Hip-55蛋白在開發抑制腫瘤藥物中的應用的製作方法

2023-12-09 01:58:56 2

Hip-55蛋白在開發抑制腫瘤藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種HIP-55蛋白的新用途。本發明提供的重組載體，為將編碼幹擾HIP-55蛋白表達siRNA的DNA分子插入表達載體，得到重組載體；所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。還提供了HIP-55蛋白或含有HIP-55蛋白編碼基因的重組載體在製備具有如下1）和/或2）功能的產品中的應用：1）促進腫瘤細胞遷移；2）促進腫瘤細胞侵襲；所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。本發明的實驗證明，通過在肺癌細胞中過表達該蛋白的基因，則促進腫瘤形成、促進肺癌細胞遷移和肺癌細胞侵襲；因此，HIP-55為臨床診斷、治療及新藥開發提了供新的靶點，可以用於在篩選、開發和/或設計預防和/或治療腫瘤產品。
【專利說明】HIP-55蛋白在開發抑制腫瘤藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種HIP-55蛋白在開發抑制腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]HIP-55(hematopoietic progenitor kinase I[HPK1]-1nteracting proteinof55kDa ;也稱為 drebrin-like protein DBNL>mAbpl 或 SH3P7)是一個包含多功能域的蛋白質。其結構主要包含著N端的F-actin蛋白結合結構域和C端SH3結構域。HIP-55參與突觸發生、受體內吞、骨架重排及信號轉導。目前對HIP-55功能了解較少，已知HIP-55通過調節T細胞受體內吞、細胞因子釋放和B細胞受體呈遞等在免疫系統起著重要作用。最近研究表明HIP-55通過與N-WASP和Arp2/3相互作用在神經系統中調節骨架重排。但其在腫瘤中的作用均尚無研究。

【發明內容】

[0003]本發明的一個目的是提供一種重組載體。
[0004]本發明提供的重組載體，為將編碼幹擾HIP-55蛋白表達siRNA的DNA分子插入表達載體，得到重組載體；所述HIP -55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。
[0005]上述重組載體中，所述編碼幹擾HIP-55蛋白表達siRNA的DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列5。在本發明的實施例中，所述表達載體為pSilenCer5.1 ;重組載體為pSilencer5.1-siRNA,為將編碼 siRNA 的 DNA 分子(序列 5)插入 pSilencer5.1 載體的 BamHI和HindIII酶切位點間，得到表達序列3所示的HIP-55siRNA的載體。
[0006]上述的重組載體在製備具有如下1)-7)中至少一種功能的產品中的應用也是本發明保護的範圍:
[0007]I)抑制細胞增殖；
[0008]2)促進細胞凋亡；
[0009]3)抑制腫瘤細胞遷移；
[0010]4)抑制腫瘤細胞侵襲；
[0011]5)抑制腫瘤細胞克隆形成；
[0012]6)抑制腫瘤形成；
[0013]7)預防和/或治療腫瘤。
[0014]上述應用中，所述產品為藥物。
[0015]上述應用中,所述腫瘤為肺癌；所述腫瘤細胞為腫瘤細胞。
[0016]上述應用中，所述腫瘤細胞為肺癌細胞；所述肺癌細胞具體為人非小細胞肺癌細胞。
[0017]本發明的另一個目的是提供HIP-55蛋白或其編碼基因或含有HIP-55蛋白編碼基因的重組載體的應用。[0018]本發明提供的HIP-55蛋白或其編碼基因或含有HIP-55蛋白編碼基因的重組載體在製備具有如下I)和/或2)功能的產品中的應用:
[0019]I)促進腫瘤細胞遷移；
[0020]2)促進腫瘤細胞侵襲；
[0021]所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。
[0022]上述應用中，所述HIP-55蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0023]上述應用中，所述產品為藥物。
[0024]上述應用中，所述腫瘤為肺癌；
[0025]所述腫瘤細胞為腫瘤細胞；所述腫瘤細胞為肺癌細胞；在本發明的實施例中，所述肺癌細胞為人非小細胞肺癌細胞，具體為人非小細胞肺癌細胞A549。
