用於蛋白質標記的方法和組合物的製作方法
2023-06-11 07:42:01 2
專利名稱：用於蛋白質標記的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明一般地涉及將基團綴合或標記至蛋白質的方法。本發明還涉及經過標記的蛋白質，及對製備經過標記的蛋白質有用的中間體和試劑，供新型治療劑和診斷測試的研究和臨床開發。
背景技術：
蛋白質和肽構成細胞表面生物標誌物的分子成像可用的物質的一大部分。通過遺傳工程生成的靶定蛋白質作為PET成像劑是非常誘人的，但是用常規基於18F的輔基標記因合成時間長、放射化學收率差、和比活性低而成問題。雖然開發「理想」成像劑是一個重要目的，在實踐中，自現有蛋白質開發了許多成像劑，諸如單克隆抗體(Mab)及其工程化改造片段，其最初是作為潛在治療劑或為了探索靶物的生物學而開發的。PET成像劑可在診斷測定法或生物標誌物測試中發揮功能，以能夠進行患者選擇、對治療候選者告知關於適應證選擇的決策、和使靶向相同受體或疾病途徑的治療劑的臨床益處最大化。在治療之前進行預測性生物標誌物測試以預測特定治療是否有可能是有益的。預後生物標誌物與疾病結果有關且可改善臨床試驗設計和處理，和數據判讀置信水平。自Mab模板開發正電子發射斷層攝影(PET)成像劑(免疫PET)有希望成為用於定位和量化分子靶物的工具且可增強病理狀況的非侵入性臨床診斷(van Dongen et al (2007)Oncologist 12 ；1379-89 ；Williams et a(2001)Cancer Biother Radiopharm 16 :25-35 ；Holliger et al (2005)Nat Biotechnol 23:1126-36)。PET 是一種分子成像技術，其越來越多地用於疾病檢測。PET成像系統基於患者組織中正電子發射同位素的分布來創建圖像。通常通過注射包含正電子發射同位素(諸如F-18、C-11、N-13、或0-15，其共價附著於易於在身體中代謝或定位的分子(例如葡萄糖)或化學結合身體內的受體位點)的探針分子將同位素施用於患者。在一些情況中，作為離子溶液或通過吸入將同位素施用於患者。小的免疫PET成像劑，諸如Fab抗體片段(50kDa)或雙抗體，共價聯合的Mab VH-VL 區的成對二聚體，55kDa (Shively et al(2007)J Nucl Med 48 170-2)，可能是特別有用的， 因為它們展現短循環半衰期、高組織通透性，且在注射後2至4個小時之間達到最佳腫瘤對背景比，推動使用短半衰期同位素，諸如廣泛可得的18F(109. 8min)。通過遺傳工程生成的靶定蛋白質作為PEG成像劑是非常誘人的，但是用常規基於 18F的輔基標記因合成時間長、放射化學收率差、和比活性低而成問題。一種用於快速製備能夠有效地將18F導入蛋白質的各種水溶性輔基(prosthetic group)的模式平臺(modular platform)。將基於18F的PET成像提供的靈敏度和高解析度與這些抗體片段的高特異性組合是一種特別誘人的用於新型診斷測定法和治療劑的研究和臨床開發的策略。通過當前方法生成18F標記的蛋白質是不恰當的，因為相對較溫和的水性反應條件是保留大多數蛋白質的功能所必需的。現有的用於蛋白質綴合的18F標記的輔基常常受限於放射化學收率差、合成時間長、和比活性低的一些組合。改良的用於生成18F標記的蛋白質的方法在促進人體中的分子成像以解決臨床開發工藝諸如靶物表達水平、異質性和表達過程方面是有價值的。優選位點特異性綴合勝過隨機氨基修飾，因為它能夠化學修飾遠離結合位點的位點，促進生物學活性的完全保留且容許控制添加的輔基的可能數目。已調查在選定位置處含有半胱氨酸的遺傳工程蛋白質來開發位點特異性綴合(Junutula，J. R. et al (2008) J Immunol Methods 332 :41-52 ；US2007/0092940)。通過輔基放射性核素標記工程化改造半胱氨酸殘基上的硫醇基團作為位點特異性方法是有利的，因為半胱氨酸的存在在非反應性二硫化物形式佔優勢的蛋白質組內是有限的(Olafsen et al (2004)Protein Eng Des Sell7 :21-7 ;Tait et al(2006)J Nucl Med 47 :1546-53 ；Li et al (2008)Bioconjug Chem 19:1684-8)。