植物低鉀敏感型相關的蛋白AtLKR1及其編碼基因與應用的製作方法

2023-06-19 00:22:26 1

專利名稱：植物低鉀敏感型相關的蛋白AtLKR1及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物低鉀敏感型相關的蛋白AtLKRl及其編碼基因與應用。
背景技術：
鉀是植物細胞中最豐富的陽離子之一，也是植物生長所必需的三大營養元素之一，在植物整個生命活動中都起著重要作用。它不僅參與植物的許多生理、生化代謝過程， 還通過調控光合作用、呼吸作用和許多酶系統的功能而對植物的生長發育、產量形成等產生重要影響。在我國限制農作物生產發展的重要因素之一就是我國大部分耕地土壤缺鉀且鉀肥資源極其匱乏。儘管提高鉀肥施用量可以大幅度地提高作物產量，但大量進口鉀肥無論從經濟上還是從長遠的戰略意義上考慮，都有一定的局限性。因此，了解和認識植物對低鉀脅迫的反應機制，進而提高農作物的耐低鉀能力，已成為如何進一步提高農作物產量的重要研究工作。擬南芥(Arabidopsis thaliana)是一種典型的雙子葉模式植物，具有個體小、生長周期短、遺傳背景簡單清楚、易被誘變等特點，其作用與動物實驗中的實驗鼠、果蠅、線蟲等相當，已被廣泛用於植物遺傳學、發育生物學和分子生物學的研究。擬南芥共有約1. 3億個鹼基對，2. 9萬個基因。目前大部分基因的功能還不清楚，利用突變技術研究基因功能已成為一種有效方法，而且目前已得到大量的T-DNA插入突變體。通過對突變體的研究，可以較為方便地獲得一些有重要應用價值的植物功能基因。擬南芥的大多數基因在其他植物中都能找到與之同源的序列，有關擬南芥的絕大多數發現也都能應用於其他植物研究。以往的研究已經證明，對擬南芥的研究將幫助科學家找到提高農作物產量的方法。面對土壤缺鉀的問題，克隆植物低鉀敏感基因能夠作為土壤缺鉀的一個指標，即時反映土壤中鉀的狀態；同時可通過抑制低鉀敏感基因的表達來培育作物耐低鉀新品種，這對作物改良及新品種的培育具有重要的實踐意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物低鉀敏感型相關蛋白AtLKRl及其編碼基因與應用。本發明所提供的植物低鉀敏感型相關蛋白，名稱為AtLKRl，來源於擬南芥 (Arabidopsis thaliana) Col-Ο生態型，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；幻將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低鉀敏感型相關的由1)衍生的蛋白質。為了使1)中的AtLKRl分泌到細胞周質或培養基中或使其功能穩定，可在由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質的N端連接上信號肽序列；為了使1)中的 AtLKRl便於純化，可在由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1.標籤的序列
標籤殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述幻中的AtLKRl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述2)中的AtLKRl的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/ 或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。上述植物低鉀敏感性相關蛋白的編碼基因(命名為AtLKRl)也屬於本發明的保護範圍。上述植物低鉀敏感性相關蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中的序列1 ；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。序列表中序列1的核苷酸序列由1344個鹼基組成，其編碼序列為自序列表中序列 1的第1-1344位核苷酸，編碼具有序列表中序列2所示的蛋白(AtLKRl)。上述嚴格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交並洗膜。擴增上述AtLKRl基因全長或其任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。含有上述植物低鉀敏感型相關蛋白的編碼基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬於本發明的保護範圍。可用現有的植物表達載體構建含有AtLKRl基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等，如pBIB、pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達載體。