細胞破裂的製作方法

2023-09-23 09:50:05 3

專利名稱：細胞破裂的製作方法
細胞破裂
技術領域：
本發明涉及通過破裂細胞膜釋放細胞的成分的方法和設備。此可進行，以便收穫一種或更多細胞成分用於在例如，生物學反應中可能的進一步處理。常常其是需要隨後診斷分析的細胞核酸(NA)組分。NA下文指稱RNA和DNA組分。方法可容易適應於優先釋放細胞基質的蛋白性組分，如果此如此需要。偶爾必需首先純化祀NA分子，以便實施生物學反應諸如聚合酶鏈反應(PCR)。例如NA本身起初含在被細胞膜保護的細胞之內。由此，為對NA實施PCR，必需自其細胞釋放NA及進入適合於下遊提取和純化步驟的載體流體。
背景技術：
許多方法是細胞破裂目前可利用的。這些包括酸/鹼，酶促，超聲處理(由超聲波破裂)或機械分離。但是，這些是耗時，一些是過度損傷及破壞NA本身，風險混雜和可引起不可再現的質量和量的最終純化的產生的NA。而且許多存在的技術不是自動化靈敏的。DNA提取常在潛在地危險的化學品諸如苯酚和胍鎗鹽的存在下實施，以便移出可幹擾隨後下遊過程的不需要的細胞組分諸如脂肪和蛋白。會期望不依賴於這些毒性添加劑的快速方法。由溫度操作的DNA提取已描述於文獻。已描述使用沸騰以物理學破壞釋放NA的靶細胞的細胞膜。同樣，已關於植物材料特別描述通過使用液氮冷凍，其中冰晶的形成可物理學破壞這些組織類型的細胞膜，它們包含多糖。此細胞裂解方法會適合於直接包括進許多診斷測定。已之前描述直接自簡單靶諸如人血擴增核酸序列的方法。在這些之前工作中細胞類型高度靈敏於裂解，且像這樣無需另外的步驟，以優化緩衝流程以最小化由細胞內容物的生物學過程的抑制。未描述更多複合靶，諸如細菌細胞的直接擴增，及會需要添加蛋白酶和長，耗時的下遊處理。有在非常短時期內獲得NA釋放，同時精確地控制量和質量的純化的NA是高度期望的環境。能經操作依賴於簡單的時間和溫度動力學的過程進行此會可有價值。發明概述根據本發明的第I方面，提供用於細胞破裂的方法，包括放置含有細胞的物質緊鄰熱電電池的工作面，其基面鄰近處於水的冷凍及沸騰溫度之間的基本上恆定溫度的熱源/匯，將電流施加到熱電電池以實質上改變物質的溫度。熱電電池可為珀耳帖電池。 在一實施方式中，熱電電池(TEC)與熱匯單獨關聯，及提供獨立的電阻性加熱器元件。在此實施方式中，因此單獨使用熱電電池以提供冷卻，因此減少對TEC的熱應激。2個獨立加熱及冷卻裝置被相同的電子迴路有利地控制，從而可達到任何溫度設置點。優選的加熱器元件可為與容器本身緊密接觸的電阻性加熱器線，例如包含圍繞熱導電容器支架或中間體和熱導電支架諸如金屬杯電阻線圈。可替代性地採用UK專利說明書GB1100625. I中所示的加熱手段。
本發明的方法可產生非常快速細胞破裂，及靈敏於通過例如改變實施的熱循環的循環數，利用的緩衝系統，如果任何，待達到的靶溫度及也漸變發生的速度來操作。在一實施方式中，第I步驟旨在將其工作面的溫度降低到冷凍，由此在靶細胞中形成冰晶，然後導致冰解凍。在另一實施方式中，溫度首先升高到沸騰，然後允許樣品冷卻。此後來的實施方式其當細胞相對簡單時是有用的。血是此一例。在再一實施方式中，採用熱循環，其可包含交替對熱電電池逆轉電流，其中電池多少循環冷凍及沸騰。需知，當細胞沸騰時發生細胞破裂的溫度，通常是75°C以上。包含冷凍及沸騰的熱循環可重複多次。