人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法
2023-07-12 21:40:21 1
專利名稱：人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法
技術領域：
本發明涉及幹細胞技術領域，特別涉及一種人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法。
背景技術：
角膜上皮幹細胞(Limbal Stem Cells, LSCs),即角膜緣幹細胞,位於角膜緣上皮基底層，是角膜上皮的唯一細胞來源。角膜上皮幹細胞能夠進行自我更新，以維持這些幹細胞的高度增殖能力。角膜上皮幹細胞可以生成短暫擴充細胞，後者向中央角膜移動，最終進入終末分化，形成角膜上皮細胞。角膜上皮幹細胞不僅可以分化、增生為上皮細胞，更重要的是角膜上皮幹細胞像一道屏障，可以阻止結膜上皮細胞移行至角膜表面，對維持角膜上皮的動態穩定和角膜透明性發揮著極其重要的作用。單眼角膜上皮幹細胞缺乏患者，可以採用自體健眼角膜緣組織移植，以及健眼乾細胞體外擴增後的移植。對於雙眼角膜上皮幹細胞缺乏患者，可以採用異體角膜緣移植，但由於異體移植易發生排斥反應，臨床效果並不理想。近年來，有研究採用自體口腔黏膜上皮細胞體外擴增後移植，但研究發現，體外培養3-4周的口腔黏膜上皮細胞並不能分化為角膜上皮細胞表型，也不表達眼表面上皮細胞特異性的轉錄因子PAX6，粘蛋白表達與正常角膜上皮細胞也存在較大差異。移植於眼表面的口腔黏膜上皮細胞在體內也不能分化為角膜上皮細胞表型。術後短期內角膜雖然維持較好的透明度，長期隨訪發現角膜易產生新生血管。由此可見，角膜上皮重建的理想的細胞來源仍然是自體角膜上皮幹細胞，對於雙眼乾細胞缺乏患者的治療，仍有待於尋找一種能夠分化為正常角膜上皮細胞的「種子細胞」，這也是目前角膜上皮組織工程研究的重點。除了成體幹細胞，多能幹細胞(pluripotent Stem Cells)包括胚胎幹細胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和誘導性多能幹細胞(Induced Pluripotent StemCells,iPSCs))也被用於在體外誘導產生角膜`上皮幹細胞。Homma(人名)等人將鼠胚胎幹細胞培養於IV型膠原上，成功誘導出上皮幹細胞，並用於修復鼠角膜上皮損傷。Hiroki (人名)等將PAX6基因導入小鼠胚胎幹細胞，成功誘導出具有角膜上皮細胞特徵的上皮樣細胞。最近有研究將人胚胎幹細胞培養於IV型膠原上，並用人角膜緣成纖維細胞條件培養基共培養，成功誘導出上皮樣細胞，但進一步分化產生的終末分化細胞不但具有角膜上皮表型，還具有皮膚表型。由於胚胎幹細胞具有無限增殖潛能，使其成為治療角膜上皮幹細胞缺乏的一種很有潛力的種子細胞來源。但是，胚胎幹細胞的分化調控，倫理問題，以及異體移植的排斥反應等問題成為人胚胎幹細胞研究的障礙。因此，為角膜幹細胞移植找到合適的種子細胞來源，是目前亟待解決的問題。
發明內容
本發明提供一種快速、簡便、高效，而且成本較低的人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法，以大量獲取角膜上皮幹細胞。
為了實現上述目的，本發明提供以下技術方案:—種人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法，其包括步驟:A、基於患者的眼表組織，分離人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞；B、在所述成纖維細胞和人結膜上皮細胞導入基因0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4(基因名稱)，誘導產生誘導性多能幹細胞(iPSCs)；C、在所述 iPSCs 中加入 IV 型膠原、米用 KSFM(Keratinocyte Serum-FreeMedium,KSFM)細胞培養基和 SHEM (Supplement Hormonal EpithelialMedium, SHEM)細胞培養基輪流誘導的方法，對所述誘導性多能幹細胞iPSCs向角膜上皮樣細胞定向分化。 