一種蛋白質工程化改造方法，PHESELECTOR，採用噬菌體展示文庫來選擇半胱氨酸替代的最佳胺基酸位置(Junutula et al. (2008)Nat Biotechnol 26: 925-32 Junutula et al(2008)J Immunol Methods 332 :41-52 ;US2007/0092940)。使用 PHESELECTOR方法，蛋白質穩定性和結合親和力得到保留，而不想要的二硫鍵形成降至最低，提供最佳綴合效率。此方法用於生成含有可用半胱氨酸的經修飾Mab (ThioMab)，自其方便地生成帶有反應性硫醇基團的Fab片段(ThioFab)。含有馬來醯亞胺基團的輔基，諸如[18F]FBEM(Cai et al(2006)J Nucl Med 47: 1172-80)、[18F]FBAM(Berndt et al (2007) Nucl Med Biol 34 :5-15)、[18F]FBABM(Li et al(2008)Bioconjug Chem 19 :1684-8 ；Toyokuni et al(2003)Bioconjug Chem 14 1253-9)、[18F]FBOM(Wuest et al (2009) Amino Acids36 :283-295), [18F]FDG-MHO (ffuest et al (2008)Bioconjug Cheml9 1202-10)、和[18F]FPyMe(de Bruin et al (2005)Bioconjug Chem 16 :406-20),已用於將18F位點特異性地導入攜帶硫醇的蛋白質。這些標記試劑[18F] FBEM、[18FlFBAM, [18F]FBABM、和[18F]FB0M是自一個共同平臺開發的，其中給芳香族前體 18F-氟苯甲醛([18F]FBALD)偶聯攜帶氨基氧基的馬來醯亞胺前體。然而，芳香族和(除[18F] raoM之外的)脂肪族模塊的存在增強這些輔基的親脂性，潛在限制與親水性環境內存在的蛋白質硫醇基團的綴合效率。另外，這些輔基要求較長的合成時間且通常提供相對較差的 18F標記蛋白質放射化學收率。發明概述提供了一種用於快速製備能夠有效地將18F引入蛋白質的各種水溶性輔基的模式平臺。
本發明的一個方面包括標記蛋白質的方法，包括使標記試劑和蛋白質反應以形成經過標記的蛋白質。標記試劑包括
權利要求
1. 一種標記蛋白質的方法，包括使選自下述的標記試劑和選自抗體、幹擾素、淋巴因子、細胞因子、激素、或生長因子的蛋白質反應，由此形成經過標記的蛋白質
2.權利要求1的標記蛋白質的方法，其中所述標記試劑是
3.權利要求1的標記蛋白質的方法，其中所述標記試劑是
4.權利要求1的標記蛋白質的方法，其中所述標記試劑是
5.權利要求1的標記蛋白質的方法，其中所述蛋白質包含游離半胱氨酸硫醇。
6.權利要求1的標記蛋白質的方法，其中所述蛋白質的所述游離半胱氨酸硫醇與所述標記試劑反應。
7.一種製備選自下述的經過標記的蛋白質的方法
8. 一種製備選自下述的經過標記的蛋白質的方法
9.權利要求1的方法，其中所述蛋白質是選自單克隆抗體、雙特異性抗體、鼠抗<p體、嵌 合抗體、人抗體、和人源化抗體的抗體。
10.權利要求9的方法，其中所述抗體是Fab片段。
11.權利要求10的方法，其中所述Fab片段是4D5ThioFab。
12.權利要求1的方法，其中所述酮催化劑是Cu(MeCN)4PF6或CuSO4
13.一種選自下述的標記試劑
14.權利要求13的標記試劑，其具有下式
15.權利要求13的標記試劑，其具有下式
16.權利要求13的標記試劑，其具有下式
17. 一種選自下述的經過標記的蛋白質
18. —種藥物組合物，其包含經過標記的蛋白質和一種或多種藥學可接受載體、助流劑、稀釋劑、或賦形劑，其中所述經過標記的蛋白質選自
19. 一種成像方法，包括 對動物施用經過標記的蛋白質；並通過成像在體內檢測所述經過標記的蛋白質的存在， 其中所述經過標記的蛋白質選自
20.權利要求19的方法，其中所述經過標記的蛋白質結合抗原。
21.權利要求19的方法，其中所述動物是腫瘤異種移植物小鼠模型。
22.—種製備具有下式的標記試劑的工藝
全文摘要
提供了一種用於快速製備能夠有效地用18F標記試劑將18F引入蛋白質的各種水溶性輔基的模式平臺。
文檔編號C07K1/13GK102333548SQ201080009313
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月25日 優先權日2009年2月27日
發明者H.吉爾, J.蒂尼阿諾, J.馬利克, S.威廉斯 申請人:健泰科生物技術公司