快速熱循環，也許甚至熱休克，也會在樣品的滲透勢中實現有用的變化，由此輔助細胞破裂。在特定環境中，方法可包含幾個加熱及冷卻循環，不冷凍，或僅偶然冷凍，或等同地幾個冷凍及解凍循環，有僅偶然或無加熱。熱循環的時程會依賴於樣品的樣品體積和容器性質。循環速度可例如涉及冰晶體生成，由於不同冷卻速度會創建不同尺寸的冰晶，其會進而不同地影響細胞破裂。方法可個別優化依賴於許多因素，諸如NA釋放的特異性靶生物，需要的期望的NA產率，需要的個體 NA片段的尺寸及隨後實施的任何給定下遊診斷測定的物理需求。此優化可取改變溫度，時間，循環數和也NA釋放進去的載體介質本身的形式。但是，如果如此需要，可採用方法以釋放細胞基質的其他蛋白性組分。循環過程在靶細胞中具有許多物理效應。首先，加熱細胞到沸點導致細胞膜破壞，由此導致細胞組分大規模釋放進提取基質。加熱，而非冷卻是第I步驟的方法對NA被簡單脂質膜圍繞的血使用可為適合。在此情況中，實際上，在第I加熱循環之後，除了冷卻之外，裂解的物質，不需要進一步循環。但是，加熱單獨不足以自許多生物產生高質量NA，由於在這些條件下NA保持與細胞蛋白關聯。隨後冷凍進一步破壞餘下的細胞結構及重複冷凍足以變性與NA關聯的蛋白，和因此致使其適合於純化和隨後診斷使用。提取基質，NA釋放的流體，也可為諸如旨在改善提取過程的結果。以其最簡單的形式，本領域知道的任何緩衝劑，諸如TRIS EDTA (三氨基甲烷乙二胺四乙酸)，可用於實施冷凍/解凍。任何提取的NA會適合於立即下遊處理，在此實例中，和像這樣，此是優選的實施方式。一些靶細胞可對冷凍/解凍提取方法有抗性，及在這些實例中，包括另外的手段以裂解細胞內容物可為必需。這些可尤其包括初始酶處理，預先的超聲處理和酸/鹼處理。但是預期，任何其他破裂會通過操作細胞的滲透勢，例如通過改變提取基質的鹽濃度和成分和還通過操作熱循環步驟來提供。步驟諸如包括酶處理，酸/鹼處理，改變提取基質的鹽濃度和成分可在本發明的方法之前實施，或可合併進設備和過程。自由此破壞的細胞的特定成分的純化可然後通過使用本領域所知的過程實現，諸如簡單的基於醇的沉澱方法或經過任何可商購的基於「柱」的系統。此會然後致使所述NA適合於隨後生物學過程諸如PCR。在優選的實施方式中，不會需要該中間步驟，及釋放的NA會用於下遊生物學過程，諸如聚合酶鏈反應(PCR)，其用對此上清液優化的酶和緩衝劑混合物實施。在此實例中，PCR緩衝劑會是就在多個冷凍解凍循環後無產率損失和另外地待被細胞內容物最低限度抑制優化的裂解培養基。有其他就該直接方法記載的方法，但這些限制於非常容易裂解的樣品，諸如血。描述的發明會能自更寬得多範圍的複合生物依靠能破壞蛋白和複合多糖細胞器經冷凍解凍方法直接擴增DNA。此會帶來能提供在單關閉的管容器中實施的基於快速PCR的診斷學的新優勢，其不需求多個步驟，由此本身成為非-專家操作根據本發明的破裂過程是容易靈敏於自動化及，更特別，作為可包括隨後純化和PCR或其他生物學過程的閉合過程實現。提供用於將以上直接所示的細胞裂解步驟包括進下遊過程諸如PCR以便進一步減少該過程的時間和複雜性的方法和設備是本發明的特徵。在多數情況中，過程可在單容器諸如管中實施，立即跟隨的是無需由PCR或其他生物學反應中間純化是本發明的特別有價值的特徵。根據本發明的此方面的方法提供快速和有效裂解方法，適合於自廣泛的生物，諸如例如，病原性細菌和病毒提取質粒和基因組DNA。