一種檢測糖皮質激素治療sle療效的試劑盒的製作方法

2023-06-04 06:16:31 2

一種檢測糖皮質激素治療sle療效的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒，包括：檢測GR基因序列的引物；PCR擴增酶，純化PCR產物的純化酶及相應緩衝液；dNTP；單鹼基延伸反應酶及相應的緩衝液。GR基因分型結果中rs10482672多態性位點為T（CT+TT）的患者療效差，rs4912905多態性位點為C（GC+CC）的患者療效好，rs17100234多態性位點為A（CA+AA）的患者療好，rs7701443多態性位點為A（AA）的患者療效差。本發明提供了一種基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒和方法，為實現SLE患者的個體化治療提供新的思路和方法。
【專利說明】一種檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒，具體涉及一種基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒和方法，屬於醫藥衛生【技術領域】。
[0002]
【背景技術】
[0003]系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種常見的自身免疫性疾病，世界範圍內SLE的發病率約為50/10萬，我國約為70/10萬。該病多見於女性，男女發病率比約為1:9。近年來，SLE發病率和患病率不斷升高，對青中年女性的身心健康造成了很大危害，已經成為一個重要的公共衛生問題。SLE的藥物治療主要以糖皮質激素(glucocorticoids,GC)為主。GC具有強大的抗炎和免疫抑制作用，其主要作用機制是基因調控途徑，即與細胞眾內的糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GR)相結合,形成GC-GR複合物，轉移入細胞核內，通過基因調控機制發揮作用。可見，GR是GC發揮生理和藥理作用的重要環節。
[0004]制定個體化治療方案是SLE治療的基本原則。臨床實踐表明GC的臨床療效存在極大的個體化差異，有相當一部分患者病情不能迅速得到緩解。同時，GC的應用結果像一把雙刃劍，在取得療效的同時也會導致許多不良反應，有的不良反應甚至會直接導致患者死亡。這給SLE患者的臨床合理用藥帶來嚴重困難。目前，臨床醫生對SLE患者是否應該給予GC治療，治療後在病程不同階段應該使用何種劑量，病情穩定後應該如何調整劑量等都還主要依靠臨床經驗進行嘗試性治療，導致相當一部分病人不能適時的得到最佳治療。
[0005]藥物基因組學是 繼人類基因組計劃完成之後出現的功能基因組學研究的一個分支，它的出現對於提高藥物療效，減輕不良反應具有重要的意義。藥物基因組學介導的個體化用藥就是藥物治療在充分考慮每個病人的遺傳因素基礎上制定安全、合理、有效、經濟的藥物治療方案。近年，國際權威雜誌《N Engl J Med》、《SCienCe》等刊登的研究證據表明藥物基因組學研究在轉化應用中能夠迅速獲得回報。藥物基因組學的主要手段是檢測相關基因的單核苷酸多態性(single neucleotide polymorphism, SNP)。這種SNP可能會影響到其所表達的蛋白質的功能，或者影響蛋白質的表達水平，進而影響與其相互作用的外源性分子的效應，即藥物療效。不久的將來，患者基因型將成為確定患者個體化治療的重要依據。
[0006]當前，迫切需要風溼科醫生治療SLE病人時能夠在充分考慮每個病人的遺傳因素基礎上制定安全、合理、有效、經濟的藥物治療方案。GR是GC發揮生理和藥理作用的重要環節，目前本領域缺乏基於GR基因(NR3C1)多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的方法和試劑盒。
[0007]

