基於組合蛋白的結核分枝桿菌金標診斷試劑的製作方法
2023-06-09 01:57:51
專利名稱：基於組合蛋白的結核分枝桿菌金標診斷試劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學免疫診斷技術領域，涉及利用結核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT6、MPT64、PstS-1、Ag85B抗原決定簇組合而成地新蛋白進行結核分枝桿菌診斷檢測的試劑及其在臨床結核病的診斷中的應用。
背景技術：
當前，由於耐藥和耐多藥結核病的增多，流動人口的增加以及愛滋病和結核病合併感染，造成結核病在全球範圍內回升。結核病仍然是當今全球最嚴重的傳染病之一，全球有三分之一的人口約有20億人感染過結核分枝桿菌，每年約有1000萬新感染者，每年有約300萬人死於結核病。中國現有結核病病人500萬，佔全球的四分之一，且下降趨勢緩慢，耐藥率高達46％，被列為「特別引起警示的國家和地區」之一。
結核病的臨床診斷對於結核病的早發現和早治療具有重要意義。目前結核病診斷的主要手段有病原菌的塗片染色鏡檢和分離培養、結核菌素皮膚試驗以及血清學檢測等。塗片染色鏡檢基於結核桿菌抗酸染色特性達到檢測的目的，但該法存在靈敏度低、特異性差的缺點(靈敏度為10-20％)。分離培養法檢查往往需4-8周或更長的時間，常延誤臨床的診斷和治療。結核分枝桿菌侵入人體後，會引起人體的細胞免疫和體液免疫，以細胞免疫為基礎的PPD皮試是臨床上廣泛應用的比較簡便的結核菌感染的檢測方法，但特異性較差。以體液免疫為基礎的結核病特異性抗體的檢測已經成為結核病診斷的一種重要的輔助手段。早期，人們將PPD作為抗原通過ELISA法來檢測抗體，這種方法具有一定的局限性。一、PPD是一種混合性抗原，很多蛋白不僅結核分枝桿菌有，其他分枝桿菌也具有。很難鑑別結核病與環境分枝桿菌感染者以及卡介苗接種陽轉者。二、ELISA法需專人操作，不同人操作，不同批試劑，結果有很大不同，穩定性較差，而且時間也較長，需2-3小時。臨床標本難做到隨到隨檢測，限制了其推廣。後來，金標滲濾法應用到結核病人抗體的檢測，大大縮短了檢測的時間(僅10-20分鐘)，降低了反應中人為因素的影響，在一定程度上提高了特異性，現在臨床應用的多是由這一方法製備的試劑盒。但僅用單一蛋白作抗原，就降低了檢測的敏感性，而且金標法檢測臨床標本的敏感性本身就低於ELISA法，而且重組蛋白也含有不同的抗原決定簇，有一定的交叉反應，敏感性和特異性都需進一步提高。
ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85是結核分枝桿菌的主要分泌蛋白，能引起人體的保護性免疫反應。且ESAT6、MPT64在大部分環境及卡介苗中缺失，PstS-1在卡介苗中的含量也只是結核分枝桿菌的十分之一。1998年，Morten等報導了ESAT6的B細胞抗原決定簇，Thomas等報導了MPT64的抗原決定簇，PstS-1、Ag85B的抗原決定簇也已被報導。市售結核病血清檢測試劑IC-TB卡中含PstS-1完整蛋白，其敏感性和特異性均有待提高；其他蛋白未見製成血清學檢測試劑的報導。
發明內容
本發明的目的是為克服已有技術的不足之處，提出一種基於組合蛋白的結核分枝桿菌的金標診斷試劑，該試劑靈敏度高，特異性強，且操作簡便、快速，不需要人員培訓及昂貴的儀器設備，可廣泛用於臨床結核病的臨床血清學診斷。
本發明的特點及良好效果
本發明將結核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B的結核分枝桿菌特異性的B細胞抗原決定簇的胺基酸進行組合。通過常規的計算機軟體分析組合蛋白的空間結構，選擇空間結構合理的組合蛋白，再通過常規的基因工程手段，將組合蛋白在體外表達、純化、並製備結核分枝桿菌的抗體檢測金標試劑。
利用本發明的組合蛋白作為抗原可檢測針對由ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B蛋白作抗原所產生的結核病特異性抗體，比單一完整蛋白檢測的敏感性和特異性有所提高。結核分枝桿菌主要分泌蛋白B細胞抗原決定簇組合蛋白與免疫金銀染色聯合應用，理論上可從2個方面提高檢測的敏感性和特異性。同時，還具有金標滲濾法快速、易操作的特點，便於臨床推廣應用，對於結核病檢測，確診具有重要意義。可廣泛用於臨床結核病的臨床血清學診斷。
本發明中的組合蛋白也可為包被抗原，製備結核分枝桿菌抗體ELISA(間接法)檢測試劑。本發明中生產的抗體也可作為包被抗體，製備結核分枝桿菌抗原ELISA(雙抗體夾心法)檢測試劑。