[0026]HIP-55蛋白在篩選、開發和/或設計預防和/或治療腫瘤產品中的應用也是本發明保護的範圍；所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。
[0027]本發明的實驗證明，本發明發現HIP-55在臨床肺癌病人組織樣本中明顯高表達，進一步研究表明HIP-55的功能:通過在肺癌細胞中過表達該蛋白的基因，可以促進腫瘤形成、促進肺癌細胞遷移和肺癌細胞侵襲；通過RNA幹擾沉默HIP-55蛋白，可以明顯抑制腫瘤形成、促進凋亡、抑制增殖、細胞克隆形成、細胞遷移和/或細胞侵襲，可用來製備預防和/或治療腫瘤產品。因此 ，HIP-55為臨床診斷、治療及新藥開發提了供新的靶點，可以用於在篩選、開發和/或設計預防和/或治療腫瘤產品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為RNA幹擾HIP-55的細胞中蛋白表達
[0029]圖2為過表達HIP-55的細胞中蛋白表達
[0030]圖3為RNA幹擾HIP-55的細胞增殖
[0031]圖4為過表達HIP-55的細胞增殖
[0032]圖5為HIP-55對肺癌細胞A549凋亡的影響
[0033]圖6為HIP-55對細胞凋亡標記物的影響
[0034]圖7為HIP-55對細胞克隆形成能力的影響
[0035]圖8為劃痕試驗檢測HIP-55對細胞遷移的影響
[0036]圖9為Transwell檢測HIP-55對細胞遷移的影響
[0037]圖10為HIP-55對細胞侵襲影響
[0038]圖11為HIP-55對成瘤的影響
[0039]圖12為HIP-55在肺癌患者組織樣本中高表達
【具體實施方式】
[0040]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0041]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0042]下述實施例中定量實驗均重複三次，結果取平均值。
[0043]下述實施例中Ant1-HIP-55 抗體購自 BD Bioscience (San Diego, CA)。
[0044]下述實施例中人非小細胞肺癌A549(美國ATCC，產品目錄號CCL-185?)在含有10%胎牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml鏈黴素的高糖DMEM的培養液中培養，並放置在37°C、5%濃度的二氧化碳培養箱中。A549細胞經過消化傳代，取對數生長期細胞待用。
[0045]人HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2，編碼該蛋白的基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0046]實施例1、過表達HIP-55的A549細胞和敲減HIP-55的A549細胞的構建
[0047]一、HIP_55siRNA 的獲得
[0048]針對人HIP-55蛋白編碼基因設計併合成如下siRNA序列:
[0049]HIP-55 siRNA,其核苷酸序列為 5』-GAUCCG CAGUGAACGUAGAGAAUUGUUCAAGAGACAAUUCUCUACGUUCACUGUU UUUUGGAAA-3，(序列 3)；
[0050]對照Scramble siRNA,其核昔酸序列為 5』 -GAUCCGCACUACCGGUUGUAUAGGUGUUCAAGAGA CACCUAUACAAAGGUAGUG UUUUGGAAA-3，(序列 4)。
[0051]二、過表達HIP-55的重組載體和RNA幹擾HIP-55的重組載體的構建
[0052]1、過表達 HIP-55 的重組載體 pLenti6/V5-HIP_55 構建
[0053]以上述序列表中序列I所示的HIP-55的基因為模板，用
[0054]Forward:』 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCGGCGAACCTGAGCC-3，和
[0055]Reverse: 5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTCAATGAGCTCCACGTAGT-3 』引物進行擴增，得到1356bp的PCR產物。
