一種老年痴呆相關位點檢測方法
2023-10-11 07:26:59 1
專利名稱：：一種老年痴呆相關位點檢測方法
技術領域：
：本發明涉及疾病相關位點檢測
技術領域：
，更具體地，涉及老年痴呆相關位點檢測方法
技術領域：
，特別是指一種老年痴呆相關位點檢測方法。
背景技術：
：老年性痴呆(Alzheimer,AD)是一種慢性的大腦退行性變性疾病。臨床表現為進行性遠近的記憶力障礙，分析判斷能力衰退、情緒改變、行為失常、甚至意識模糊，最後死於肺炎或尿路感染。據統計，全球有老年性痴呆患者1700-2500萬。在我國估計已有約645萬病人。而且隨年齡每增加5歲，AD的患病率將增加兩倍，在80-85歲的病人中有20%的老年人患有老年痴呆。是繼心臟病、腫瘤和腦卒中之後的第四位死因，給患者家庭、社會造成了很大的負擔及壓力。然而，由於該病早期症狀的不典型性，容易被患者家屬忽視，從而失去最佳的治療時機。許多因素與該病發病機制和病因有關。其中最重要的是遺傳因素AD具有家庭聚集性，40%的患者有陽性家族史，呈常染色體顯性遺傳及多基因遺傳。到目前為止的研究表明，至少有4個基因的變異與老年性痴呆的發病風險密切相關。根據發病年齡老年性痴呆可簡單分為早老性痴呆(65歲)。兩者相關的基因變異有所不同。研究最多也最為深入的是晚髮型AD與Alza基因的關係，多達75%的晚髮型AD患者在某種程度上與Alza基因型有關。因此，為了更早地預防老年痴呆的發生，需要在老年痴呆發生前就提前通過基因檢測準確篩查出高風險人群，並對這一人群進行有針對性的健康管理，才能做到真正的早預防，再結合其它手段定期檢測，真正實現老年痴呆的早發現、早治療，以達到提前進行個性化預防的目的。
發明內容本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種老年痴呆相關位點檢測方法，該檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，為是否進一步採取有針對性的健康管理以及後續的檢測手段提供參考依據。為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下該老年痴呆相關位點檢測方法，其特點是，包括步驟a.提取來自人的樣本的基因組DNA;b.根據至少2個老年痴呆相關基因的每一個分別設計一對T叫man探針對和一對引物對，所述T叫man探針對的5'端和3'端分別標記螢光報告基團和螢光淬滅基團，分別對所述基因組DNA進行螢光定量PCR擴增；c.根據螢光定量PCR擴增結果來判斷所述至少2個老年痴呆相關基因是否發生突變。較佳地，所述老年痴呆相關基因的數目是5個。更佳地，所述老年痴呆相關基因是AP0E1基因、AP0E2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因。3更進一步地，所述Taqman探針對和所述引物對用於檢測檢測APOE1基因的rs429358位點，AP0E2基因的rs7412位點，CYP46基因的rs754203位點，CTSD基因的rsl7571位點，IL1A基因的rsl800587位點。較佳地，所述Taqman探針對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。較佳地，所述Taqman探針對是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。較佳地，所述Taqman探針對是SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。較佳地，所述Taqman探針對是SEQIDNO:13和SEQIDN0:14所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。較佳地，所述Taqman探針對是SEQIDNO:17和SEQIDN0:18所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示的核苷酸序列。本發明的創新點在於幾個老年痴呆有關的侯檢位點的整合，通過選取多個老年痴呆的侯檢位點，具體根據AP0E1基因、AP0E2基因、CYP46基因、CTSD基因和ILIA基因設計特異性引物和Taqman探針對來自人的樣本的基因組DNA進行螢光定量PCR擴增，根據產生的螢光的量和螢光的種類可以知道侯檢位點的基因型，設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，將基因體檢的結果作為老年痴呆健康管理的主線，監控疾病的發生發展。如果是老年痴呆遺傳風險度高的人群，建議減少一切老年痴呆的外在致病因素，並每半年進行一次檢查，做到早預防，早發現，早治療，延緩甚至避免疾病的發生。具體實施例方式為更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例作進一步說明。1.基因組DNA提取1.l試劑和儀器1.1.1試劑和耗材基因組DNA抽提試劑盒(TIANampBLOODDNAkit,DP318-03;TIANampMicro微量樣品基因組DNA提取試劑盒，DP316;TIANamp口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，DP322-03)含細胞裂解液CL;緩衝液GA;緩衝液GS;緩衝液GB;緩衝液GD;漂洗液PW;洗脫緩衝液TB;CarrierRNA;RNase-freeddH20;蛋白酶K(20mg/ml);吸附柱；收集管(2ML);1.5ML無菌收集管；無水乙醇。1.1.2儀器DENVILLE260離心機，XW-80A旋渦混合器，H.H.S指針式電熱恆溫水浴鍋。