具體實施例方式
本發明提出的結核分枝桿菌的金標診斷試劑製備實施例，包括以下步驟
1)從文獻中找出ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B蛋白結核分枝桿菌特異的B細胞抗原決定簇的胺基酸，進行組合，通過計算機軟體預測組合蛋白的空間結構，選擇空間結構合理的組合，合成組合蛋白的編碼基因如下
ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG GGT ATC GAG GCC GCG GCA AGC GCA ATCCAG GGA GGC TGT GGC TCG AAA CCA CCG AGC GGT TCG CCT GAA ACG GGC GCC GGTCCA ACG ACC ACG TAC AAG GCC TTC GAT TGG GAC CAG GCC TAT CGC AAG CCA ATC ACCTAT GGT CCC TCG AGT GAC CCG GCA TGG GAG CGC AAC GAC CCT ACG CAG CAG AGCTTC CTC GAC CAG GCC AGT CAA CGG GGA CTC GGC GAG GCC CAA GCT CAG CTC AACGCC ATG AAG GGT GAC CTG CAG AGT TCG TTA GGC GCC，該編碼基因兩端含酶切位點BamH I和HindIII；
2)將上述合成的基因片段進行PCR擴增，將擴增產物克隆T載體上，對重組子進行BamH I和HindIII酶切及測序鑑定，用合成片段兩端的酶切位點，從T載體上切下目的片段，克隆到表達載體PET24b上，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，培養至OD600為0.6時加入IPTG至終濃度為0.1M誘導表達，通過凝膠電泳及Western Blotting進行鑑定分析；
3)、採用凝膠(Pharmacia公司chelating sephrose fast flow生產)，經過金屬鏊合層析來純化表達蛋白；
4)、將購買純化的人IgG(從經科宏達公司)採用標準的免疫程序免疫家兔製備抗人IgG抗體(還可包括IgM、IgA)；
5)、通過檸檬酸還原法製備膠體金；即0.01％氯化金水溶液100ml加熱煮沸，磁力攪拌下加入1％檸檬酸三鈉水溶液4ml，繼續加熱煮沸使溶液呈亮紅色為止；冷卻後調pH至5.8，按每ml膠體金加6ug兔抗人IgG的比例，將二者混合，加入適量聚乙而醇，然後高速離心純化。
6)、經方陣滴定，確定檢測蛋白的濃度2mg/ml，取1ul滴在纖維素濾膜上，並取2mg/ml的人IgG 1ul滴在纖維素濾膜上，製備金標滲濾板。並配備封閉緩衝液(0.02mol/LPh7.4的Tris-HCL緩衝液，含1％BSA，0.05％Tween-20)，洗滌緩衝液(0.02mol/L Ph7.4的Tris-HCL緩衝液，0.05％Tween-20)。製備結核分枝桿菌金標滲濾抗體檢測試劑。
7)、在結核分枝桿菌金標滲濾抗體檢測試劑的基礎上，配備銀染液(乙酸銀0.11％，對苯二酚0.35％，阿拉伯樹膠7.14％)等試劑；製備結核分枝桿菌金標滲濾(銀加強)抗體檢測試劑。
上述各製備步驟均為常規成熟技術。
本發明的應用實施例
實施例1金標滲濾抗體檢測試劑檢測結核分枝桿菌抗體
取金標滲濾板一塊，加封閉液2-4滴，待封閉液完全滲幹後，加入病人血清2-4滴，待血清完全滲幹後，加入洗滌緩衝液2-4滴，待洗滌緩衝液完全滲幹後，加入金標二抗2-4滴，二抗滲幹後，加入洗滌緩衝液2-4滴，等5-10分鐘，待左邊質控點完全顯色後，觀察右邊點是否顯色，若呈紅色則為陽性結果，若無點出現則為陰性結果。
實施例2金標滲濾(銀加強)抗體檢測試劑檢測結核分枝桿菌抗體
取金標滲濾板一塊，加封閉液2-4滴，待封閉液完全滲幹後，加入病人血清2-4滴，待血清完全滲幹後，加入洗滌緩衝液2-4滴，待洗滌緩衝液完全滲幹後，加入金標二抗2-4滴，二抗滲幹後，加入洗滌緩衝液2-4滴，等5-10分鐘，待左邊質控點完全顯色後，加銀加強試劑2-4滴，5-10分鐘後，觀察右邊點是否顯色，若呈黑色則為陽性結果，若無點出現則為陰性結果。
本發明的效果實驗如表1
表1不同試劑檢測不同人血清(各200份)的陽性率
由上結果可見本發明試劑檢測結核病人血的敏感性為61％，特異性為98％，高於FD結核桿菌抗體診斷盒的48％和95％。
權利要求
