高純度單體一葉萩鹼的分離純化方法與流程
2023-06-05 17:32:31
本發明屬於中藥提取技術領域，尤其涉及一種高純度單體一葉萩鹼的分離純化方法。
背景技術：
一葉萩，也稱葉底珠，為大戟科植物。一葉萩的葉及花具有祛風活血、補腎強筋之功效，主治面神經麻痺、小兒麻痺後遺症、眩暈、耳聾、神經衰弱、嗜睡症、陽痿等。該品種在我國資源十分豐富，其根、葉和嫩枝中均含有多種生物鹼，主要生物鹼有一葉萩鹼、二氫一葉萩鹼、別一葉萩鹼、右旋別一葉萩鹼、右旋一葉萩鹼、一葉萩亭寧、一葉萩醇鹼A、B、C等，其中以一葉萩鹼含量最高。
一葉萩鹼和它的衍生物具有興奮中樞神經、增強心肌收縮、升高血壓等作用，臨床用硝酸一葉萩鹼治療面神經麻痺、小兒麻痺骶神經炎和股外側神經炎感染引起的多發性神經炎，成為神經科疾患的常用藥物。
一葉萩鹼為叔胺鹼如式(I)所示(pKa7.2)，具有生物鹼的一般通性，因此現有一葉萩鹼的提取分離利用生物鹼鹽易溶於水、游離生物鹼易溶於有機溶劑的性質，將原料用酸水提取，提取液過強酸型的陽離子交換樹脂使生物鹼被樹脂吸附，然後，鹼化樹脂使生物鹼游離，石油醚提取，回收溶劑即可得到生物鹼。但此方法的提取效率較低。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供一種產率較高的高純度單體一葉萩鹼的分離純化方法。
本發明提供了一種高純度單體一葉萩鹼的分離純化方法，包括以下步驟：
S1)將一葉萩用醇提取，得到提取液；
S2)將所述提取液經反相聚合物色譜填料吸附後，洗脫，得到洗脫液；
S3)將所述洗脫液經矽膠柱層析色譜純化後，得到純化洗脫液；
S4)將所述純化洗脫液重結晶，得到一葉萩鹼。
優選的，所述提取的溫度為70℃～90℃；所述提取的時間為1～2h。
優選的，所述提取的次數為3～8次。
優選的，所述反相聚合物色譜填料為大孔樹脂填料或NM系列色譜填料。
優選的，所述步驟S2)具體為：
將所述提取液經反相聚合物色譜填料吸附後，依次用水、30％～50％的醇溶液洗滌，然後用70％～90％的乙醇洗脫，得到洗脫液。
優選的，所述步驟S3)具體為：
將洗脫液減壓濃縮後，用矽膠拌樣，得到過柱原料；
用有機溶劑與醇溶劑對過柱原料進行梯度洗脫，得到純化洗脫液；所述有機溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯。
優選的，所述矽膠的目數為60～80目。
優選的，所述梯度洗脫具體為：100％有機溶劑；待雜質基本除淨後，有機溶劑與醇溶劑的體積比為(40～60)：1，得到純化洗脫液；所述有機溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯。
優選的，所述步驟S4)具體為：
將所述純化洗脫液減壓濃縮後，用醇水溶液重結晶，得到一葉萩鹼。
優選的，所述醇水溶液中醇溶劑與水的體積比為(1：2)～(4：5)。
本發明提供了一種高純度單體一葉萩鹼的分離純化方法，包括以下步驟：S1)將一葉萩用醇提取，得到提取液；S2)將所述提取液經反相聚合物色譜填料吸附後，洗脫，得到洗脫液；S3)將所述洗脫液經矽膠柱層析色譜純化後，得到純化洗脫液；S4)將所述純化洗脫液重結晶，得到高純度單體一葉萩鹼。與現有技術相比，本發明工藝簡單，成本低，且可直接得到一葉萩鹼無需經鹼化處理，使產品收率與純度均較高。
附圖說明
圖1為原料一葉萩的HPLC譜圖；
圖2為本發明實施例1中得到的一葉萩鹼的HPLC譜圖；
圖3為本發明實施例2中得到的一葉萩鹼的HPLC譜圖；
圖4為本發明實施例3中得到的一葉萩鹼的HPLC譜圖；
圖5為本發明實施例4中得到的一葉萩鹼的HPLC譜圖。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
本發明提供了一種高純度單體一葉萩鹼的分離純化方法，包括以下步驟：
S1)將一葉萩用醇提取，得到提取液；
S2)將所述提取液經反相聚合物色譜填料吸附後，洗脫，得到洗脫液；
