用乙醯短桿菌的核苷磷酸化酶合成2』-脫氧鳥苷的方法
2023-10-18 06:52:49
專利名稱：用乙醯短桿菌的核苷磷酸化酶合成2』-脫氧鳥苷的方法
技術領域：
本發明涉及合成2』 -脫氧鳥苷的方法。
背景技術：
2』 -脫氧鳥苷是合成寡脫氧核苷酸等抗病毒、抗腫瘤核酸藥物的重要原料。核苷類衍生物的傳統製造方法大多採用化學合成法，此法的缺點是化學合成步驟多，難度高，周期長且有異構體產生。例如要對天然核苷進行化學修飾，往往需要先對鹼基或核糖活性基團進行保護，反應結束後還要去除保護基團，這樣合成反應的總收率將會降低。用化學法直接將鹼基與核糖縮合，會形成α異構體，要獲得與天然相同的化合物，往往需要複雜的分離方法，而且收率較低。化學合成要用到多種易燃易爆、有毒有害的有機溶劑，對環境的汙染和對人身的傷害不容忽視。因此，近年來人們一直致力於生物酶法合成核苷及其類似物。酶法合成核苷藥物， 不需要保護基團，具有較高催化效率和立體特異性，通常酶法生產的核苷均為結構。特別是嘌呤類核苷的化學合成遠比嘧啶類核苷複雜和困難。所述2』-脫氧鳥苷亦可以DNA為原料，用核酸酶水解生成脫氧核苷酸，然後再用磷酸單酯酶水解，使其生成脫氧核苷，然後從中分離出2'-脫氧尿苷。此方法成本高，而且DNA來源有限，大量生產會受到限制。JP11-137290文獻報導，日本橫關鍵三等應用肺炎克雷伯氏菌 (Klebsillapneumoniae IF03321)核苷磷酸化酶的生產方法，但2，-脫氧鳥苷轉化率僅為 28%。他在 Molecular Catalysis B =Enzymatic, 2000 (10)文獻報導，使用產氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenesAJ-11125)為酶源，以2』 -脫氧尿苷和鳥苷為底物，2』 -脫氧鳥苷轉化率僅為18%。其它亦有用胸苷和2、6_ 二氨基嘌呤生成2、6_ 二氨基2』-脫氧核苷， 再用腺苷脫氨酶處理得到2』 -脫氧鳥苷的方法，但路線太長，成本較高。
發明內容
本發明的目的是提供一種用乙醯短桿菌的核苷磷酸化酶合成2』 -脫氧鳥苷的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。本發明的方法，包括如下步驟(1)將乙醯短桿菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo· 04了2 接入培養
基進行培養，培養獲得的菌體作為核苷酸磷酸化酶備用；所述培養基為常規的，其組分和重量含量包括牛肉膏1%，蛋白腖1%，酵母膏 0. 5%, NaCl 0. 5%，pH 為 7. 0 ；(2)然後將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，脫氧核糖受體的含量為5 40mol/L，脫氧核糖供體濃度為5 40mol/L，磷酸緩衝液濃度為10 50mmol/ L，菌體的溼重加入重量為1 5%，40 65°C反應1 4h，離心，獲得溶液含有2』-脫氧鳥苷的溶液，溶液經HPLC檢測，2』-脫氧鳥苷的轉化率達60%，然後從反應產物中收集2』-脫
氧鳥苷；
所述的脫氧核糖受體選自鳥嘌呤、鳥苷或鳥苷酸，但由於鳥嘌呤在水中溶解度較低，其中以鳥苷酸為最佳；所述的脫氧核糖供體選自2』 -脫氧核糖、2』 -脫氧核糖-1-磷酸，胸苷、2』 -脫氧尿苷或2』 -脫氧胞苷等，但從目前原料來源難易和價格因素考慮，選擇胸苷、2』 -脫氧尿苷或脫氧核糖較好。所述的乙醯短桿菌(Brevibacterium acetylicum) QD96，在已保存於中國微生物菌種保藏管理委員會。保藏號為CGMCCNo. 0472，保藏日期為2000年7月5日，在中國專利 ZL 00125112.0中，該菌種的有關信息，已經進行了充分的描述，本發明不再贅述。HPLC檢測條件色譜柱0DS2-C18柱(4. 6mmX250mm,5ym)流動相5(toimol/LKH2PO4(用H3PO4 調 ρΗ5· 5)和 10% 甲醇。V(KH2PO4) V(甲醇) =9:1。流速L0ml/min檢測波長260nm進樣量20μ 1柱溫25°C。本發明使用乙醯短桿菌QD96的酶合成2』 -脫氧鳥苷，可低成本，高收率地獲得 2』 -脫氧鳥苷，其轉化率可達60%以上。