優選地，在所述步驟A中，採用眼表組織來源的人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞進行誘導性多能幹細胞系的建立；優選地，在所述步驟B中，採用鹼性磷酸酶染色、免疫螢光染色、畸胎瘤實驗驗證分化潛能及基因晶片分析的方法進行細胞系鑑定。優選地，在所述步驟C中，還進行角膜上皮樣細胞表型鑑定。通過實施以上技術方案，具有以下技術效果:本發明提供的分化方法快速、簡便、高效，而且成本較低，可大量獲得角膜上皮幹細胞。
具體實施例方式為了更好的理解本發 明的技術方案，下面詳細描述本發明提供的實施例。本發明實施例提供一種人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化方法，該方法包括步驟:A、基於患者的眼表組織，分離人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞；B、在所述成纖維細胞和人結膜上皮細胞導入基因0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4，誘導產生 iPSCs (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs,誘導性多能幹細胞；C、在所述誘導性多能幹細胞中加入IV型膠原、KSFM細胞培養基和SHEM培養基輪流誘導的方法，對所述iPSCs向角膜上皮樣細胞定向分化。進一步的，在其他實施例中，所述步驟A中具體包括:採用眼表組織來源的人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞進行誘導性多能幹細胞系的建立；採用人眼表組織來源的體細胞建立誘導性多能幹細胞系，更具有向角膜上皮樣細胞定向分化的優勢。所述步驟B中，採用鹼性磷酸酶染色、免疫螢光染色、畸胎瘤形成及基因晶片分析的方法進行誘導性多能幹細胞系鑑定。進一步的，在其他實施例中，在所述步驟C中，還進行細胞表型鑑定。在步驟B中，誘導性多能幹細胞(iPSCs)誘導結果:逆轉錄病毒導入多能基因後，從第4天開始細胞形態會有顯著改變，大部分細胞增殖旺盛，個頭變小一些，變得比較規則。病毒侵染後24-30天左右，iPSCs克隆形成，細胞變圓，細胞核所佔比例增大，細胞形態與胚胎幹細胞極為相似。在所述步驟B中，誘導性多能幹細胞系的鑑定:iPSCs克隆形成之後，須鑑定誘導的iPS細胞是否具有與胚胎幹細胞類似的特徵，即多能性鑑定。本實驗分別採用鹼性磷酸酶染色、免疫螢光染色、畸胎瘤實驗驗證分化潛能及基因晶片分析的方法對所誘導的iPS細胞進行了鑑定。
(I)、鹼性磷酸酶染色鑑定iPS細胞的幹細胞特性未分化的ES細胞高度表達鹼性磷酸酶，因此一般用鹼性磷酸酶染色對iPS細胞的幹細胞特性進行初步檢測。並可根據染色顯示的克隆數計算iPS誘導效率。逆轉錄病毒侵染30天左右,無論是結膜基質成纖維細胞(HumanConjunctival Stromal Fibroblast,HCjSF)及人結膜上皮細胞(HumanConjunctival Epithelium, HCjE)均形成許多 iPSCs克隆，經鹼性磷酸酶染色，這些克隆大部分呈陽性，表明這些iPS細胞具有良好的胚胎幹細胞特性。計算克隆形成率後發現，基質成纖維細胞(HCjSF)的iPSCs誘導效率大約為0.1-0.5%，而結膜上皮細胞(HCjE)的iPSCs誘導效率則明顯高於HCjSF，可達到1_2%。(2)、免疫螢光染色檢測胚胎幹細胞標誌物的表達情況未分化的人胚胎幹細胞表達某些特異的幹細胞標誌物，比如多能幹細胞基因SSEA4、TRA-1-81、NAN0G、0CT4、LIN28(基因名稱)等。通過免疫螢光染色，檢測了所誘導的iPS細胞中這些幹細胞標誌物的表達情況。