本發明的破裂過程可在約I分鐘之內，當然在5分鐘之內完成，和可優化以釋放任何期望的細胞組分，其是DNA，RNA或的確期望蛋白級分。當將電壓施加於TEC時，流過的電流導致其第I面成為更溫和第2面成為更冷。逆 轉電流導致第I面冷卻及第2面變熱。由此，TEC可用於實施含有待在根據本發明的方法中破壞或裂解的細胞的樣品的加熱及冷卻，只要是第2或基面保持在沸騰及冰點中間的恆定溫度而第I或工作面是交替在沸騰及冷凍溫度。TEC優選具有施加的電壓，使得樣品加熱到水的沸點(100°C)，在該點，逆轉對TEC的電壓及將樣品冷卻到在或小於0°C的溫度。但是，以此方式使用TEC的問題是TEC的構建中使用的不同材料，例如陶瓷和金屬的熱膨脹係數會，在現有TEC中，或即為可被稱的熱疲乏，其中工作面作為其溫度變化的結果連續旁側地膨脹及收縮，而基面基本上維持其尺度，導致當重複該大量溫度反轉時分層。此問題在本發明的第2方面解決。根據本發明的此第2方面，用於實施本發明的方法的設備包含具有由柱分離的基面和工作面的TEC，及設置為保持在恆定溫度的熱源/匯，基面柔性地附接於熱源/匯。以此方式，基面可隨著工作面扭曲膨脹及收縮，而後者由於其中的溫度變化而膨脹及收縮，但就TEC自熱源/匯的脫離或TEC解離而言傾向被減少。柱有利地由碲化鉍形成。在微量滴定設備的情景中，其柱儘可能短可為重要，在該情況中，電連接可最佳由降額的線形成，且所述線與HRM (熱移出模塊)儘可能緊密關聯，例如設置為由此經過以保持線相對冷。有利地，基面附接於熱匯，下文可能稱為HRM，而工作面附接於反應容器，或更可能反應容器支架，在其中，例如，本發明的細胞破裂發生。附接優選由熱導電柔性的粘合劑實現。粘合劑可具有大於lW/mK，優選超過10W/mK的熱傳導率。因此，當TEC的面金屬化，使用焊劑而將基面附接於熱匯是可能的，特別當熱匯本身由金屬構成時。優選使用軟焊劑，諸如基於銦的焊劑，及焊劑的厚度被製成諸如也足夠減少其的熱應激，且可為IOym和幾個mm之間的任何。為了確保焊劑厚度的一致性，可將間隔物放入焊劑。該間隔物會確保，當焊劑粘合劑取其液相形式時，熱匯和TEC之間的間隔由此間隔物控制。替代性的方法和設備旨在採用僅TEC用於加熱或，更可能冷卻，及根據情況合併分離的加熱器或冷卻器。此可避免TEC中無法耐受的應激。在加熱的情況中，適合的結構可包含TEC，其具有貫穿其的空穴以接收容器，容器也被加熱器圍繞。正常情況下，該結構會需要不同電供給，一個用於TEC和另一個用於加熱器。在此專利說明書中，詞彙容器指稱能保持待處理的物質或樣品的任何裝置，及反應容器可因此包含孔，管(打開或關閉的)載玻片，也許以矽晶片或託架的形式。本發明特別關乎孔形式的微量滴定容器，儘管創建容器形式的TEC工作面可特別有利。在本發明中，用來保持待裂解的細胞的反應容器可個別建立，或為線形，矩形，環狀陣列或其他陣列。一般，陣列會使得其安裝在標準微孔板的足跡之內，其為本領域技術人員熟知的形式。此形式包括但不限於以下陣列3X2反應容器，(6反應容器)6X4反應容器，(12反應容器)12X8反應容器，(96反應容器)24 X 16反應容器和(384反應容器)48 X 32反應容器(1536反應容器) 根據本發明的重要特徵，可每反應容器提供至少一個珀耳帖，和反應容器可為微量滴定容器，其也可為該容器的陣列之一，一般3X 2陣列或其整數倍。熱匯或HRM可包含如描述於PCT專利說明書PCT/GB2007/003564的裝置。其可一般包含由金屬如銅形成的板，其中具有與由適當的風扇手段保持在恆定溫度的液體貯器連接的管迷路。HRM可因此形成容器陣列底，在該情況中，用定位銷或垛提供HRM會是方便的。