使用AtLKRl基因構建重組表達載體時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛素 (Ubiquitin)基因啟動子(pm3i)、Super啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組載體具體為在pCAMBIA1300 =Super的多克隆位點間插入上述基因得到的重組表達載體；所述pCAMBIA1300 =Super是將序列表中序列4的自5』端第113-1112位所示的Super啟動子插入pCAMBIA1300的HindIII和)(bal酶切位點間得到的載體。本發明的另一個目的是提供一種培育低鉀敏感型的轉基因植物的方法。本發明提供的培育低鉀敏感型的轉基因植物的方法，是將上述的編碼基因 (AtLKRl基因)轉入目的植物中，得到低鉀敏感性強於所述目的植物的轉基因植物。攜帶有本發明的AtLKRl基因的植物表達載體可通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化到植物細胞或組織中。具體地，上述的編碼基因通過上述的重組表達載體導入所述目的植物中的。上述目的植物可以是雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥。本發明的另一目的在於提供培育耐低鉀脅迫的轉基因植物的方法。本發明提供的培育耐低鉀脅迫的轉基因植物的方法是將所述的基因(AtLKRl)在目的植物體內敲除或抑制目的植物體內基因(AtLKRl)的表達後，得到的耐低鉀脅迫性高於所述目的植物的轉基因植物。上述目的植物可以為雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥。實驗證明將本發明的基因AtLKRl在目的植物中過表達後，植物就表現低鉀敏感性狀，可作為土壤鉀指標的指示植物，預警土壤的低鉀；反之，將本發明所提供的AtLKRl基因敲除掉或使AtLKRl基因表達量降低，植物就表現耐低鉀性狀。本發明的基因對培育耐低鉀新品種，以及植物對低鉀耐受的研究具有重要意義，如利用本發明的基因可設計小幹擾 RNA對該基因的表達進行幹擾、插入突變該基因或者缺失突變該基因，從而提高植物對低鉀的耐受能力。


圖1是AtLKRlT-DNA插入突變體插入示意圖及基因敲除鑑定，(A) AtLKRl基因結構圖實心盒為外顯子，線條為內含子，數字為核苷酸，1為轉錄起始點，突變體中的T-DNA插入位置已用箭頭指出；(B)Northern blots鑑定突變體lkrl_a、lkrl_b中AtLKRl的表達情況。圖2是Ikrl突變體表型檢測，是Col、lkrl-a、lkrl_b在MS培養基和LKLN培養基上生長10天後的表型比較。圖3是Col、lkrl-a和Ikrl_b突變體在不同鉀濃度條件下表型檢測。圖4是AtLKRl恢復突變材料表達量鑑定及低鉀條件下表型檢測，(A) Col、lkrl-a突變體、AtLKRl恢復突變材料(com-1和com_4)在MS培養基和LKLN培養基上生長12天後的表型比較；(B)RT-PCR鑑定AtLKRl恢復突變材料。圖5是AtLKRl過表達材料鑑定及低鉀條件下表型檢測，㈧Col、lkrl-a突變體、 AtLKRl過表達材料(0E-5和0E-9)在MS培養基和LKLN培養基上生長10天後的表型比較； (B) Northern blots 鑑定 AtLKRl 過表達材料。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、與植物鉀營養相關的蛋白及其編碼基因的獲得提取7天擬南芥(Columbia型又稱Col-O生態型)(購自美國擬南芥生物資源中 (Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)) IejW^ RNA>M Takara ^
DNA酶消化RNA中的DNA，用消化後產物進行反轉錄得到cDNA。以此cDNA為模板、利用分別設有)(ba I/EcoR I和Mc I/Sal I酶切位點的一對引物進行PCR擴增，得到與鉀營養相關基因的⑶S全長。引物序列如下Primerl 5' -AAtctagagaattcATGAGTGGAAGCAGAAGGAAGGC-3『 (Xba I/EcoR I)Primer2 5' -GAgagctcgtcgacTTATTGCTTTTGTTCTTCAGCGG-3『 (Sac I/Sal I)採用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶進行擴增，擴增體系為50 μ L， 含 IOXPyrobest PCR 緩衝液 5. O μ L，IOmM dNTP mix 1. O μ L，引物各 1. O μ L，Pyrobest 酶 0. 5 μ L，模板3. O μ L (0. 1 μ g)，補充滅菌超純水至50 μ L，反應體系在冰上進行操作。在PE 9700儀器上進行擴增，預變性5min，95°C變性30s, 60 °C 30s, 72 °C 1. 