【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒和方法。
[0009]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
一種基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒，包括以下試劑，保存溫度為_20°C:
(1)檢測GR基因序列的引物；
(2)PCR擴增酶，純化PCR產物的純化酶及相應緩衝液；
(3)dNTP ；
(4)單鹼基延伸反應酶及相應的緩衝液。
[0010]所述的檢測GR基因序列的引物包括擴增基因序列多態性位點的引物以及單鹼基延伸基因序列多態性位點的延伸引物。
[0011]所述的GR基因序列的分子標記為rsl0482672，rs4912905, rsl7100234和rs7701443。
[0012]所述的擴增rsl0482672多態性位點的引物:
5』 - CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3』
5』 - TGTTGTGTTTGCAT ATCCATGAGAGTT -3』
所述的擴增rs4912905多態性位點的引物:
5， - GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3，
5』 - CAATTCATTGACCTTACAGAATCACTGG -3』
所述的擴增rsl7100234多態性位點的引物:
5， - GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3，
5， - AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3，
所述的擴增rs7701443多態性位點的引物:
5』 - GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3』
5』 - CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3』。
[0013]所述的單鹼基延伸rsl0482672多態性位點的引物:
5』 _ TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3』
所述的單鹼基延伸rs4912905多態性位點的引物:
5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3』
所述的單鹼基延伸rsl7100234多態性位點的引物:
5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3，
所述的單鹼基延伸rs7701443多態性位點的引物:
5』 - TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3』。
[0014]本發明還提供了一種基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的方法，包括以下步驟:
(1)DNA的提取；
(2)PCR擴增反應；(3)純化反應；
(4)單鹼基延伸反應；
(5)基因分型；
(6)療效判斷:GR基因分型結果中rsl0482672多態性位點為T(CT+TT)的患者療效差，rs4912905多態性位點為C (GC+CC)的患者療效好，rsl7100234多態性位點為A (CA+AA)的患者療好，rs7701443多態性位點為A (AA)的患者療效差。
[0015]所述PCR 擴增反應中包括有 rsl0482672，rs4912905, rsl7100234, rs7701443 四對擴增多態性位點的引物。
[0016]所述單鹼基延伸反應中包括有rsl0482672，rs4912905, rsl7100234, rs7701443四條單鹼基延伸多態性位點的引物。
[0017]所述的糖皮質激素包括但不限於潑尼松、氫化可的松、可的松、強的松、強的松龍、甲強龍、甲基潑尼松、對氟米松、氟潑尼松龍、氯地米松、地塞米松、倍他米松等。
[0018]所述的療效為患者治療後臨床症狀是否緩解,緩解為療效好，沒有緩解為療效差。
[0019]本發明通過前瞻性的隊列研究提出了基於GR基因rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態性位點檢測糖皮質激素治療SLE療效的方法和試劑盒。根據rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態性位點不同基因型的患者臨床療效的差異，進行了卡方檢驗和回歸分析。結果發現，rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態性位點基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡；rsl0482672，rs4912905,rsl7100234和rs7701443多態性位點和糖皮質激素治療SLE的療效之間存在顯著關聯，rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態性位點能夠用來檢測糖皮質激素治療SLE的療效，其中，rsl04826`72多態性位點為T (CT+TT)的患者療效差，rs4912905多態性位點為C (GC+CC)的患者療效好，rsl7100234多態性位點為A (CA+AA)的患者療好，rs7701443多態性位點為A (AA)的患者療效差。
[0020]本發明提供了一種基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒和方法，為實現SLE患者的個體化治療提供了新的思路和方法，有利於風溼科醫生治療SLE病人時，能夠在充分考慮每個病人的遺傳因素基礎上制定安全、合理、有效、經濟的藥物治療方案。
[0021]
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解為，這些實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。
[0023]本發明的基於GR基因多態性檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒由以下試劑組成:
(I)擴增多態性位點的引物；
【權利要求】
1.一種檢測糖皮質激素治療SLE療效的試劑盒，其特徵在於，包括以下試劑，保存溫度為-20 0C: (1)檢測GR基因序列的引物， (2)PCR擴增酶，純化PCR產物的純化酶及相應緩衝液，
(3)dNTP, (4)單鹼基延伸反應酶及相應的緩衝液； 所述的檢測GR基因序列的引物包括擴增基因序列多態性位點的引物，以及單鹼基延伸基因序列多態性位點的延伸引物； 所述的基因序列的分子標記為rsl0482672，rs4912905, rsl7100234和rs7701443 ； 所述的擴增rsl0482672多態性位點的引物: ， 5』 - CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3』 ， 5』 - TGTTGTGTTTGCATATCCATGAGAGTT -3』 所述的擴增rs4912905多態性位點的引物: ， 5， - GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3，
，5』 - CAATTCATTGACCTTACAGMTCACTGG -3』 所述的擴增rsl7100234多態性位點的引物:
，5， - GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3，
，5， - AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3， 所述的擴增rs7701443多態性位點的引物:
，5』 - GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3』
，5』 - CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3』 ； 所述的單鹼基延伸rsl0482672多態性位點的引物: ， 5』 _ TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3』 所述的單鹼基延伸rs4912905多態性位點的引物:
，5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3』 所述的單鹼基延伸rsl7100234多態性位點的引物:
， 5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3， 所述的單鹼基延伸rs7701443多態性位點的引物: ， 5』 - TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3』。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468812SQ201310426341
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】鄒延峰, 葉冬青, 徐建華 申請人:安徽醫科大學