[0056]將1356bp的PCR產物與pD0NR221載體(購自Invitrogen，產品目錄號為12536017)進行 BP 反應，得到重組載體 pD0NR221_HIP_55，再將 pD0NR221_HIP_55 與pLenti6/V5-DEST (購自Invitrogen，產品目錄號為V49610X)進行LR反應，得到重組載體pLenti6/V5-HIP_55。經過測序,該重組載體pLenti6/V5-HIP_55為將序列表中的序列I所示的DNA分子插入表達載體的pLenti6/V5-DEST間得到的載體。
[0057]2、RNA 幹擾 HIP-55 的重組載體 pSilencer5.Ι-siRNA 的構建
[0058]合成編碼HIP-55 siRNA的DNA分子，其核苷酸序列為；5』-GATCCGCAGTGAACGTAGAGAATTG TTCAAGAGA CAATTCTCTACGTTCACTGTT TTTTGGAAA-3』(序列5);由兩條單鏈DNA退火形成，其中一條單鏈DNA的核苷酸序列為F:5』-GATCCGCAGTGAACGTAGAGAATTG TTCAAGAGA CAATTCTCTACGTTCACTGTT TTTTGGAAA-3』另一條單鏈 DNA 的核苷酸序列為 R:5』-AGCTITTCCAAAA AACAGTGAACGTAGAGAATTGTCTCTTGAACAATTCTCTACGTTCACTG CG-3』 。
[0059]RNA 幹擾載體 pSilencer5.Ι-siRNA 為將編碼 HIP-55 siRNA 的 DNA 分子(序列 5)插入pSilencer5.1 (Invitrogen, AM5782)載體的BamHI和HindIII酶切位點間，得到表達序列3所示的HIP-55 siRNA的載體。
[0060]該DNA分子由正向DNA片段、間隔片段和反向DNA片段組成；其中正向DNA片段為序列表中序列5自5』末端第7-25位核苷酸、間隔片段為序列表中序列5自5』末端第26-34位核苷酸和反向DNA片段為序列表中序列5自5』末端第35-53位核苷酸所不的DNA分子。
[0061]對照RNA 幹擾載體 pSilencer5.1-Scramble:為將編碼 Scramble siRNA 的 DNA 分子插入pSilencer5.1載體的BamHI和HindIII位點間，得到表達序列4所示的ScramblesiRNA的載體。
[0062]上述編碼Scramble siRNA的DNA分子，其核苷酸序列為5』 -GATCCGCACTACCGGTTGTATAGGTG TTCAAGAGA CACCTATACAAAGGTAGTG TTTTGGAAA-3』(序列
6);該DNA分子由正向DNA片段、間隔片段和反向DNA片段組成；其中正向DNA片段為序列表中序列6自5』末端第7-25位核苷酸、間隔片段為序列表中序列6自5』末端第26-34位核苷酸和反向DNA片段為序列表中序列6自5』末端第35-53位核苷酸。
[0063]三、過表達HIP-55的A549細胞和RNA幹擾HIP-55的A549細胞的構建
[0064]1、過表達HIP-55的A549細胞的構建
[0065]將上述二得到的重組載體pLenti6/V5-HIP-55感染A549細胞中，得到A549/pLenti6/V5-HIP-550
[0066]2、對照過表達HIP-55的A549細胞的構建
[0067]將表達載體pLenti6/V5-DEST 感染 A549 細胞中，得到 A549/pLenti6/V5。
[0068]3、RNA幹擾HIP-55的A549細胞的構建
[0069]將上述二得到的RNA幹擾載體pSilencer5.Ι-siRNA脂質體法轉染A549細胞中，嘌呤黴素(puromycin, 1.25 μ g/ml)篩選病毒感染陽性細胞克隆，得到A549/pSilencer5.1-siRNA。
[0070]4、對照RNA幹擾A549細胞的構建
[0071]將上述二得到的對照RNA幹擾載體pSilencer5.1-Scramble脂質體法轉染A549細胞中，嘌呤黴素(puromycin，1.25 μ g/ml)篩選病毒感染陽性細胞克隆，得到A549/pSilencer5.l—Scramble。
[0072]4、western blot 鑑定
[0073]在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養A549/pLenti6/V5對照細胞(Con )、A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(scr)和 A549 細胞(parental/par) 36 小時；離心收集上清液；用 western blot 檢測(Ant1-HIP-55, BD Biosciences,產品目錄號:612615)。
[0074]結果如圖1和圖2所示，圖1為RNA幹擾HIP-55的細胞中蛋白表達，圖2為過表達HIP-55的細胞中蛋白表達；
