一種具有雙重功效的體外診斷試劑盒防腐劑的製作方法

2023-06-09 08:33:11 2

專利名稱：一種具有雙重功效的體外診斷試劑盒防腐劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學體外診斷領域，具體地說是一種具有雙重功效的體外診斷試劑盒 防腐劑。
背景技術：
防腐劑是體外診斷試劑盒必不可缺少的成份，它能防止試劑盒因微生物的生長引 起的腐敗變質，使試劑盒在規定的環境中具有一定的有效性。目前國內外試劑盒大多數採 用化學劑，而採用的這些防腐劑中大部分都具有毒性，部分具有腐蝕性，對使用者及環境都 潛在很大的危險性及汙染。現有診斷試劑盒中常用的防腐劑有硫柳汞、疊氮鈉、抗生素等。硫柳汞在ELISA(酶聯免疫反應)試劑中曾普遍使用，但因其有毒，現較少或幾乎 不使用。市面許多試劑盒產品，用抗生素(如慶大黴素)做防腐劑較多，較疊氮鈉試劑毒性 作用小，但試驗過程中發現抗生素類藥物根據其化學結構有著不同的抗菌譜，抗菌譜最廣 的也僅僅限於大部分的原核微生物，無法對全部微生物起效。因此，抗生素只是可以對抗細 菌，但是不能對抗除細菌外的其它微生物，且長時間不能達到完全防腐的作用。疊氮鈉是目前體外診斷試劑盒最常用的防腐劑，雖然其防腐效果尚好，但其對過 氧化特酶、抗體的活性都有一定的抑制作用。此外，疊氮鈉已納入2008年的劇毒化學品來 管理。疊氮鈉和氰化物相似，對細胞色素氧化酶和其它酶有抑制作用，並能使體內氧合血紅 蛋白形成受阻，有顯著的降壓作用。對眼和皮膚有刺激性，如吸入、口服或經皮膚吸收，可引 起中毒死亡；同時，受熱、接觸明火、或受到摩擦、震動、撞擊時可發生爆炸。疊氮鈉與酸類劇 烈反應會產生爆炸性的疊氮酸，與重金屬及其鹽類會形成十分敏感的化合物。可見疊氮鈉 雖然為試劑盒最常用的防腐劑，但在使用過程中對人體、環境潛在著較大的危險性。ProClin系列防腐劑是SUPELC0公司推出新一代高效生物防腐劑，可以有效地控 制體外診斷試劑中微生物的生長。當濃度達到0. 02%條件下，ProClina系列防腐劑具有廣 譜抗菌活性，能在比較長的時間內抑制細菌、真菌和酵母菌等微生物的生長；同時，它又能 保持體系中酶的活性，因此它是一種理想的可替代硫汞撒、疊氮化鈉和慶大黴素等物質的 生物防腐劑，但因其價格昂貴，現在只少量用於臨床研究。因此，目前尋找一種價格合適、有 效且無毒害作用的試劑盒防腐劑是非常必要的。

發明內容
本發明的目的是提供一種價格合適、無毒性、無腐蝕性、對使用者及環境均無潛在 危險且能夠提升體外診斷試劑盒性能指標的防腐劑。為此，本發明採用如下的技術方案一種具有雙重功效的體外診斷試劑盒防 腐劑，其特徵在於所述的防腐劑採用蒜汁，其用量為體外診斷試劑盒中試劑體積總量的 0. 5% -6. 0%，最優選為 0. 5% -3. 5%。蒜汁有效成分大蒜素的分子式為C6H1(l0S2，具有抗念球菌屬菌、隱球菌屬菌和鬚髮癬菌等抗菌作用，是一種殺菌效果很理想的廣殺菌劑，其作用原理為大蒜素獨特的分子 結構使它具有濃烈的大蒜氣味。大蒜素的殺菌作用主要是因為其中的二烯丙基硫醚具有獨 特的生物活性。烯丙基是共軛結構基團，它的電負性較高，可部分地給毗鄰的硫原子提供電 子，使硫的缺電子性減小，活性增大，且能產生一定量的具生物活性的含硫基團，而許多含 硫基團是已知的有效殺菌劑，能破壞細菌的蛋白質合成等生理過程。蒜汁的主要特點就是 抗菌廣譜，抑菌力強，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、黴菌都具有極強的殺滅作用，可 有效地抑制試劑盒中細菌的生長。上述的體外診斷試劑盒防腐劑，蒜汁由大蒜中提取，其採用浸泡提取法，其過程如 下取新鮮大蒜，去皮搗碎成糊狀，所得的蒜泥加入乙醇溶液，密封放置10-20天，離心去 渣，濾液抽濾，將濾液減壓蒸餾去除乙醇即可。本發明對防腐劑的用量確定過程如下蒜汁與試劑的比例按0. 5 %、1 %、1. 5 %、 2. 5%,3. 0%,3. 5%,4. 0%A. 5%,5. 0%,5. 5%,6. 0%配製了 11 個試劑盒(以視黃醇結合 蛋白測定試劑盒為例)，防腐劑的用量不影響試劑盒的有效成份及性能指標作為前提，結果 如下表 上述實驗數據表明，蒜汁的用量在0.5% -6.0%範圍內，RBP測定試劑盒的各項技 術指標均在可接受範圍內，但在0.5% -3. 5%範圍內各項指標測定結果為最理想狀態。本發明對防腐效果的確定如下