5min,循環數30個， 72°C延伸 IOmin0將擴增片段用0. 8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收擴增片段，連接到pMDlS-Τ載體，酶切、擴增、測序鑑定，測序結果表明，上述PCR擴增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，為本發明的調控植物響應低鉀脅迫CDS基因命名為AtLKRl，序列表中序列1的核苷酸序列由1344個鹼基組成，其編碼序列為自序列表中序列1的第1-1344位核苷酸，編碼具有序列表中序列2所示的蛋白(AtLKRl)。將上述獲得的正確的含有AtLKRl的重組載體命名為 pMD18-AtLKRl。實施例2、與植物鉀營養相關的蛋白及其編碼基因的功能驗證一、突變體的鑑定從ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)購得到編號為 SALK 058629 (lkrl-a)和SALK_014699 (lkrl_b)的T-DNA插入突變體。其各自DNA水平的鑑定引物為SALK_058629LP 5-TGCCAAGTGAAAAATATAATGGCA-3,RP 5-CGTCACAAAATGGTCGAACAGG-3SALK_014699LP 5-TTCAAACCGAGTTTGAGGATG-3RP 5-TATCCATGAACGCTTTCGAAC-3為了進一步確定其轉錄水平上是否敲除，我們將擬南芥野生型(Columbia型)和突變體Ikrl材料(lkrl-a和lkrl_b)布在MS培養基上生長一周，取樣(約IOOmg)提取RNA。正常MS培養基組成為每升溶液含1650mg NH4NO3,1900mg KNO3, 370mgMgS04 · 7H20，170mg KH2PO4, 440mg CaCl2 『 2H30,22. 3mg MnSO4 · 4H20，0. 83mg KI, 0. 025mg CuSO4 · 5H20,6. 25mg H3BO5,0. 025mg CoCl · 6H20,8. 65mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mg Na2MoO4 · 2H20, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, 37. 3mg Na2EDTA。擬南芥種子在 MS 上培養條件採用全日照光照培養，溫度220C，光強100 μ mol/(m2*s)。RNA提取方法按hvitrogen Trizol Reagent的產品說明書進行。經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。用紫外分光光度計和電泳方法相結合作精確定量。然後進行如下操作(1)配製1. 2% (w/v)瓊脂糖的甲醛變性凝膠:1. 2g瓊脂糖，IOml 10XMOPS緩衝液，75ml DEPC-H2O,加熱融化後冷至50-60°C時加入15ml甲醛；混勻後灌膠；凝膠室溫放置約1小時後放入1XM0PS電泳緩衝液中，上樣前預電泳30分鐘(60V)； (2) RNA 樣品處理10-30 μ g 總 RNA,加 2 倍體積(ν/ν)的 RNA loading buffer,混勻後65°C加熱5-10分鐘，置於冰上3-5分鐘；(3)電泳在1 XMOPS電泳緩衝液中進行電泳分離；電壓lOV/cm，電泳至溴酚籃距邊緣約2cm處停止，約需2小時；(4)凝膠掃描及浸泡紫外燈下掃膠，然後切去多餘的邊緣膠條；用250ml 10 X SSC浸泡凝膠兩次以洗去甲醛，每次20分鐘，浸泡完畢可直接轉膜。(5)轉膜在磁碟中加入10XSSC溶液250mL，架一塊玻璃板，在上方放一層寬於凝膠的濾紙，兩頭浸入液體中，濾紙與玻板間不能有氣泡，將凝膠倒扣於濾紙上排盡氣泡，用 parafilm封好膠塊四周；剪取與膠大小一致的尼龍膜，在10XSSC中潤溼，鋪於膠上，再依次加3張濾紙、數層吸水紙，其上壓一塊玻璃板及重物；以10 X SSC為轉移液，利用毛細管轉移法轉膜1 2天。轉膜完畢後，在膜上標記加樣孔位置，用2XSSC漂洗尼龍膜，取出用濾紙吸乾或
晾乾；將尼龍膜包在濾紙中於80°C烘1 池以使DNA與雜交膜緊密結合，之後用於分子雜 、-父。(6)探針純化及標記PCR擴增目的基因的特異性片斷(500bp左右)，經純化試劑
盒純化後，定量備用。LKRl probe (495bp)引物F :5，-AAATGGAAGAAACCGCAAAGC-3，R5' -TTTCAAACCGAGTTTGAGGA-3』探針標記按 Amersham Biosciences 的 Rediprime II Random Prime LabelIingSystem試劑盒說明進行。在PCR反應管中加入25ng純化的目的片段，加pH 8. 0的TE buffer至45 μ 1，95°C變性5min，迅速放於冰上冷卻；將變性後的cDNA加入到 Amersham公司的探針標記反應管中，到同位素室加入40 50 μ Ci32P-dCTP反覆吹吸12次， 37°C水浴反應2h以上。(7)預雜交與雜交將雜交膜放入雜交管中，帶有RNA的一面向裡，加入7 15mL 預熱到65°C的Church緩衝液，65°C預雜交4 5h ；將標記好的探針沸水中變性15min，冰上迅速冷卻5min ；棄去管中Church，重新加入7-8mL Church，加入變性好的探針，65°C雜交16h以上。