[0075]圖1 中 Αδ49 細胞(parental/par)和 A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(scr)中均有目的蛋白HIP-55的表達，而與A549/pSilencer5.1-Scramble細胞(scr)相比，RNA幹擾 HIP-55 的細胞 A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)中 HIP-55 蛋白的表達量明顯減低，且敲減效率在90%以上。
[0076]A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(scr)結果與 A549 細胞(parental/par)無顯
著差異。
[0077]圖2 中 A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55)和 A549/pLenti6/V5 對照細胞(Con)相比，A549/pLenti6/V5-HIP-55細胞(HIP-55)中的HIP-55蛋白表達量明顯高於A549/pLenti6/V5 對照細胞(Con)。
[0078]採用同樣的方法將空載體pSilencer5.1轉染A549細胞，得到轉空載體細胞A549/pSilencer5.1。
[0079]實施例2、HIP-55的功能研究
[0080]一、HIP-55對A549細胞增殖和凋亡影響
[0081]1、HIP-55對肺癌A549細胞增殖的影響[0082]採用磺醯羅丹明(SRB)顯色法檢測:
[0083]將A549 細胞(parental/par)、A549/pLenti6/V5 (con)細胞、由實施例1 得到的 A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-ScrambIe細胞(Scr)培養結束後，取出培養板，每孔加入50% (質量/體積)的三氯乙酸(TCA) 50 μ L固定細胞，TCA的終濃度為10%，輕柔地加在每孔液面上，然後在4°C冰箱中放置lh。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中乾燥後，每孔加0.4%的SRB100LL，室溫下放置10~30min，棄去各孔內液體後用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中乾燥後用pH為10.5、10mmol/L unbuffered Tris base(三輕甲基胺基甲烷)溶解，在平板振蕩器上振蕩5min，在酶聯免疫檢測儀于波長為490nm測定OD值。以 A549/pSilencer5.1 細胞和 A549/pLenti6/V5 (con)細胞為對照。
[0084]結果如圖3和圖4所示，圖中的數值是以第一天OD值為I，其餘為其比值；
[0085]圖3為RNA幹擾HIP-55的細胞增殖，其中A549細胞(parental/par)細胞在培養1、2、3、4、5、6天的細胞增殖比例分別為 1、1.402,2.218,2.569,3.661,5.703 ；
[0086]A549/pSilencer5.l-Scramble 細胞(Scr)細胞在培養 1、2、3、4、5、6 天的細胞增殖比例分別為 1、1.467,2.560,2.688,4.197,7.140 ；
[0087]A549/pSilencer5.1-siRNA 細胞(HIP-55KD)在培養 1、2、3、4、5、6 天的細胞增殖比例分別為 1、1.052、1.579、1.983,2.705,3.05 ；
[0088]圖4為過表達HIP-55的細胞增殖，其中，A549/pLenti6/V5 (con)細胞在培養1、
2、3、4、5、6天的細胞增殖比例分別為 1、1.276、1.688,3.339,3.845,4.882 ；
[0089]A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55)在培養 1、2、3、4、5、6 天的細胞增殖比例分別為 1、1.640,2.716,5.513,6.957,9.402 ；
[0090]A549細胞和A549/pSilencer5.1結果無顯著差異。
[0091]結果表明，與A549 細胞(parental, par)及 A549/pSilencer5.1-ScrambIe 細胞(Scr)相比，敲減 HIP-55 後細胞 A549/pSilencer5.1-siRNA (HIP-55KD)的增殖明顯減弱；與之相反，與 A549/pLenti6/V5(con)相比，過表達 HIP-55 後細胞 A549/pLenti6/V5-HIP-55細胞(HIP-55)的增殖明顯增強。