現在參照附圖以例方式描述本發明的一實施方式圖I是容器經TEC安裝在HRM的示意性模式圖；圖2是在HRM上安裝TEC陣列的計劃視圖；圖3是HRM的示意性模式圖；以及圖4是合併本發明的閉合迴路裝置的示意性模式圖。實施方式圖I顯示經珀耳帖11安裝到HRM 12的反應容器10。珀耳帖11包含基板11a，第2板11b，多個柱Ilc和補給線lid。珀耳帖11用粘合劑13附接容器10和HRM，其厚度由間隔物14控制。補給線Ild經過HRM 12，由此它們被熱導電塑料物質15電絕緣。如顯示於圖2，HRM攜帶多個垛16，其形成安裝珀耳帖11的指引。HRM可替代性地具有一系列壓凹，諸如在圖3中，反應容器可合適地安裝於其中。在以上描述的設備的使用中，用容器中的一些靶生物材料，和保持在50°C量級的溫度的熱匯，以一個方向應用到TEC的電流將容器之內的溫度降低到冷凍以下。此可在特定情況中足以破壞靶材料的細胞。電流可然後逆轉，從而容器內的溫度上升到沸騰以上。此循環循環性重複以完成生物材料的細胞破裂。然後採用PCR以倍增特定細胞成分用於鑑定。純化過程可在破裂過程中實施，和從事分離需要的細胞成分，正常情況下為其NA。在顯示的特定例中，拍耳帖11是9mm矩形,及具有締化秘柱11c。補給線Ild是降額的。基於銦的焊劑13用於將珀耳帖11附接到容器10和HRM 12。在另一實施方式中，容器10不是反應容器，像這樣，但是支架，因此，設置為用於微量滴定反應容器的合適的接受。由此，一次性容器的成本可保持低，和標準物該使用的容器。用於此情況的理想的微量滴定反應容器是具有高表面體積比，具有7mmX7mm量級的底和3 5mm的高度，由熱導電塑料物質形成的容器。圖3例證HRM塊原理，其中TEC或加熱器和冷卻器元件(3)利用例如軟，柔性的銦焊劑附接於塊(I)。可為水但優選是專利非導電介質的流體諸如『流體XP』經入口(2)流過塊，以便遍及塊均衡溫度，因此使得各元件彼此獨立，也移出過量熱及允許HRM維持在靶溫度。加熱器冷卻器元件然後圍繞此預定的溫度熱循環，以便減少冷凍解凍過程發生的時間和能量需求。圖4例證面對的由熱/冷方法NA提取的實施方式，其允許NA提取，純化和隨後擴增及在自含有的盒或「生物晶片」中發生。此實施方式的優勢是整個過程可在閉合的管環境中實施，最小化混雜的似然性，及帶來相當的及時保存和消費，由於全部步驟可在單儀器和消耗品上實施。涉及的方法在以下凸顯；I.操作者通過一旦拭子已插入便液密性的孔口(6)(理想地利用密封劑膜)插入樣品，例如自懷疑患特定疾病的患者取的拭子。系統可適於使用許多不同原材料，例如使用注射器，通過路-洛二氏擬合或『固體』材料，通過有用於系統壓力的適當的密封的漏鬥類型孔口。·