S3)將所述洗脫液經矽膠柱層析色譜純化後，得到純化洗脫液；
S4)將所述純化洗脫液重結晶，得到高純度單體一葉萩鹼。
按照本發明，優選先將一葉萩粉碎，然後再用醇提取，得到提取液；所述粉碎的程度優選為2～5mm的段；所述醇為本領域技術人員熟知的醇即可，並無特殊的限制，本發明中優選為乙醇和/或甲醇，更優選為體積分數為95％的乙醇和/或體積分數為95％的甲醇；所述一葉萩與醇的質量體積比優選為1g:(3～5)ml；所述提取的溫度優選為70℃～90℃，更優選為75℃～85℃，再優選為80℃；所述提取的時間優選為1～2h；為提高提取產率，優選提取3～8次，更優選提取4～6次，最優選提取5次，將各次的提取液合併。
在本發明中，優選先將提取液濃縮；所述濃縮的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，並無特殊的限制，本發明優選採用減壓濃縮；所述濃縮的溫度優選為50℃～70℃，更優選為55℃～65℃，再優選為60℃；所述濃縮優選至無醇溶劑為止。
濃縮後，用反向聚合物色譜填料吸附；所述反向聚合物色譜填料為本領域技術人員熟知的反向聚合物色譜填料即可，並無特殊的限制，本發明中優選為大孔樹脂填料或NM系列色譜填料；所述大孔樹脂為本領域技術人員熟 知的大孔樹脂即可，並無特殊的限制，本發明中優選為AB-8大孔樹脂或D-101大孔樹脂；所述NM系列色譜填料為本領域技術人員熟知的NM系列色譜填料即可，並無特殊的限制，本發明中優選為NM100-反向聚合物色譜填料。
吸附後，優選依次用水、30％～50％的醇溶液洗滌，然後用70％～90％的乙醇洗脫，得到洗脫液；所述醇溶液為本領域技術人員熟知的醇溶液即可，並無特殊的限制，本發明中優選為甲醇溶液和/或乙醇溶液。其中，在本發明中如無特殊說明百分數均為體積百分數，如30％～50％的醇溶液為醇體積分數為30％～50％的醇溶液。
將所述洗脫液用矽膠柱層析色譜純化，具體優選按照以下步驟進行：將洗脫液減壓濃縮後，用矽膠拌樣，得到過柱原料；用有機溶劑與醇溶劑對過柱原料進行梯度洗脫，得到純化洗脫液；所述有機溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯；所述醇溶劑為本領域技術人員熟知的醇溶劑即可，並無特殊的限制，本發明中優選為甲醇。。
在本發明中，優選將洗脫液減壓濃縮至浸膏，然後再用矽膠拌樣，得到過柱原料；所述減壓濃縮的溫度優選為50℃～70℃，更優選為55℃～65℃，再優選為60℃；所述矽膠的目數優選為60～80目；所述浸膏與矽膠的質量比優選為1：(2～4)。
用有機溶劑與醇溶劑對過柱原料進行梯度洗脫；所述梯度洗脫的程序優選具體為：100％有機溶劑；待雜質基本除淨後，有機溶劑與醇溶劑的體積比為(40～60)：1，優選為(45～55)：1，再優選為50：1，得到純化洗脫液；所述有機溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯。得到洗脫液後，優選繼續進行洗脫，有機溶劑與醇溶劑的體積比為30：1，本段含有少量產品後段，最後有機溶劑與醇溶劑的比例為10：1洗脫，至色帶全部洗完，把柱內試劑全部壓幹，洗脫完成。
將所述純化洗脫液結晶；所述結晶的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，並無特殊限制，本發明優選將所述純化洗脫液減壓濃縮後，用醇水溶液重結晶，得到一葉萩鹼；所述減壓濃縮的溫度優選為50℃～70℃，更優選為55℃～65℃，再優選為60℃；所述減壓濃縮優選至無有機溶劑；所述醇水溶液中醇溶劑與水的體積比優選為(1：2)～(4：5)；所述醇溶劑為本領域技術人員熟知的醇溶劑即可，並無特殊的限制，本發明中優選為乙醇。