[0092]因此敲減HIP-55抑制細胞增殖；過表達HIP-55可提高細胞增殖。
[0093]2、HIP-55對肺癌細胞A549凋亡的影響
[0094]將由實施例1 得到的 A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble細胞(Scr)接種於12孔板,完全培養基中培養24h,加入腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor- α , TNF- α ;BD 公司，貨號:354066)誘導凋亡(lOOng/ml)，在不同時間收集細胞並用PBS洗三遍，7-AAD和Annexin5_PE染色，混勻，室溫避光反應15min,流式細胞儀(Guava flow cytometer systems, Millipore)檢測凋亡率。
[0095]結果如圖5所示，
[0096]A549/pSilencer5.l-Scramble 細胞(Scr)在 0、6、9h 的凋亡率分別為 7.2%、11.3%、29.3% ；
[0097]A549/pSilencer5.1-siRNA (HIP-55KD)在 0、6、9h 的凋亡率分別為 12.8%、30%、54.8% ；
[0098]應用western blot檢測細胞凋亡標記物Cleaved Caspase-3 (出售公司cel I signaling ;產品目錄號 #9664)和 Parp(出售公司 cel I signaling ;產品目錄號 #9532),結果如圖6所示，在A549細胞中敲減HIP-55後，剪切形式的caspase 3和Parp明顯增加，表明細胞凋亡明顯增加，而在A549細胞過表達HIP-55後則完全逆轉這一生物學過程。
[0099]上述結果表明，在A549細胞中敲減HIP-55後，可以促進細胞凋亡，提高凋亡率。
[0100]二、HIP-55對細胞克隆形成能力的影響
[0101]採用軟瓊脂克隆形成分析，以1%的瓊脂糖凝膠作為儲備膠，冷卻至50°C時，與培養基按比例混合配製0.6%的底層膠鋪於培養皿中；再冷卻至42°C時，按比例與細胞懸液混合，0.2%的上層瓊脂.待上層瓊脂凝固後在其表面覆蓋一層完全培養基以防止瓊脂表面乾燥，然後放入細胞培養箱中培養，每日鏡下觀察，並補充培養基，2周後光鏡下細胞克隆群落集落形成。
[0102]上述細胞懸液為將細胞在培養基中培養2周時間得到的懸浮液。
[0103]上述細胞為A549 細胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(Scr)。以 A549/pSilencer5.1 為對照。
[0104]結果如圖7 (其中左圖為拍照結果，右圖為克隆數統計結果)所示，
[0105]A549 細胞(parental/par)的細胞克隆數為 76.6 ；
[0106]A549/pSilencer5.l-Scramble 細胞(Scr)的細胞克隆數為 105
[0107]A549/pSilencer5.1-siRNA 細胞(HIP-55KD)的細胞克隆數為 38 ；
[0108]A549 細胞(parental/par)和 A549/pSilencer5.1 結果無顯著差異。
[0109]上述結果表明，在A549細胞中敲減HIP-55後，與A549細胞(parental，par)及A549/pSilencer5.1-Scramble細胞(Scr)相比,細胞克隆形成能力明顯降低。
[0110]三、HIP-55對細胞遷移影響
[0111]I)劃痕試驗
[0112]6孔板內鋪入細胞，待細胞融合後，用200 μ L無菌移液槍頭劃痕，PBS小心洗去漂浮細胞重複3次，培養24h後顯微鏡下觀察。
[0113]上述細胞為A549 細胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(Scr)。以 A549/pSilencer5.1 為對照。
[0114]結果如圖8所示，可以看出，在A549細胞中敲減HIP-55後，與A549細胞(parental/par)及siRNA無關序列對照細胞(scramble, scr)相比，細胞遷移能力明顯降低。
[0115]A549 細胞(parental/par)和 A549/pSilencer5.1 結果無顯著差異。
[0116]2) Transwell細胞遷移實驗