本實驗所誘導的HCjSF-1PSCs和HCjE-1PSCs均表達SSEA4、TRA-1-81、NAN0G、0CT4、LIN28等人胚胎幹細胞標誌物，而不表達鼠類胚胎幹細胞特異基因SSEA-1 (基因名稱)，說明本實驗所誘導的HCjSF-1PSCs和HCjE-1PSCs在胚胎幹細胞標誌物的表達方面與人胚胎幹細胞相似，胚胎幹細胞特性良好。(3)、胎瘤實驗驗證誘導性多能幹細胞(iPSC)的多能性分化潛能將誘導性多能幹細胞(iPSC)注射入免疫缺陷性小鼠體內可以形成畸胎瘤，含有3種胚層類型的組織細胞，說明本實驗所誘導的HCjSF-1PSCs和HCjE-1PSCs在多能性與人胚胎幹細胞相似，誘導性多能幹細胞(iPSC)的胚胎幹細胞特性良好。(4)、基因晶片分析HCjSF-1PSCs與ESCs在全基因表達譜上的相似程度
本實驗選取HCjSF-1PSCs進行基因晶片分析。先分別提取HCjSF_iPSCs、HCjSF和ESCs的總RNA (核糖核酸)，進行基因晶片分析後，用軟體對所得數據進行處理。基因晶片分析結果表明，本實驗所誘導的HCjSF-1PSCs與ESCs在全基因表達譜上有高度的相似性，兩者的同源率接近99%。作為對照，HCjSF-1PSCs與母細胞HCjSF在全基因表達譜上的相似程度明顯不如HCjSF-1PSCs與ESC，兩者的同源率僅為46%。在系統樹圖中，HCjSF-1PSCs與ESCs歸屬同一聚類，而iPSCs的母細胞HCjSF則歸屬另一聚類。這些結果表明本實驗所誘導的HCjSF-1PSCs與ESCs在全基因表達譜上有較高的相似性，細胞重編程狀況良好，胚胎幹細胞特性明顯。在所述步驟C中，HCjSF-1PSCs向角膜上皮幹細胞的定向分化及細胞表型鑑定(I)、在IV型膠原上用SHEM條件培養基誘導HCjSF-1PSCs定向分化的情況角膜上皮幹細胞直接位於基底膜上，IV型膠原是基底膜的重要成分，可能對維持角膜上皮幹細胞特性起重要作用。SHEM培養基中所含的微量因子有利於維持上皮幹細胞特性，普遍被應用於上皮幹細胞的克隆化培養，也是目前眼科領域中廣泛應用於角膜緣及人結膜上皮細胞克隆化培養的一種培養基。因此，將誘導所得的HCjSF-1PSCs接種於0.5mg/ml IV型膠原包被的培養板中，待細胞貼壁並長到一定大小後，用SHEM培養基誘導HCjSF-1PSCs分化I周，期間定期觀察細胞形態變化。隨著條件培養時間的延長，細胞逐漸變得扁平，原有的胚胎幹細胞形態逐漸消失。I周后，對這些細胞進行免疫螢光染色，檢測定向分化後的細胞表型，以及iPSCs進入終末分化的能力。分化細胞表達某些上皮幹細胞標誌物的蛋白P63、ABCG2和K19(基因名稱)，但未見Κ12(基因名稱)等終末分化的角膜上皮細胞特異性標誌物的表達。提示該方法能夠在一定程度上誘導HCjSF-1PSCs向上皮幹細胞方向分化。(2)、在IV型膠原上用KSFM條件培養基誘導HCjSF-1PSCs定向分化的情況KSFM培養基是一種角質化無血清培養基，主要用於培養角質化細胞，小鼠角膜上皮幹細胞系TKE2 (細胞系名稱)可在KSFM培養基中維持幹細胞特性，角膜上皮細胞和人結膜上皮細胞也可在KSFM培養基中增殖。因此，將誘導所得的HCjSF-1PSCs接種於
0.5mg/ml IV型膠原包被的培養板中，待細胞貼壁並長到一定大小後，用KSFM培養基誘導HCjSF-1PSCs分化I周，期間定期觀察細胞形態變化。剛開始時HCjSF-1PSCs分化狀況良好，克隆周邊細胞分化較早，細胞形態與培養於KSFM培養基中的角膜上皮細胞極為相似。然而隨著時間的延長，這些分化細胞逐漸死亡，未能延續分化狀態並有效增殖。以上結果顯示，iPSCs在KSFM培養集中增殖受到抑制。雖然如此，該結果還是能在一定程度上說明KSFM培養基有誘導HCjSF-1PSCs進入終末分化的潛力。下面提供上述方法的應用例，該應用例包括步驟:(I)、人結膜基質成纖維細胞(Human Conjunctival Stromal Fibroblast,HCjSF)及人結膜上皮細胞(Human Conjunctival Epithelium, HCjE)的培養。