2.然後利用向反應站(5)正置換自室I向含有樣品的密封的隔室衝入緩衝劑，如此進行含有懷疑的病原體細胞的樣品作為液體向反應室轉移。3.如之前描述於本申請，由反應室(5)的重複的熱循環介導病原體細胞的裂解和隨後NA釋放，以輔助裂解的過程，室I中含有的流體成分可依賴於靶病原體和待實施的特定測定而改變。4.在特定實施方式中，室I中含有的緩衝劑流體可含有特異於靶病原體的磁珠，其由抗體介導的手段或由本領域知道的直接寡核苷酸雜交結合。對此步驟的需求依賴於對於以對總NA的偏好優先捕獲靶NA或確保每種可能的病原體NA分子作為手段分離，以增加隨後分析的靈敏度的需求。5.在使用捕獲用磁珠的實例中磁場可應用於反應室(5)，其結合具有結合到它們的靶NA的珠。然後由室2中含有的流體重複漂洗自冷凍/解凍得到的細胞廢棄物。將自過程的廢棄物衝入室4，從而全體過程是自含有的。6.最終步驟旨在利用輕輕加溫自磁珠釋放結合的核酸，及重懸浮於室3中含有的擴增緩衝劑。當磁分離不是需要的時，將液相中的一部分總細胞NA去除到廢棄物，留下僅旨在與由室3供給的擴增組分組合需要的量。室3的內容物可構成對於許多生物學擴增流程必需的試劑，以便檢測靶分子的小初始數。在優選的實施方式中，此會是實時PCR，其包括添加特異於目標病原體的螢光標記的引物分子序列。流體室可由許多手段活化 正置換，其中壓縮流體室，將流體擠壓到反應室。此方法也包括流體可雙向地動的益處，如果漂洗或混合步驟需要及需要更少體積以存儲廢棄物流體。 正壓.以此方式，將空氣通過封件注入流體室。在盒插入後，和當需要的空氣將流體推出室時由針穿刺此封件。封件應設計使得當盒從儀器除去時其自封。 負壓也可使用。在優選的實施方式中，設計的性質允許隨後利用控制冷凍/解凍過程而實施任何熱循環過程，諸如PCR過程的TEC的益處。
權利要求
1.破裂生物學細胞而釋放含有的核酸物質的方法，包括 將含有細胞的容器放置在緊鄰熱電電池的工作表面，其基面緊鄰處於水的冷凍及沸騰溫度之間的基本上恆定溫度的熱源/匯，及 將電流施加到熱電電池以實質上改變物質的溫度。
2.權利要求I的方法，其中第I步驟旨在將其工作面的溫度降低到冷凍，由此在靶細胞中形成冰晶，然後導致冰解凍。
3.權利要求I的方法，其中首先將靶細胞加熱到其沸騰溫度，然後允許樣品冷卻。
4.權利要求I的方法，其採用熱循環，所述方法包括交替對熱電電池逆轉電流，其中熱循環可包括細胞的沸點和冰點。
5.權利要求I 4之任一項的方法，其中在冷凍後使物質經歷大於75°C的溫度。
6.前述權利要求之任一項的方法，其中物質暴露於熱休克，由此實現物質的滲透勢的變化。
7.權利要求I的細胞破裂方法，其包括交替冷凍及加熱細胞超過多個循環的進一步步驟。
8.權利要求I或權利要求2的細胞破裂方法，其包括改變細胞內的滲透壓的進一步步 驟。
9.前述權利要求之任一項的方法，其為閉合過程中的步驟，其中隨後步驟是生物學或化學過程，諸如NA擴增過程。
10.前述權利要求之任一項的方法，其還在前述權利要求的方法之前包括破裂步驟。
11.前述權利要求之任一項的方法，其中細胞含於緩衝劑。
12.前述權利要求之任一項的方法，其中熱電電池具有由柱分離的基面和工作面，基面柔性地附接於保持在恆定溫度的熱匯/源，所述方法包括交替逆轉TEC中的極性，以使TEC工作面至熱匯溫度以下及以上的溫度。
13.權利要求12的方法，其中採用電阻性加熱元件以提供另外的加熱能力或構成熱源。
14.權利要求13的方法，其中柱由碲化鉍形成。
15.權利要求13或權利要求14的方法，其中TEC具有由降額的線形成的電連接。
16.權利要求13 15之任一項的方法，其中TEC基板用熱導電柔性的粘合劑附接於熱匯。
17.權利要求16的方法，其中粘合劑具有大於lW/mK，優選超過10W/mK的熱傳導率。
18.權利要求16或權利要求17的方法，其中粘合劑包含軟焊劑。