圖1為脫氧鳥苷反應六種標準品HPLC圖譜。圖2為實施例1的脫氧鳥苷反應液1的HPLC圖譜。
具體實施例方式實施例1在250ml三角瓶中裝入50ml培養基，其中，含牛肉膏1%，蛋白腖1%，酵母膏 0. 5%,NaCl 0. 5%,pH 7. 0，於118°C滅菌30min，冷卻後接入乙醯短桿菌QD96，於30°C振蕩 (200r/min)培養16h，將培養液經4000r/min冷凍離心30min，再用0. 05mol/L磷酸鹽緩衝液(PH7. 0)洗滌，再離心，所得之菌體冷藏保存，作為核苷酸磷酸化酶備用。在IOOml圓底燒瓶中，裝入50ml底物溶液，其中含鳥苷酸和胸苷濃度各為40mol/ L，磷酸緩衝液為25mmol/L，菌體加入量為5% (溼重)，在恆溫水浴中60°C攪拌反應池， 反應完畢，冷凍離心去除菌體和少量胸腺嘧啶沉澱物。然後將溶液經HPLC檢測其中含 24mmol/L脫氧鳥苷，其轉化率達60% (見圖幻。經陰離子交換樹脂分離，可獲得0. 26g脫氧鳥苷。其中，陰離子交換樹脂分離的方法，為公知的方法，在中國專利ZL98110601.3， ZL0213639. 2等中已經有詳細的報導。實施例2在IOOml圓底燒瓶中裝入50ml底物溶液，其中含鳥苷酸和2』-脫氧尿苷濃度各為 40mmol/L，磷酸緩衝液為25mmol/L，菌體加入量為5% (溼重)，以後操作同實施例1。將反應後溶液經HPLC檢測，其中含^mmol/L脫氧鳥苷，其轉化率65%。
權利要求
1.用乙醯短桿菌的核苷磷酸化酶合成2』-脫氧鳥苷的方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)培養乙醯短桿菌(Brevibacteriumacetylicum)QD96-CGMCCNo. 0472 ；(2)然後將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脫氧核糖受體、 脫氧核糖供體和磷酸緩衝液，反應，然後從反應產物中收集2』 -脫氧鳥苷。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的脫氧核糖受體選自鳥嘌呤、鳥苷或鳥苷酸，所述的脫氧核糖供體選自2』 -脫氧核糖、2』 -脫氧核糖-1-磷酸，胸苷、2』 -脫氧尿苷或2』 -脫氧胞苷。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的脫氧核糖受體為鳥苷酸，所述的脫氧核糖供體為胸苷、2』 -脫氧尿苷或脫氧核糖。
4.根據權利要求1 3任一項所述的方法，其特徵在於，所述底物溶液中，脫氧核糖受體的含量為5 40mol/L，脫氧核糖供體濃度為5 40mol/L，磷酸緩衝液濃度為10 50mmol/L，菌體的溼重加入重量為1 5%，40 65°C反應1 4h。
全文摘要
本發明提供了一種應用乙醯短桿菌的核苷磷酸化酶合成2』-脫氧鳥苷的方法，包括如下步驟(1)培養乙醯短桿菌(Brevibacterium acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472；(2)然後將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，含有脫氧核糖受體、脫氧核糖供體和磷酸緩衝液，反應，然後從反應產物中收集2』-脫氧鳥苷。本發明使用乙醯短桿菌QD96的酶合成2』-脫氧鳥苷，可低成本，高收率地獲得2』-脫氧鳥苷，其轉化率可達60％以上。
文檔編號C12P19/32GK102174618SQ20101061173
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者周長林, 曹靜, 李喻, 邱志雲, 邱蔚然, 陸長德 申請人:南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇秋之友核酸藥物工程技術研究中心有限公司