1.2提取步驟從全血中提取基因組DNA41.2.1取200ill的抗凝全血至1.5ml的E卯endorf管中，如果樣本的量少於200iil，則加入緩衝液GS補充至200ia。如果樣本量多於200iil，需要用細胞裂解液CL處理，具體步驟如下在樣品中加入1-2.5倍體積的細胞裂解液CL，顛倒混勻，10，OOOrpm離心1分鐘，吸取上清，留下細胞核沉澱(如果裂解不徹底，可重複以上步驟一次)，向離心收集到的細胞核沉澱中加200iU緩衝液GS，振蕩至徹底混勻。1.2.2加入20ill的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200y1的緩衝液GB，立刻充分顛倒混勻。56t:水浴樣本10分鐘，水浴過程中請每隔3分鐘上下輕柔顛倒混勻樣本，溶液應變清亮。(如溶液未徹底變清亮，可延長裂解時間至溶液變清亮為止)。1.2.3加入200y1無水乙醇，充分顛倒混勻，這時可能會出現絮狀沉澱。1.2.4將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.5向吸附柱中加入500iU緩衝液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.6向吸附柱中加入700ii1漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.7向吸附柱中加入500iil漂洗液PW，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。1.2.8將吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。吸附柱置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。1.2.9將吸附柱轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200ii1洗脫緩衝液TB，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意洗脫緩衝液體積不應少於50iU，體積過小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH對於洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍內(可以用NaOH將水的pH值調到此範圍)，pH值低於7.0會降低洗脫效率；且DNA產物應保存在_20°C，以防DNA降解。2.Taqman探針法檢測侯檢位點2.1實驗試劑及儀器2.1.1實驗試劑螢光定量試劑:ABITaqMan2XPCRMastermix(P/N:4326614，Lot:G15502)。[O(HO]普通PCR試劑寶生物工程(大連)有限公司的ExTaqDNA聚合酶(P/N:DRR100B，Lot:CKA1801A)。2.1.2實驗儀器ABI9700型PCR儀和ABI7900HT型螢光定量PCR儀。2.1.3檢測位點探針及引物表5tableseeoriginaldocumentpage6b.PCR循環條件tableseeoriginaldocumentpage72.2.3根據反應過程中釋放的螢光的量和螢光的種類來判斷對應候選位點的基因型。3.結果分析根據最終終點讀板結果分型圖進行分析，結果如下反應1:用於檢測AP0E1基因的rs429358位點，該候檢位點在人群中有三種基因型TT，CT和CC，其中攜帶TT基因型為正常人群，攜帶CC和CT基因型的人群較攜帶TT基因型的人群有較高的風險罹患老年痴呆，患病風險機率大小CC型〉CT型>TT型，分型圖分析結果表明rs429358位點為CT，非正常基因型；反應2:用於檢測AP0E2基因的rs7412位點，該候檢位點在人群中有三種基因型CC，CT和TT，其中攜帶CC、CT基因型為正常人群，攜帶TT基因型的人群較攜帶CC和CT基因型的人群有較高的風險罹患老年痴呆，患病風險機率大小TT型>CT型和CC型，分型圖分析結果表明rs7412位點為CT，正常基因型；反應3:用於檢測CYP46基因的rs754203位點，該候檢位點在人群中有三種基因型AA，AG和GG，其中攜帶AA基因型為正常人群，攜帶GG和AG基因型的人群較攜帶AA基因型的人群有較高的風險罹患老年痴呆，患病風險機率大小GG型>AG型>AA型，分型圖分析結果表明rs754203位點為AA，正常基因型；反應4:用於檢測CTSD基因的rsl7571位點，該候檢位點在人群中有三種基因型CC，CT和TT，其中攜帶CC基因型為正常人群，攜帶TT和CT基因型的人群較攜帶CC基因型的人群有較高的風險罹患老年痴呆，患病風險機率大小TT型〉CT型〉CC型，分型圖分析結果表明rsl7571位點為CC，正常基因型；反應5:用於檢測IL1A基因的rsl800587位點，該候檢位點在人群中有三種基因型CC，CT和TT，其中攜帶CC基因型為正常人群，攜帶TT和CT基因型的人群較攜帶CC基因型的人群有較高的風險罹患老年痴呆，患病風險機率大小TT型>CT型>CC型，分型圖分析結果表明rsl800587位點為CC，正常基因型。根據上述檢測結果，可以判斷上述受檢的AP0E1基因異常，AP0E2基因、CYP46基因、CTSD基因和ILIA基因均正常，受檢者較正常人患老年痴呆的機率要高一些，但是其患老年性痴呆的遺傳傾向屬於低度風險人群，但是是否已經患有老年痴呆，還需要進行進一步的檢查，因為其與多種因素有關，可進行專門的針對性的健康管理。如果其中沒有基因異常，則基本無需進行專門的針對性的健康管理，但是如果其中更多個基因異常，那麼就更需要進行進一步的老年痴呆檢查以確定是否已經患有老年痴呆，並進行專門的針對性的健康管理。