因為在0.5% -3. 5%範圍內各項指標測定結果為最理想狀態，所以配製含蒜汁 0.5%U.0%U.5%,2.5%,3.0%,3. 5%系列濃度的RBP測定試劑盒，效期後12個月，觀察 試劑盒的技術指標，直至效期後13個月，結果如下 採用蒜汁作為防腐劑的防腐效果與疊氮鈉的防腐效果進行了比較(視黃醇結合 蛋白測定試劑盒均為近效期批號，第12個月)，結果如下 通過上述表格中的比較數據，可以看出本申請採用蒜汁作防腐劑，試劑盒中試劑 2 (主要是抗體)的外觀及試劑盒的各項技術指標方面都較市場上採用疊氮鈉作為防腐劑的同類產品優越。蒜汁不僅具有防腐功能，而且因其富含豐富的胺基酸，而眾所周知，胺基酸是最常 用的蛋白保護劑，抗體本身就是免疫球蛋白。所以，蒜汁還對免疫比濁試劑盒中的抗體具有 保護作用，能夠保持抗體原來的活性，使抗體與抗原能夠更快的反應形成抗原抗體複合物。 而疊氮鈉正好與蒜汁相反，雖然能夠對試劑盒防腐作用，但同時對配或抗體也有抑一定的 抑制作用，這樣，使得測定結果偏低。此外，大蒜中最重要的酶是蒜酶，1分子蒜酶約連有6 個磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛又是轉氨酶的預活化劑，可以對測定血清中的轉氨酶進行活化， 避免了因試劑盒無磷酸吡哆醛而造成測定結果假性偏低(目前國內轉氨酶測定試劑盒中 基本都不含磷酸吡哆醛)。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，它的升高通常都為肝細胞損傷所致， 其中又可分為兩類，一類是ALT的極度升高，一般由病毒性肝炎、藥物性肝炎或肝性休克所 引起的大的肝損傷所造成，它的ALT的測定範圍一般在100 4000IU/L之間。另一類則 反映中度的肝細胞損傷，通常由酒精性肝炎、傳染性單核細胞增多症和多肌炎所引起，它的 ALT測定範圍一般為30 300IU/L。ALT的參考範圍為5 40IU/L，它們含意僅指有95. 5% 的健康人其ALT測定值是在這一區間之內，但其醫學決定水平則有三個，第一個決定水平 是300IU/L，它可區別上述肝細胞損傷的二個臨床類型，300IU/L以上的值表示極度的肝細 胞損傷。第二個決定水平是60IU/L，此值比參考值上限高50%左右，因為一般當ALT測定 值在40 60IU/L之間時，並不能確定ALT的升高是否屬於病理性改變，許多不很健康的肥 胖者，其ALT值就通常浮動在這範圍之內，只有當ALT值大於60IU/L時，才可明確診斷為肝 細胞損傷，所以它是一個確認值。ALT的第三個醫學決定水平是20IU/L-比參考值限還低， 這是一個排除值，低於此值則可排除許多與ALT升高有關的疾病。因此，ALT測定結果的準 確性對於臨床判斷具有很重要的意義。目前國內試劑盒幾乎都不含磷吡哆醛，主要原因是 此成份加入對於試劑盒的穩定性有很大的影響，所以，患者血清的實際測定結果偏低，測定 結果滯後於病情的現狀。本發明首次採用蒜汁作為體外診斷試劑盒防腐劑，不僅對試劑盒能夠進行有效的 防腐、穩定，同時，蒜汁中富含的胺基酸對免疫透射比濁類試劑盒(如視黃醇結合蛋白測定 試劑盒)抗體液起到一定的加速反應的作用，是免疫試劑盒中抗體液的保護劑，使測定結 果準確；此外，蒜汁含有磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛本身就是轉氨酶的預活化劑，對血清中的 轉氨酶能夠起到一定的預活化的作用，使測定結果準確且與病情相符。由此可見，蒜汁對於 體外診斷試劑盒確實為一種具有雙效功能的防腐劑，是一種較為理想的新型體外診斷試劑 盒防腐劑；此外，蒜汁從大蒜中提取，來源容易，價格便宜，使用安全，對使用者、環境無任何 潛在危險，因此，很適易應用在體外診斷試劑盒中。
具體實施例方式實施例1 RBP測定試劑盒，試劑盒配方R1 :pH7. 4 磷酸鹽緩衝液 45mmol/L聚乙二醇600078mmol/L乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/L
蒜汁0.5%R2 鼠抗人單克隆抗體2ml/L兔抗人多克隆抗體3ml/LpH7. 4 磷酸鹽緩衝液45mmol/L乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/L蒜汁0.5%本實施例描述的視黃醇結合蛋白測定試劑盒，適合於各種類型的全自動生化分析 儀，以日立7060全自動生化分析儀為例，其操作如下 結果計算多點定標採用非線性定標中的Spline方程式，儀器自動生成定標曲線，根據定 標曲線可自動計算出樣品中的RBP濃度。表1、以本申請蒜汁為防腐劑的視黃醇結合蛋白測定試劑盒血清反應曲線數據。