(2)從Stevens-Johnson症候群、眼化學傷及熱燒傷等嚴重眼表面疾病導致的全形膜緣幹細胞缺乏患者的眼表面活檢，取得3 X 3_大小結膜組織，將整個組織塊(上皮朝上)置於KSFM培養基中培養一周，待上皮細胞長出後挖去中央組織塊，繼續於KSFM培養基中培養上皮細胞一周。試劑配製:成纖維細胞培養基:DMEM培養基，10 % FBS, 100U/ml青鏈黴素，IOOU/ml兩性黴素B。KSF M培養基(500ml):500ml KSFM培養基，0.9ml牛腦垂體提取物(bovinepituitary extract, ΒΡΕ)，7.5 μ g 表皮生長因子(EGF)，100U/ml PS, lOOU/ml 兩性黴素 B。iPS細胞誘導流程包括:(I)按脂質體轉染法包裝誘導所需的4種逆轉錄病毒(0CT4、S0X2、c-MYC和KLF4)，同時包裝pMX-GFP螢光病毒作為對照。(2)、侵染前一天將HCJSF和HCjE消化後計數，接種於12孔板，2 X 104/孔。(3)、侵染當天(Day 0，記為DO)，收集48h病毒上清後，每IOcm板病毒上清用
0.45 μ m濾膜過濾到15ml離心管中，每管再加入2.5_3ml新鮮培養基，加入終濃度6_8 μ g/ml polybrene,混勻。將HCjSF和HCjE培養基吸掉，加入病毒上清，S0X2，KLF4，0CT4, c-MYC四種病毒(KOSM)等體積，同時用pMX-GFP病毒侵染HCjSF和HCjE作為對照。(4)、第二天(Day 1，記為Dl)做病毒第二次侵染，步驟同病毒第一次侵染。D2，第二次侵染完，換為iPS-Ι培養基(無VPA)。通常，GFP侵染效率在D2會在70%以上，D5，復甦小鼠成纖維滋養層細胞(MEF)到IOcm板，1-1.25X106/板。D6，將MEF滋養層細胞培養基換為iPS-Ι培養基KOSM侵染的HCJSF或HCjE用0.05%胰酶消化後計數，接種1-10 X 104/10cm板到滋養層細胞上。D7，換為iPS-Ι培養基+Valproic acid (丙戊酸，VPA)(通常VPA連續處理7-10天)。D14-17，換為iPS_2培養基。D24-30，觀察並拍照記錄iPSCs克隆形成，之後可進行篩選與培養。試劑配製:iPS-Ι 培養基(500ml):385ml DMEM/F12, 50ml Defined FBS (Hyclone), 50ml KSR,5ml L-GlutaMax (100 X), 5ml NEAA IOmM(IOOX), lml2-Mecaptoenthanol 55mM(購買自GIBCO), 500 μ I bFGF 8 μ g/ml (1000 X)。(抗生素可選加，按標準量的一半加，培養基2-3周內使用)iPS-2 培養基(500ml):385ml DMEM/F12,100ml KSR, 5ml L-GlutaMax (100 X)，5mlNEAA IOmM(IOOX),Iml 2-Mecaptoenthanol 55mM(GIBCO),500ulbFGF 8 μ g/ml(1000X)。(抗生素可選加，按標準量的一半加，培養基2-3周內使用)。鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)溶液(8μ g/ml):10 μ g bFGF, 1.25ml 0.1 % BSAin PBS。(0.22 μ M 過濾，_20°C保存)。Valproic acid (丙戊酸，VPA溶液200 X):將VPA加入DMEM/F12培養基中，配成200mM 溶液。(0.22μπι 過濾，-20°C°C保存)。iPS細胞的培養與傳代，包括:(I)、待iPSCs克隆長到一定大小時即需進行傳代。傳代前一天4°C溶解Geltrex。根據實驗用量，每Iml Geltrex(購買自GIBC0)加入29ml 4°C保存的DMEM/F12培養基(培養基名稱，購買自GIBC0)，配成Geltrex溶液，混勻。根據平板大小，加入適量的Geltrex溶液(比如lml/35mm孔)；將裝有Geltrex溶液的培養板置於37°C放置I小時，等待Geltrex溶液形成Geltrex膠。然後將培養板取出置於超淨臺中I小時，即可用於iPS細胞傳代。