[0117]Transwell (8 μ mporesize; BD Biosciences 小室每孔加入 I X IO5 個細胞，小室下室加入含胎牛血清的DMEM，37°C培養24h後，用棉籤擦去微孔膜上層的和未侵襲人基底膜的細胞，將侵襲至下層面的細胞用甲醇固定，蘇木素染色。在倒置顯微鏡下計數移至微孔膜下層的細胞，置入750mL / L酒精固定15min，結晶紫染色15min，PBS反覆漂洗，洗去多餘的結晶紫。200倍顯微鏡下觀察，隨機計數5個視野，取均值。
[0118]上述細胞為A549 細胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD), A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(Scr)、A549/pLenti6/V5 細胞(Con)、A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55);以 A549/pSilencer5.1 為對照。[0119]結果如圖9所示，A為幹擾結果，B為過表達結果，其中左圖均為顯微鏡拍照結果，右圖均為統計圖；可以看出，
[0120]A549 (parental/par)穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為 281 ；
[0121]A549/pSilencer5.l-siRNA(HIP_55KD)穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為 103 ；
[0122]A549/pSilencer5.l-Scramble (Scr)穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為 306。
[0123]A549/pLenti6/V5對照細胞(Con)穿過Transwell小室膜的細胞數量為220 ；
[0124]A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55)穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為468。
[0125]可以看出，在A549細胞中敲減HIP-55後，與A549細胞(parental/par)及siRNA無關序列對照細胞(scramble, scr)相比,細胞遷移能力明顯降低。
[0126]在A549細胞中過表達HIP-55後，與A549細胞(Con)相比，細胞遷移能力明顯增加。
[0127]四、HIP-55對細胞侵襲影響
[0128]Transwell上室底部預先包被Matrigel膠,使用前加人少量無血清的培養基水化。其餘同Transwell小室遷移 實驗。
[0129]幹擾組中細胞為A549 細胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(Scr)；
[0130]過表達組中細胞為A549/pLenti6/V5 對照細胞(Con)、A549/pLenti6/V5-HIP_55細胞(HIP-55)。
[0131]結果如圖10所示，A為幹擾結果，B為過表達結果，其中左圖均為顯微鏡拍照結果，右圖均為統計圖；
[0132]A549細胞(parental/par)侵襲Matrigel穿過Transwell小室膜的細胞數量為471 ；
[0133]A549/pSilencer5.1-siRNA 細胞(HIP-55KD)侵襲 Matrigel 穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為150 ；
[0134]A549/pSilencer5.l-Scramble 細胞(Scr)侵襲 Matrigel 穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為565。
[0135]表明，在A549細胞中敲減HIP-55後，與A549細胞(parental,par)及siRNA無關序列對照細胞(scramble, scr)相比,細胞侵襲能力明顯降低。
[0136]A549/pLenti6/V5對照細胞(Con)侵襲Matrigel穿過Transwell小室膜的細胞數量為84 ；
[0137]A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55)侵襲 Matrigel 穿過 Transwell 小室膜的細胞數量為238。
[0138]表明，在A549細胞中過表達HIP-55後，與A549/pLenti6/V5對照細胞(Con)相比，細胞侵襲能力明顯增加。
[0139]五、HIP-55對成瘤的影響