表1中，血清與試劑反應到180秒時已經完成了整個反應的96. 3%，試劑盒的反應 一般情況下以完成整個反應的95%以上即可認定達到平衡。所以，血清與試劑反應180秒 就已經達到平衡。表2、以疊氮鈉為防腐劑的視黃醇結合蛋白測定試劑盒(試劑盒其他成份同上)血 清反應曲線數據。
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表2中，同濃度的血清與試劑反應到240秒時才完成整個反應的96. 1%，與表1 比較，反應速度明顯減慢。採用的兩種不同防腐劑的測定試劑盒與同濃度血清進行反應的數據及曲線圖進 行驗證，採用蒜汁作防腐劑，可以保持抗體的活性，加速反應抗體的反應。而採用疊氮鈉作 防劑劑，反應明顯減慢，也同時說明疊氮鈉在進行防腐的同時，對抗體、抗原的反應有一定 的抑制作用。實施例2 丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒Rl =Tris 緩衝液 100mmol/L ；α-酮戊二酸 15mmol/L ；NADH0. 24mmol/L ；LDH3. 0KU/L ；蒜汁2.5%R2 :L-丙氨酸1. 5mmol/L。蒜汁2.5%本實施例描述的丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，適合於各種類型的全自動生化分 析儀，以日立7060全自動生化分析儀為例，其操作如下 結果計算ALT(U/L) = (ΔΑ 測定 /min-ΔA 空白 /min) X33763376為在波長340nm/405nm，比色杯光徑Icm下的理論K值，其中NADH340nm處的 毫摩爾消光係數取6. 22，建議各實驗室根據實測K值計算。表3、蒜汁作防腐劑的試劑盒測定數據與疊氮鈉作防腐劑的試劑盒測定數據對比 表。
通過表3的兩組測定結果進行比較，顯示用蒜汁作防腐劑的試劑盒的測定結果明 顯比用疊氮鈉作防腐劑的試劑盒的測定結果高15% _30%，因此，進一步說明了蒜汁中的 磷酸吡哆醛對測定血清的的丙氨酸氨基轉移酶有預活化作用，使測定的結果與患者病情的 發展同步。
權利要求
一種具有雙重功效的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於所述的防腐劑採用蒜汁，其用量為體外診斷試劑盒中試劑體積總量的0.5％-6.0％。
2.根據權利要求1所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於蒜汁的用量為體外診斷 試劑盒中試劑體積總量的0. 5% -3. 5%。
3.根據權利要求1或2所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於蒜汁由大蒜中提取， 其採用浸泡提取法提取法。
4.根據權利要求3所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於浸泡提取法的過程如 下取新鮮大蒜，去皮搗碎成糊狀，所得的蒜泥加入乙醇溶液，密封放置10-20天，離心去 渣，濾液抽濾，將濾液減壓蒸餾去除乙醇即可。
5.權利要求1或2所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於將其應用於免疫透射比 濁類試劑盒。
6.權利要求5所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於將其應用於視黃醇結合蛋白 測定試劑盒。
7.權利要求1或2所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於將其應用於轉氨酶測定試齊U盒。
8.權利要求7所述的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於將其應用於丙氨酸氨基轉移 酶測定試劑盒。
全文摘要
目前的生物防腐劑可替代硫汞撒、疊氮化鈉和慶大黴素等物質，效果理想，但因其價格昂貴，現在只少量用於臨床研究。本發明提供了一種具有雙重功效的體外診斷試劑盒防腐劑，其特徵在於所述的防腐劑採用蒜汁，其用量為體外診斷試劑盒中試劑體積總量的0.5％-6.0％。本發明首次採用蒜汁作為體外診斷試劑盒防腐劑，不僅對試劑盒能夠進行有效的防腐、穩定，同時，蒜汁中富含的胺基酸對免疫透射比濁類試劑盒抗體液起到一定的加速反應的作用，是免疫試劑盒中抗體液的保護劑，使測定結果準確。
文檔編號G01N33/53GK101849559SQ201010181510
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者安東輝, 尹鵬 申請人:浙江康特生物科技有限公司