍體細胞(MRC-9)，接種到方瓶中；
(2)、待細胞長滿方瓶後，按1:3的比例放大傳代；
(3)、待細胞生長到一定數量時，將細胞接種到14L生物反應器中；生物反應器的工作 體積10L，配有2-20g/L微載體；
(4)、待14L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞接 種到100L生物反應器中；生物反應器的工作體積70L，配有2-20g/L微載體；；
(5)、待100L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到1000L生物反應器中；生物反應器的工作體積700L，配有2-20g/L微載體；
(6)、待1000L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種PM 病毒株毒禾中；
(7)、每天收穫上清液650L，同時取樣檢測滴度；
(8)、連續收穫20-25天病毒原液；
(9 )、將病毒原液經過過濾、濃縮、純化後，製成狂犬疫苗。第五實施方式
(1)、復甦人二倍體細胞(MRC-5)，接種到方瓶中；
(2)、待細胞長滿方瓶後，按1:3的比例放大傳代；
(3)、待細胞生長到一定數量時，將細胞接種到即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞 接種到3L生物反應器中；生物反應器的工作體積2L，配有2-20g/L微載體；
(4)、待3L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞接 種到30L生物反應器中；生物反應器的工作體積20L，配有2-20g/L微載體；
(5)、待30L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞接 種到300L生物反應器中；生物反應器的工作體積200L，配有2-20g/L微載體；
(6)、待300L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種PV 病毒株毒禾中；(7)、每天收穫上清液180L，同時取樣檢測滴度；
(8)、連續收穫20-25天病毒原液；
(9 )、將病毒原液經過過濾、濃縮、純化後，製成狂犬疫苗。
第六實施方式
(1)、復甦人二倍體細胞(2BS)，接種到方瓶中；
(2)、待細胞長滿方瓶後，按1:3的比例放大傳代；
(3)、待細胞生長到細胞密度達到106/ml以上時，將細胞接種到3L生物反應器中；生物 反應器的工作體積2L，配有2-20g/L微載體；
(4)、待3L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞接 種到30L生物反應器中；生物反應器的工作體積20L，配有2-20g/L微載體；
(5)、待30L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，將細胞接 種到300L生物反應器中；生物反應器的工作體積200L，配有2-20g/L微載體；
(6)、待300L生物反應器內的微載體長滿細胞即細胞密度達到106/ml以上時，接種ERA 病毒株毒禾中；
(7)、每天收穫上清液180L，同時取樣檢測滴度；
(8)、連續收穫20-25天病毒原液；
(9 )、將病毒原液經過過濾、濃縮、純化後，製成狂犬疫苗。
權利要求
1.一種生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於採用三級或三級以上生物反應器線性 放大技術培養人二倍體細胞株；在每一級的生物反應器中的人二倍體細胞株達到io6/mi後 進行下一級的生物反應器的接種；在最後一級生物反應器中人二倍體細胞在微載體上生長 到密度達到io6/mi以上後，再將狂犬病毒毒株接種；接種病毒株使得該病毒在細胞上進行 增殖，然後收穫病毒原液，將收穫的病毒原液進行滅活、濃縮、純化處理過程後，製備成人用 狂犬疫苗。
2.如權利要求1所述的生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於所用的狂犬病毒毒株 為PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA中的任——種；所用的健康人二 倍體細胞株為 MRC-5、MRC-9、HFLU IMR-90、WI38、2BS、KMB17、 CCC-HPF-1P5的任——種。
3.如權利要求1所述的生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於所用的狂犬病毒毒株 為PM病毒株；所用的健康人二倍體細胞株為MRC-9、HFL1、CCC-HPF-1P5的任一一種。
4.如權利要求1所述的生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於所用的狂犬病毒毒株 為Flury病毒株；所用的健康人二倍體細胞株為LYSSAVAC細胞株。
5.如權利要求1所述的生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於生物反應器進行線性 放大的方式是將前一級生物反應器中的細胞通過洗脫後經管道抽取流動的方式接種到下 一級生物反應器中。
6.如權利要求1所述的生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於所用的細胞培養生物 反應器為攪拌式生物反應器。
7.如權利要求1所述的生產人用狂犬疫苗的方法，其特徵在於生物反應器中的微載 體為顆粒狀微球微載體或者多孔性微載體。
全文摘要
一種生產人用狂犬疫苗的方法，採用三級或三級以上生物反應器線性放大技術培養人二倍體細胞株；在每一級的生物反應器中的人二倍體細胞株達到106/ml後進行下一級的生物反應器的接種；在最後一級生物反應器中人二倍體細胞在微載體上生長到密度達到106/ml以上後，再將狂犬病毒毒株接種；接種病毒株使得該病毒在細胞上進行增殖，然後收穫病毒原液，將收穫的病毒原液進行滅活、濃縮、純化處理過程後，製備成人用狂犬疫苗。由於使用反應器線性放大技術培養人二倍體細胞，該細胞不含外源汙染因子和致瘤性，並且該細胞的殘餘DNA無危險性，具有免疫效果好，安全性高的優點，符合大規模產業化生產狂犬疫苗的要求。
文檔編號A61P31/14GK102000326SQ20101055928
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月25日 優先權日2010年11月25日
發明者任政華, 伍活鐮, 尹順義 申請人:廣州齊志生物工程設備有限公司