(8)洗膜；雜交結束後，分別用 2XSSC+0. 5% (w/v) SDS，1 X SSC+0. 5% (w/v) SDS, 0.5XSSC+0.5% (w/v) SDS在65°C下洗膜(可據實際情況確定洗膜的次數)，每次15min，並不斷用monitor檢測信號。(9)放射自顯影洗膜完畢後，用保鮮膜包好，放入暗盒，壓磷屏，1-2天後掃磷板。如要更換探針雜交，之前先用0. 1-0.5% (w/v) SDS煮膜15min，2 X SSC漂洗IOmin再進行後面的雜交。經Northern雜交分析，結果如圖1所示，AtLKRl的突變體lkrl_a和lkrl_b在轉錄水平上均被敲除。二、突變體的表型檢測1、突變體在LKLN (低鉀低銨)培養基上的表型觀察IL 的 LKLN 培養基的配置方法370mg MgSO4 · 7H20，144mg NH4H2PO4, 706mgCa(NO3)2 · 4H20 ；22. 3mg MnSO4 · 4H20，0. 83mg KI,0. 025mg CuSO4 · 5H20，6. 25mgH3B05, 0. 025mg CoCl ·6Η20，8· 65mg ZnSO4 ·7Η20，0· 25mg Na2MoO4 ·2Η20，27· 8mgFeS04 ·7Η20，37· 3mg Na2EDTA,用電阻大於16ΜΩ的雙蒸水定容至1L。pH為5. 70-5. 75，LKLN培養基中鉀濃度 70-100 μ mol/L，相當於7. 077-10. Ilmg的KNO3，該鉀來源於廣東汕頭瓊脂粉中的鉀。萌發條件表型篩選將春化好的種子播於正常MS和LKLN培養基上，生長大約10 天左右，擬南芥種子培養條件採用全日照光照培養，溫度22°C，光強100 μ mol/(m2*s)。結果如圖2所示，由於受到低鉀脅迫野生型出冠部開始表現發黃的缺鉀症狀，而兩個突變體株系lkrl-a和lkrl_b冠部仍保能保持綠色，說明AtLKRl參與了低鉀通路，是低鉀敏感基因。2、不同鉀濃度條件下表型檢測設置如下的培養基在LKLN基礎上添加不同濃度的ΚΝ03(分別是100uM，200uM， 2000uM)，其餘成分不變。將lkrl-a、lkrl-b和野生型擬南芥種子播在上述的不同鉀濃度的培養基中培養， 培養條件是日照光照培養，溫度22°C，光強100 μ mol/(m2*s)。結果如圖3所示，從左往右圖中添加的KNO3依次是10. llmg、20. 22mg、202. 2mg,隨著鉀濃度的升高，突變體和野生型之間的差異就逐漸消失了，說明了該基因主要是在低鉀條件下起作用，所觀察到的表型是依賴於鉀濃度的。三、恢復突變體的表型檢測1、恢復突變體的構建提取10天擬南芥(Columbia型)幼苗的總DNA，以此DNA為模板、利用一對引物進行PCR擴增，得到相關基因的ftOmoter序列。引物序列如下Primerl 5' -ATaagcttTACTAAAACGGCAAATACTAAAC-3『 (HindIII)Primer2 5' -ACggatccTTTCTTTTTCCGATTAAGAAA-3『 (BamHI)採用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶進行擴增，擴增體系為50 μ L， 含 IOXPyrobest PCR 緩衝液 5. 0 μ L，IOmM dNTP mix 1. 0 μ L，引物各 1. 0 μ L，Pyrobest 酶 0. 5 μ L，模板3. 0 μ L (0. 1 μ g)，補充滅菌超純水至50 μ L，反應體系在冰上進行操作。在PE 9700儀器上進行擴增，預變性5min，95°C變性30s, 56°C 30s, 72°C 2min，循環數30個，72°C 延伸lOmin。
對PCR產物進行測序，得到1749bp的核苷酸片段我們將其命名為proAtLKRl。將為proAtLKRl連接到pMD18_T載體得到的重組載體命名為pMD18_proAtLKRl。