1.一種基於組合蛋白的結核分枝桿菌的金標診斷試劑，其特徵在於，採用結核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT6、MPT64、PstS-1、Ag85B的B細胞抗原決定簇重新組合為一個蛋白作抗原，作為結核病的臨床血清學診斷的特異性地檢測抗體。
2.如權利要求1所述的基於組合蛋白的結核分枝桿菌的金標診斷試劑，其特徵在於，所述結核分枝桿菌主要分泌蛋白的B細胞抗原決定簇組合蛋白的編碼基因為
ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG GGT ATC GAG GCC GCG GCA AGC GCA ATCCAG GGA GGC TGT GGC TCG AAA CCA CCG AGC GGT TCG CCT GAA ACG GGC GCC GGTCCA ACG ACC ACG TAC AAG GCC TTC GAT TGG GAC CAG GCC TAT CGC AAG CCA ATC ACCTAT GGT CCC TCG AGT GAC CCG GCA TGG GAG CGC AAC GAC CCT ACG CAG CAG AGCTTC CTC GAC CAG GCC AGT CAA CGG GGA CTC GGC GAG GCC CAA GCT CAG CTC AACGCC ATG AAG GGT GAC CTG CAG AGT TCG TTA GGC GCC。
3、一種基於組合蛋白的結核分枝桿菌的金標診斷試劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟
1)從文獻中找出ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B蛋白結核分枝桿菌特異的B細胞抗原決定簇的胺基酸，進行組合，合成編碼基因如下ATG ACA GAG CAG CAG TGG AATTTC GCG GGT ATC GAG GCC GCG GCA AGC GCA ATC CAG GGA GGC TGT GGC TCG AAACCA CCG AGC GGT TCG CCT GAA ACG GGC GCC GGT CCA ACG ACC ACG TAC AAG GCCTTC GAT TGG GAC CAG GCC TAT CGC AAG CCA ATC ACC TAT GGT CCC TCG AGT GAC CCGGCA TGG GAG CGC AAC GAC CCT ACG CAG CAG AGC TTC CTC GAC CAG GCC AGT CAACGG GGA CTC GGC GAG GCC CAA GCT CAG CTC AAC GCC ATG AAG GGT GAC CTG CAGAGT TCG TTA GGC GCC，該編碼基因兩端含酶切位點BamHI和HindIII；
2)將上述合成的基因片段進行PCR擴增、克隆、誘導表達；
3)採用凝膠純化表達蛋白；
4)將購買純化的人IgG採用標準的免疫程序免疫家兔製備抗人IgG抗體；
5)通過檸檬酸還原法製備膠體金，將膠體金與抗人IgG抗體者混合，離心純化；
6)經方陣滴定，確定檢測蛋白的濃度，並配備封閉緩衝液，洗滌緩衝液製備成結核分枝桿菌金標滲濾抗體檢測試劑。
4、如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，還包括
7)在所述製備的結核分枝桿菌金標滲濾抗體檢測試劑加入銀染液試劑；製備成結核分枝桿菌金標滲濾(銀加強)抗體檢測試劑。
全文摘要
本發明屬於醫學免疫診斷技術領域，涉及基於組合蛋白的結核分枝桿菌金標診斷試劑，採用結核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT6、MPT64、PstS－1、Ag85B的B細胞抗原決定簇重新組合為一組蛋白作抗原，作為結核病的臨床血清學診斷的特異性地檢測抗體。本發明將結核分枝桿菌主要分泌蛋白的B細胞抗原決定簇基因進行組合併通過基因工程手段表達、純化得到一個新蛋白，通過金標滲濾法檢測結核病人血清。本發明靈敏度高，操作簡單，檢測快速、省時，特異性強，能區分是因為接種卡介苗、以及與環境中多種非結核分枝桿菌接觸而造成的致敏還是真正的結核分枝桿菌感染，可廣泛用於臨床結核病的臨床血清學診斷。
文檔編號G01N33/53GK1844929SQ20051010329
公開日2006年10月11日 申請日期2005年9月23日 優先權日2005年9月23日
發明者張靈霞, 吳雪瓊 申請人:中國人民解放軍第三○九醫院