[0140]體外培養的細胞，收集細胞並調整到適宜濃度重懸於PBS中，取200 μ I細胞懸液(2Χ IO6細胞)於Balb/c裸鼠(4_5周)腋下皮下注射。飼養裸鼠4周，肉眼可見明顯瘤體，取瘤測量瘤體重量並拍照。[0141]上述細胞為A549 細胞(parental/par)、A549/pSilencer5.Ι-siRNA 細胞(HIP-55KD)、A549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55/WT)、A549/pSilencer5.1-Scramble細胞(Scr)。
[0142]結果如圖11所示，左圖為檢測HIP-55表達的Western blot圖，右圖為統計腫瘤
重量圖；
[0143]AA549/pLenti6/V5-HIP-55 細胞(HIP-55/WT)注射後，腫瘤重量為 1.418g ；
[0144]A549/pSilencer5.1-siRNA 細胞(HIP-55KD)注射後，腫瘤重量為 0.253g ；
[0145]A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(Scr)注射後，腫瘤重量為 0.92g ；
[0146]A549 細胞(parental/par)與 A549/pSilencer5.1-Scramble 細胞(Scr)結果無顯
著差異。
[0147]結果表明，在A549細胞中敲減HIP-55後裸鼠腫瘤重量明顯降低，而過表達HIP-55
後瘤體重量明顯升高。
[0148]六、HIP-55在肺癌患者組織樣本中高表達
[0149]為明確HIP-55在肺癌患者的表達情況，應用免疫組織化學方法檢測了正常肺(已經確診，且患者知情)組織與肺癌患者(已經確診，且患者知情)肺組織中HIP-55的表達。
[0150]結果如圖12所示，`上圖為免疫組化結果，下圖為統計圖；結果表明與正常肺組織相比肺癌患者肺組織中HIP-55極其明顯高表達(圖12下圖)。
[0151]同時，應用製備HIP-55抗體的多肽封閉肺癌組織樣本後免疫組織化學檢測HIP-55表達的方法明確所得陽性結果是否來自非特異性染色。結果表明，製備HIP-55抗體的多肽封閉肺癌組織樣本後能夠完全阻斷HIP — 55抗體對肺癌組織的染色，說明陽性染色是HIP — 55抗體特異性的(圖12上圖)。
【權利要求】
1.一種重組載體，為將編碼幹擾HIP-55蛋白表達SiRNA的DNA分子插入表達載體，得到重組載體；所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的重組載體，其特徵在於:所述編碼幹擾HIP-55蛋白表達siRNA的DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列5。
3.權利要求1或2所述的重組載體在製備具有如下I)-7)中至少一種功能的產品中的應用: 1)抑制細胞增殖； 2)促進細胞凋亡； 3)抑制腫瘤細胞遷移； 4)抑制腫瘤細胞侵襲； 5)抑制腫瘤細胞克隆形成； 6)抑制腫瘤形成； 7)預防和/或治療腫瘤。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於:所述產品為藥物。
5.根據權利要求3或4所述的應用，其特徵在於:所述腫瘤為肺癌； 所述腫瘤細胞為腫瘤細胞。
6.根據權利要求5所述的應用， 其特徵在於:所述腫瘤細胞為肺癌細胞；所述肺癌細胞具體為人非小細胞肺癌細胞。
7.HIP-55蛋白或其編碼基因或含有HIP-55蛋白編碼基因的重組載體在製備具有如下I)和/或2)功能的產品中的應用: 1)促進腫瘤細胞遷移； 2)促進腫瘤細胞侵襲； 所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於: 所述HIP-55蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特徵在於: 所述產品為藥物； 所述腫瘤為肺癌； 所述腫瘤細胞為腫瘤細胞；所述腫瘤細胞具體為肺癌細胞； 所述肺癌細胞尤其具體為人非小細胞肺癌細胞。
10.HIP-55蛋白在篩選、開發和/或設計預防和/或治療腫瘤產品中的應用；所述HIP-55蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列2。
【文檔編號】A61K48/00GK103773802SQ201410045873
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月8日 優先權日:2014年2月8日
【發明者】李子健, 付海安, 石智, 李增剛 申請人:北京大學第三醫院