將以上所獲得的含有AtLKRl基因的重組載體pMD18-proAtLKRl和載體 PCAMBIA1300,同時用內切酶HindIII和BamH I進行大體系酶切。將所切得的proAtLKRl 基因片段和線性化的PCAMBIA1300質粒片段進行回收，連接，並酶切驗證，即獲得驗證正確的含有PAtLKRl基因的重組載體並將其命名為proAtLKRl-pCAMBIA1300。將實施1獲得的含有AtLKRl基因CDS序列的重組載體pMD18_AtLKRl和上述獲得的重組載體proAtLKRl-pCAMBIA1300同時用內切酶BamH I和Me I進行大體系酶切。將所切得的AtLKRl基因CDS片段和線性化的proAtLKRl-pCAMBIA1300質粒片段進行回收，連接，並酶切驗證，即獲得驗證正確的含有AtLKRl基因Promoter和⑶S的重組載體並將其命名為 AtLKRl-pCAMBIA1300。將AtLKRl_pCAMBIA1300利用農桿菌轉化侵染突變體植株lkrl_a，從而獲得AtLKRl恢復突變材料Tl代。經過在含50 μ g/L潮黴素的MS培養基上篩選轉AtLKRl-pCAMBIA1300擬南芥陽性植株並進行分離比統計，在T3代即得到轉AtLKRl-pCAMBIA1300擬南芥單拷貝純合株系，即AtLKRl恢復突變株系 AtLKRl-pCAMBIA1300-l 和 AtLKRl_pCAMBIA1300_4，簡寫為 com-Ι 和 com_4。2、擬南芥野生型(Columbia型)、恢復突變材料種子(com_l，com_4)和lkrl_a突變體的分子檢測以及表型觀察將擬南芥野生型(Columbia型)、恢復突變材料種子(com_l，com_4)和Ikrl_a突變體分別布在MS培養基上生長一周，取樣(約IOOmg)提取RNA。按照SUPERSCRIPT的使用說明，合成cDNA。設計引物進行定量PCR擴增檢測轉錄水平上是否將AtLKRl的表達水平恢復到野生型狀態。所用引物是Primerl 5' -catat gATGAGTGGAAGCAGAAGGAAGGC-3，，Primet2 :5， -ctcgag TTATTGCTTTTGTTCTTCAGCGG-3，基因的擴增條件如下將合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應的模板 20L 體系，內含 10XPCR Buffer 2L,2. 5mM dNTP mix 0. 4L, 10M Primerl 禾口 Primer2 各 OUaq enzyme (15U/uL)0. 1L。在 PE9700 上擴增95°C預變性 5min，95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 3minl0s，共計30個循環；72°C延伸lOmin，將獲得的PCR產物(3092bp)，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。EF基因為內標基因，作為對照，其引物是EF-F 5』 -ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3』EF-R 5』 -TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3』。其擴增方法為將上述合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應的模板 20L 體系，內含 10XPCR Buffer 2L, IOmM dNTP mix 0. 4L, 10M EF-F 禾口 EF-R 各 0. 4uL, Taq enzyme (15U/uL)0. luL。在 PE9700 上擴增:95°C預變性 5min，95°C 30s，56°C 30s，72°C lmin, 共計20個循環；72°C延伸lOmin，將獲得的PCR產物(6^bp)，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果表明如圖4B，在com-1、com-4和Col中都能檢測到AtLKRl的表達，而在lkrl-a突變體中沒有檢測到該基因的表達，且com-1、com-4中AtLKRl的表達量和Col中 AtLKRl的表達量基本相同。將經檢測過的材料種子(Col，com-1，com-4，lkrl-a)低溫處理3天後播於正常MS 和LKLN培養基上，生長大約10天左右，如圖4A，可以看出com-1和com_4將lkrl-a突變體冠部耐低鉀的表型恢復了，和野生型沒有明顯區別，說明lkrl-a突變體冠部較野生型耐低鉀的表型確實由於AtLKRl的缺失所以起的。四、AtLKRl 過量表達植株(Super :AtLKRl_9 和 Super :AtLKRl_5)的獲得1、中間載體 pCAMBIA1300 =Super 的構建利用弓丨物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT 和 tctagaCTAGAGTCGATTTGGT 從質粒pMSP-1 (GenBank號為EU181145)中擴增出核苷酸序列如序列表中序列4的自5 』端第113-1112位所示的Super啟動子的Super啟動子序列；將擴增得到的Super啟動子用 HindIII和XbaI雙酶切，回收Super啟動子片段，插入到質粒pCAMBIAl300 (GenBank號為 FJ362601)的HindIII和XbaI酶切位點之間中，得到pCAMBIA1300 =Super質粒。