19.權利要求18的方法，其中焊劑是基於銦的焊劑。
20.權利要求18 18之任一項的方法，其中間隔物確保焊劑厚度的一致性。
21.實施前述權利要求之任一項的方法的設備，其包含熱電電池，所述熱電電池具有由柱分離的基面和工作面，基面柔性地附接於設置在保持在恆定溫度的熱源/匯，其中交替逆轉熱電電池中的極性，使TEC工作面至熱匯溫度以下及以上的溫度。
22.權利要求21的設備，其中柱由碲化鉍形成。
23.權利要求21的設備，其中熱匯包含由金屬如銅形成的板，其中具有與保持在恆定溫度的液體貯器連接的管迷路。
24.權利要求21 23之任一項的設備，其中TEC熱電電池具有經過熱匯的連接線，以便由此保持冷卻。
25.權利要求21 24之任一項的設備，其中TEC基板用熱導電柔性的粘合劑附接於熱匯。
26.權利要求21 25之任一項的設備，其中TEC工作面用熱導電柔性的粘合劑附接於反應容器或反應容器支架。
27.權利要求25或權利要求26的設備，其中粘合劑具有大於lW/mK，優選超過10W/mK的熱傳導率。
28.權利要求25 27之任一項的設備，其中粘合劑包含軟焊劑。
29.權利要求28的設備，其中焊劑是基於銦的焊劑。
30.權利要求25 29之任一項的設備，其中間隔物確保粘合劑厚度的一致性。
31.權利要求21 30之任一項的設備，其中TEC具有由降額的線形成的電連接。
32.權利要求21 31之任一項的設備，其包含附接於熱匯的熱電電池陣列。
33.權利要求21和32的設備，其中各TEC熱電電池附接於反應容器或反應容器支架。
34.權利要求33的設備，其中反應容器支架具有關聯的電阻性加熱器。
35.權利要求21 34之任一項的設備，其中當在n96陣列中使用時，TEC是小於IOmm矩形。
36.權利要求34或權利要求35的設備，其中反應容器具有微量滴定能力。
37.權利要求21 36之任一項的設備，其中TEC熱電電池工作面附接於容器支架，其適應於合適地接收具有高表面體積比，具有7mmX7mm量級的底和3 5mm的高度，由熱導電塑料物質形成的反應容器。
38.用於權利要求37的設備的容器，所述容器具有高表面體積比，具有7_X7mm量級的底和3 5mm的高度，由熱導電塑料物質形成。
39.權利要求21 38之任一項的設備，其也包含用於實現其他生物學過程的裝置。
40.權利要求38的設備，其也包含用於實現其他生物學過程的裝置。
41.基本上如之前參照附圖描述的設備。
42.基本上如之前參照附圖描述的方法。
全文摘要
破裂生物學細胞的方法，其包括使用熱電電池冷凍，沸騰或也許交替冷凍及沸騰含有生物學細胞的物質，所述熱電電池具有與保持在基本上恆定溫度的熱匯/源連續的基面和工作面。用於實施破裂過程的設備包含珀耳帖電池，其基面柔性地附接於設置在保持在約50℃的恆定溫度的熱匯和其工作面與反應容器或反應容器支架連續。珀耳帖電池中電壓的反轉致使工作面交替達到冷凍溫度以下及沸騰溫度以上，和/或在容器支架上使用電阻性線用於加熱，TEC純用於冷卻。珀耳帖電池基面由趨向於抑制由在熱下膨脹和收縮所致的珀耳帖電池的解離的物質構成。
文檔編號C12N1/06GK102939371SQ201180029257
公開日2013年2月20日 申請日期2011年6月15日 優先權日2010年6月15日
發明者N·納扎雷斯, D·艾吉, D·沃德 申請人:Bg研究有限公司