本發明優選採用高效液相色譜(HPLC)對得到的一葉萩鹼進行質量檢測；所述高效液相色譜的色譜柱優選為C18色譜柱；所述高效液相色譜的流動相優選為乙腈與乙酸銨水溶液；所述乙腈與乙酸銨水溶液的體積比優選為30：70；所述乙酸銨的濃度優選為0.04mol/L；所述高效液相色譜的檢測波長優選為256nm。
本發明工藝簡單，成本低，且可直接得到一葉萩鹼無需經鹼化處理，使產品收率與純度均較高。
為了進一步說明本發明，以下結合實施例對本發明提供的一種一葉萩鹼的分離純化方法進行詳細描述。
以下實施例中所用的試劑均為市售。
實施例1
1.1提取:
一葉萩藥材粉碎成4mm的段，先用95％乙醇(一葉萩與95％乙醇的質量體積比為1g：4ml)回流提取，提取溫度80℃，提取5次，合併提取液，每次提取1h。
提取液濃縮：把提取液於60℃，減壓濃縮，濃縮至無醇，收集濃縮液，備用。
1.2富集：
採用反相聚合填料AB-8大孔樹脂。
過程：
處理好的濃縮液，上聚合填料進行吸附，過柱液棄去，吸附完成後，先用水洗，然後用50％濃度乙醇進行洗滌，然後用80％乙醇洗脫，收集洗脫液。
1.3純化：
純化方法：矽膠柱層析色譜
純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用矽膠(60～80目)拌樣，兩者質量比為1：3，成黃色的分散顆粒，作為過柱原料。
過柱體系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，先用100％二氯甲烷洗脫，除去原料中小極性雜質，TLC跟蹤在線檢測，洗脫至產品前沿雜質基本去除乾淨後，二氯甲烷與甲醇的體積比為50：1洗脫，根據洗脫的色帶進行收集，TLC跟蹤檢測，收集產品段，得到純化洗脫液；然後用二氯甲烷與甲醇的體積比為 30：1洗脫，本段還有少量產品後段；最後用二氯甲烷與甲醇的比例為10：1的洗脫液洗脫，至色帶全部洗完，把柱內試劑全部壓幹，洗脫完成。
1.4結晶、乾燥
收集到的產品段60℃減壓濃縮，濃縮至無有機溶劑，所得固體用乙醇水(體積比為1:2)重結晶，最後收得一葉萩鹼的純品，產品純度達99％以上
質控檢測方法：
HPLC條件：C18柱；流動相條件：乙腈-0.04mol/L乙酸銨(30:70)；檢測波長：256nm。
圖1為原料一葉萩的HPLC色譜圖，其結果見表1。
圖2為實施例1中得到的一葉萩鹼的HPLC色譜圖，結果見表2；產品純度為99.61％，產品收率為82％。
表1一葉萩的HPLC檢測結果
說明：13.2min出峰為一葉萩鹼的信號峰。
表2一葉萩鹼的HPLC檢測結果
實施例2
2.1提取:
一葉萩藥材粉碎成2mm的段，先用95％乙醇(一葉萩與95％乙醇的質量體積比為1g：5ml)回流提取，提取溫度80℃，提取5次，合併提取液，每次提取1h。
提取液濃縮：把提取液於60℃，減壓濃縮，濃縮至無醇，收集濃縮液，備用。
2.2富集：
採用反相聚合填料AB-8大孔樹脂。
過程：
處理好的濃縮液，上聚合填料進行吸附，過柱液棄去，吸附完成後，先用水洗，然後用50％濃度的醇進行洗滌，然後用90％乙醇洗脫，收集洗脫液。
2.3純化：
純化方法：矽膠柱層析色譜
純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用矽膠(60～80目)拌樣，兩者質量比為1：4，成黃色的分散顆粒，作為過柱原料。
過柱體系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，先用100％二氯甲烷洗脫，除去原料中小極性雜質，TLC跟蹤在線檢測，洗脫至產品前沿雜質基本去除乾淨後，二氯甲烷與甲醇的體積比為50：1洗脫，根據洗脫的色帶進行收集，TLC跟蹤檢測，收集產品段，得到純化洗脫液；然後用二氯甲烷與甲醇的體積比為30：1洗脫，本段還有少量產品後段；最後用二氯甲烷與甲醇的比例為10：1的洗脫液洗脫，至色帶全部洗完，把柱內試劑全部壓幹，洗脫完成。
2.4結晶、乾燥
收集到的產品段60℃減壓濃縮，濃縮至無有機溶劑，所得固體用乙醇水(體積比4:5)重結晶，最後收得一葉萩鹼的純品，產品純度達99％以上