2、Super =AtLKRl 的構建將實施例1獲得的含有AtLKRl基因的重組載體pMD18-AtLKRl和上述步驟1獲得的中間載體pCAMBIA1300 =Super,同時用內切酶)(bal和Me I進行大體系酶切。將所切得的AtLKRl基因片段和線性化的pCAMBIA1300 =Super質粒片段進行回收，連接，並酶切驗證， 即獲得驗證正確的含有AtLKRl基因的重組載體並將其命名為Super :AtLKRl。將Super =AtLKRl利用農桿菌轉化侵染Columbia野生型擬南芥植株。從而獲得 AtLKRl過量表達Tl代轉Super =AtLKRl擬南芥植株。經過在含50 μ g/L潮黴素的MS培養基上篩選轉Super =AtLKRl擬南芥陽性植株並進行分離比統計，在T3代即得到轉Super AtLKRl擬南芥單拷貝純合株系，即AtLKRl過量表達株系Super :AtLKRl_5和Super AtLKRl-9，簡寫為0E-5和0E-9表示。將野生型擬南芥(Columbia型)、AtLKRl過量表達植株(Super =AtLKRl擬南芥單拷貝純合株系，名稱為Super :AtLKRl-5和Super :AtLKRl_9，即0E_5和0E_9)種子在MS培養基萌發生長，培養條件採用全日照光照培養，溫度22°C，光強100 μ mol/(m2*s)。取生長7 天的上述材料約IOOmg提取RNA。RNA提取方法及檢測、Northern雜交方法和所用目的基因探針引物同實施二。經Northern雜交分析，0E-5和0E-9中基因的表達水平明顯高於野生型，如圖5B 所示。五、過表達株系、突變體、野生型、在低鉀條件下的表型觀察將野生型(Columbia型)、lkrl_a突變體種子和經過檢測的AtLKRl過表達植株 0E-5和0E-9的種子低溫處理3天後播於正常MS和LKLN培養基上，生長大約10天左右觀察性狀。表型分析結果表明如圖5A，過表達材料冠部較野生型敏感，表現為冠部發白，而突變體冠部則表現出較野生型耐低鉀的表型。
權利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低鉀敏感型相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述蛋白的編碼基因為如下1)-3) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中的序列1；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體的構建方法是將權利要求2-4中任一所述的基因插入pCAMBIA1300 =Super載體的)(bal和KpnI酶切位點之間構成的重組表達載體；所述PCAMBIA1300 =Super載體的是將核苷酸序列如序列表中序列4的自5』端第 113-1112位所示的Super啟動子插入pCAMBIA1300質粒的HindIII和)(bal酶切位點之間構成的載體。
6.一種培育低鉀敏感型的轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因轉入目的植物中，得到低鉀敏感性強於所述目的植物的轉基因植物。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於權利要求2或3所述的編碼基因是通過權利要求4或5所述的重組表達載體導入所述目的植物中。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述目的植物優選為擬南芥。
9.一種培育耐低鉀脅迫的轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的基因在目的植物體內敲除或抑制目的植物體內權利要求2或3所述的基因的表達後，得到的耐低鉀脅迫性高於所述目的植物的轉基因植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述植物為雙子葉植物或單子葉植物， 優選為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種植物低鉀敏感型相關蛋白AtLKR1及其編碼基因與應用。所述蛋白是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物低鉀敏感型相關的由1)衍生的蛋白質。將本發明的基因AtLKR1在目的植物中過表達後，植物就表現低鉀敏感性狀，可作為土壤鉀指標的指示植物，預警土壤的低鉀；反之，將本發明所提供的AtLKR1基因敲除掉或使AtLKR1基因表達量降低，植物就表現耐低鉀性狀。本發明的基因對培育耐低鉀新品種，以及植物對低鉀耐受的研究具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK102234325SQ20101016441
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月29日 優先權日2010年4月29日
發明者任慧敏, 劉麗麗, 武維華 申請人:中國農業大學