細胞間照紫外30分鐘，在酒精燈上將玻璃細端拉細，弄彎製作圓頭吸管。鏡下用圓頭吸管將選好的iPSCs克隆與MEF滋養層分離並切割為數小塊，吸出放入裝有Geltrex塗層細胞的板中。一般iPS細胞需要每天更換新鮮培養基，以保證細胞狀態良好，保持高度去分化狀態。針對出現少量分化，儘早刮去分化細胞，如果分化嚴重並持續出現，放棄。只留形態穩定類似ES細胞的克隆。誘導iPS細胞向角膜上皮幹細胞定向分化，包括:(I)用IV型膠原包被培養板:1、配製0.5m g/ml IV型膠原溶液。2、根據培養板面積加入適量IV型膠原溶液包被培養板。(如2cm2孔加入200 μ IIV型膠原溶液)，4°C孵育過夜。3、第二天接種細胞前，吸掉多餘的IV型膠原溶液，用I XPBS洗I遍，即可用於細胞接種。試劑配製:IV型膠原溶液:將IV型膠原溶解於0.25%醋酸中，配成0.5mg/ml IV型膠原溶液。4°C溶解3小時，間歇性振蕩。(2)條件培養基對iPS細胞定向分化的誘導:將iPS細胞接種於IV型膠原包被的培養板中。待克隆長到一定大小後，分別用SHEM培養基、KSFM培養基以及這兩種培養基輪流誘導(先用KSFM培養基誘導2天，再換成SHEM培養基誘導2天，接著又換成KSFM培養基誘導2天，如此反覆)的方法誘導iPS細胞進行定向分化。iPS細胞定向分化後的細胞表型鑑定:誘導過程中對細胞形態進行連續拍照觀察，以記錄細胞形態變化過程。條件培養基誘導I周后，對細胞進行固定，進行免疫螢光染色，從蛋白質水平檢測分化效果。以上對本發明實施例所提供的一種人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化方法進行了詳細介紹，對於本領域的一般技術人員，依據本發明實施例的思想，在具體實施方式
及應用範圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
權利要求
1.一種人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法，其特徵在於，包括步驟: A、基於患者的眼表組織，分離人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞； B、在所述成纖維細胞和人結膜上皮細胞導入基因Oct4、sox2、c-Myc和Klf4，產生誘導性多能幹細胞iPSCs ； C、在所述iPSCs中加入IV型膠原、採用KSFM細胞培養基和SHEM細胞培養基輪流誘導的方法，對所述誘導性多能幹細胞iPSCs向角膜上皮樣細胞定向分化。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟A具體包括:採用眼表組織來源的人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞進行誘導性多能幹細胞系的建立；所述步驟B中，採用鹼性磷酸酶染色、免疫螢光染色、畸胎瘤形成及基因晶片分析的方法進行誘導性多能幹細胞系鑑定。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在所述步驟C中，還進行角膜上皮樣細胞表 型 鑑定。
全文摘要
本發明提供一種人誘導性多能幹細胞向角膜上皮樣細胞定向分化的方法，其包括步驟A、基於患者的眼表組織，分離人結膜基質成纖維細胞和人結膜上皮細胞；B、在所述成纖維細胞和人結膜上皮細胞導入基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，誘導產生iPSCs；C、在所述iPSCs中加入IV型膠原、採用KSFM細胞培養基和SHEM細胞培養基輪流誘導的方法，對所述iPSCs向角膜上皮樣細胞定向分化。本發明提供的分化方法快速、簡便、高效，可大量獲得角膜上皮幹細胞。
文檔編號C12N5/071GK103184187SQ201110448358
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者連祺周 申請人:連祺周