綜上所述，本發明的老年痴呆相關位點檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，為是否進一步採取有針對性的健康管理以及後續的檢測手段提供參考依據。需要說明的是，在本發明中提及的所有文獻在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，以上所述的是本發明的具體實施例及所運用的技術原理，在閱讀了本發明的上述內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改而不背離本發明的精神與範圍，這些等價形式同樣落在本發明的範圍內。序列表〈110〉上海基康生物技術有限公司〈120〉一種老年痴呆相關位點檢測方法〈160>20〈210>1〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據人AP0E1基因序列設計的T叫man探針〈400>1ccgcacacgtcctccatgtcc21〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(19)〈223〉根據人AP0E1基因序列設計的T叫man探針〈400>2ccgcgcacgtcctccatgt19〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(20)〈223〉根據人AP0E1基因序列設計的上遊引物〈400>3ccatgaaggagttgaaggcc20〈210>4:0098]〈211〉17:0099]DNA:0100]〈213〉人工序列:0101]〈220〉:0102]〈221>misc_feature:0103]〈222>(1)...(17):0104]〈223〉根據人APOEl基因序列設計的下遊引物:0105]〈400>4:0106]ccgcggtactgcaccag17:0107]〈210>5:0108]〈211>20:0109]〈212>DNA:0110]〈213>人工序列:0川]〈220〉:0112]〈221>misc_feature:0113]〈222>(1)..(20):0114]〈223〉根據人AP0E2基因序列設計的Taqman探針:0115]〈400>5:0116]tgccaggcgcttctgcaggt20:0117]〈210>6:0118]〈211>23:0119]〈212>DNA:0120]〈213>人工序列:0121]:0122]〈221〉misc_feature:0123]〈222〉(1).(23):0124]〈223〉根據人AP0E2基因序列設計的Taqman探針:0125]6cactgccaggcacttctgcaggt23〈210>7〈211〉17〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉misc_feature〈222〉(1).(17)〈223〉根據人AP0E2基因序列設計的上遊引物〈400>7cctcccacctgcgcaag179〈210〉8〈211>16DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc—feature〈222〉(1).(16)根據人AP0E2基因序列設計的下遊引物〈400>8ggatggcgctgaggcc16〈210〉9〈211>19DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(19)根據人CYP46基因序列設計的Taqman探針〈400>9cttgcccccagggctcctg19〈210〉10〈211>16DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(16)根據人CYP46基因序列設計的Taqman探針〈400>10tgcccccggggctcct16〈210〉11〈211>20DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(20)根據人CYP46基因序列設計的上遊引物〈400>1110gactcggc朋gtgagc朋c32012〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(20)〈223〉根據人CYP46基因序列設計的下遊引物〈400>12cccagctgagaaaccgatgt20〈210>13〈211〉17〈212〉DNA人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1)..(17)〈223〉根據人CTSD基因序列設計的T叫man探針〈400>13tcccaggcggtgccagc17〈210>14〈211〉20〈212>DNA人工序列〈221〉misc—feature〈222〉(1).(20)〈223〉根據人CTSD基因序列設計的T叫man探針14actcccaggtggtgccagcc20〈210〉15〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc—feature〈222〉(1).(18)〈223〉根據人CTSD基因序列設計的上遊引物11〈400>15caaaggccccgtctcaaa18〈210〉16〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(26)〈223〉根據人CTSD基因序列設計的下遊引物〈400>16acctcatactcacgtccatgtagttc26〈210>17〈211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈221>misc_feature〈222〉(1).