質控檢測方法：
HPLC條件：C18柱；流動相條件：乙腈-0.04mol/L乙酸銨(30:70)；檢測波長：256nm。
圖3為實施例2中得到的一葉萩鹼的HPLC色譜圖，結果見表3；產品純度為99.98％，產品收率為83％。
表3一葉萩鹼的HPLC檢測結果
實施例3
3.1提取:
一葉萩藥材粉碎成5mm的段，先用95％甲醇溶液(一葉萩與95％乙醇的質量體積比為1g：3ml)回流提取，提取溫度80℃，提取5次，合併提取液，每次提取1h。
提取液濃縮：把提取液於60℃，減壓濃縮，濃縮至無醇，收集濃縮液，備用。
3.2富集：
採用反相聚合填料NM100-反向聚合物色譜填料。
過程：
處理好的濃縮液，上聚合填料進行吸附，過柱液棄去，吸附完成後，先用水洗，然後用40％濃度的醇進行洗滌，然後用70％乙醇洗脫，收集洗脫液。
3.3純化：
純化方法：矽膠柱層析色譜
純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用矽膠(60～80目)拌樣，兩者質量比為1：2，成黃色的分散顆粒，作為過柱原料。
過柱體系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，先用100％二氯甲烷洗脫，除去原料中小極性雜質，TLC跟蹤在線檢測，洗脫至產品前沿雜質基本去除乾淨後，二氯甲烷與甲醇的體積比為50：1洗脫，根據洗脫的色帶進行收集，TLC跟蹤檢測，收集產品段，得到純化洗脫液；然後用二氯甲烷與甲醇的體積比為30：1洗脫，本段還有少量產品後段；最後用二氯甲烷與甲醇的比例為10：1的洗脫液洗脫，至色帶全部洗完，把柱內試劑全部壓幹，洗脫完成。
3.4結晶、乾燥
收集到的產品段60℃減壓濃縮，濃縮至無有機溶劑，所得固體用乙醇水(體積比3:5)重結晶，最後收得一葉萩鹼的純品，產品純度達99％以上
質控檢測方法：
HPLC條件：C18柱；流動相條件：乙腈-0.04mol/L乙酸銨(30:70)；檢測波長：256nm。
圖4為實施例3中得到的一葉萩鹼的HPLC色譜圖，結果見表4；產品純度為99.63％，產品收率為85％。
表4一葉萩鹼的HPLC檢測結果
實施例4
4.1提取:
一葉萩藥材粉碎成4mm的段，先用95％甲醇溶液(一葉萩與95％甲醇的質量體積比為1g：3ml)回流提取，提取溫度80℃，提取5次，合併提取液，每次提取1h。
提取液濃縮：把提取液於60℃，減壓濃縮，濃縮至無醇，收集濃縮液，備用。
4.2富集：
採用反相聚合填料D-101大孔樹脂。
過程：
處理好的濃縮液，上聚合填料進行吸附，過柱液棄去，吸附完成後，先用水洗，然後用30％濃度的醇進行洗滌，然後用70％乙醇洗脫，收集洗脫液。
4.3純化：
純化方法：矽膠柱層析色譜
純化原料：洗脫液60℃減壓濃縮至浸膏，用矽膠(60～80目)拌樣，兩者質量比為1：2，成黃色的分散顆粒，作為過柱原料。
過柱體系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，先用100％二氯甲烷洗脫，除去原料中小極性雜質，TLC跟蹤在線檢測，洗脫至產品前沿雜質基本去除乾淨後，二氯甲烷與甲醇的體積比為50：1洗脫，根據洗脫的色帶進行收集，TLC跟蹤檢測，收集產品段，得到純化洗脫液；然後用二氯甲烷與甲醇的體積比為30：1洗脫，本段還有少量產品後段；最後用二氯甲烷與甲醇的比例為10：1的洗脫液洗脫，至色帶全部洗完，把柱內試劑全部壓幹，洗脫完成。
4.4結晶、乾燥
收集到的產品段60℃減壓濃縮，濃縮至無有機溶劑，所得固體用乙醇水(體積比4:5)重結晶，最後收得一葉萩鹼的純品，產品純度達99％以上
質控檢測方法：
HPLC條件：C18柱；流動相條件：乙腈-0.04mol/L乙酸銨(30:70)；檢測波長：256nm。
圖5為實施例4中得到的一葉萩鹼的HPLC色譜圖，結果見表5；產品純度為99.68％，產品收率為80％。
表5一葉萩鹼的HPLC檢測結果