(23)〈223〉根據人ILIA基因序列設計的Taqman探針〈400>17ccaggcaacaccattgaaggetc23〈210>1824〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>misc—feature〈222>(1)...(24)〈223〉根據人ILIA基因序列設計的Taqman探針〈400〉18cc3ggc朋c3tcattg朋ggctca24〈210>19〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222>(1)...(25)〈223〉根據人IL1A基因序列設計的上遊引物〈400〉19gccac3ggemttete朋;agctgaga25〈210>20〈211>19misc—feature〈222〉(1)..(19)〈223〉根據人ILIA基因序列設計的下遊引物〈400>20cccgggaggtatgcgt.aag19權利要求一種老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，包括步驟a.提取來自人的樣本的基因組DNA；b.根據至少2個老年痴呆相關基因的每一個分別設計一對Taqman探針對和一對引物對，所述Taqman探針對的5』端和3』端分別標記螢光報告基團和螢光淬滅基團，分別對所述基因組DNA進行螢光定量PCR擴增；c.根據螢光定量PCR擴增結果來判斷所述至少2個老年痴呆相關基因是否發生突變。2.根據權利要求1所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述老年痴呆相關基因的數目是5個。3.根據權利要求2所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述老年痴呆相關基因是AP0E1基因、AP0E2基因、CYP46基因、CTSD基因和ILIA基因。4.根據權利要求3所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述T叫man探針對和所述引物對用於檢測AP0E1基因的rs429358位點，AP0E2基因的rs7412位點，CYP46基因的rs754203位點，CTSD基因的rsl7571位點，ILIA基因的rsl800587位點。5.根據權利要求1所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述T叫man探針對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記禾口VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。6.根據權利要求1所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述T叫man探針對是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記禾口VIC標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。7.根據權利要求1所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述Taqman探針對是SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記禾口VIC標記，3，端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:11禾口SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。8.根據權利要求1所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述Taqman探針對是SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記和TET標記，3'端均標記TAMRA標記，所述引物對是SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。9.根據權利要求1所述的老年痴呆相關位點檢測方法，其特徵在於，所述Taqman探針對是SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標記FAM標記禾口TET標記，3，端均標記TAMRA標記，所述弓|物對是SEQIDNO:19禾口SEQIDN0:20所示的核苷酸序列。全文摘要本發明涉及一種老年痴呆相關位點檢測方法，包括步驟提取來自人的樣本的基因組DNA；根據至少2個老年痴呆相關基因的每一個分別設計一對Taqman探針對和一對引物對，Taqman探針對的5』端和3』端分別標記螢光報告基團和螢光淬滅基團，分別對所述基因組DNA進行螢光定量PCR擴增；根據螢光定量PCR擴增結果來判斷所述老年痴呆相關基因是否發生突變，較佳地，所述老年痴呆相關基因的數目是5個，分別是APOE1基因、APOE2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因，本發明設計巧妙、操作簡單、檢測結果準確可靠，為是否進一步採取有針對性的健康管理以及後續的檢測手段提供參考依據。文檔編號C12Q1/68GK101748189SQ20081004416公開日2010年6月23日申請日期2008年12月22日優先權日2008年12月22日發明者趙翊均,陳奕雄申請人:上海基康生物技術有限公司