一種具有生物活性藥物的殼聚糖微球及其製備方法
2023-10-10 15:21:19 3
專利名稱：一種具有生物活性藥物的殼聚糖微球及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥工程的藥物製劑領域，具體地說是涉及一種粒徑均一、且具有生物活性藥物的殼聚糖微球，及其製備方法。
背景技術：
生物技術藥物的研究重點之一是應用DNA重組技術開發可應用於臨床的多肽激素、多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、細胞因子模擬肽及用於心血管疾病的多肽及蛋白質。據統計目前已有723種生物技術藥物正在接受FDA審評(包括I～III期臨床及FDA評估)，700種藥物正處於早期研究(臨床前)，還有200種藥物已進入最後批准階段(III期臨床與FDA評估)。正是由於多肽藥物在預防和治療疾病上的巨大作用，各國對多肽藥物的研發都非常重視，我國也已將多肽藥物作為「十五」期間生物醫藥研究的重點方向之一。
由於多肽藥物能夠迅速被胃腸道消化酶降解破壞，所以臨床應用受到很大限制，一般只能注射給藥。但多肽藥物在血液中生物半衰期普遍較短，故需頻繁注射，造成患者心理、身體上的痛苦和經濟上的巨大負擔。因此開發多肽藥物的長效、控釋製劑能夠極大的方便患者，減少醫藥費用，具有重要的現實意義和廣闊的市場前景。製備控釋製劑通常是使用化學交聯法，溶劑揮發法等製備方法將藥物包埋在聚合物中製成微球。但這類方法製備的藥物微球的粒徑不均一，從而不利於此類多肽藥物的精確給藥；而且該類方法使用的化學交聯劑和有機溶劑，易殘留在載藥微球中，給藥物的安全使用帶來隱患。另外，現有方法製備的此類多肽藥物微球，其包埋後的藥物的生物活性也不高。因此，製備出粒徑均一、高生物活性、無毒性物質殘留的載藥微球是這類藥物真正走進臨床的關鍵。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術製備的藥物微球的粒徑不均一、生物活性不高、有毒性物質殘留的缺陷，從而提供一種粒徑均一的、無毒的、具有生物活性藥物的殼聚糖微球。
本發明的另一目的是提供上述具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法。
本發明提供的具有生物活性藥物的殼聚糖微球，由生物活性藥物與殼聚糖組成，兩者的質量比是1∶1～20，生物活性藥物均勻分散在殼聚糖中。
所述的殼聚糖的分子量是50～160萬，脫乙醯度是66～98％，可以是單一殼聚糖，也可是由具有不同分子量和脫乙醯度的殼聚糖組成的混合物。
本發明提供一種上述具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，包括如下的步驟1)將生物活性藥物溶解或分散在0.5～5％(w/v)的殼聚糖溶液中作為水相，生物活性藥物與殼聚糖的質量比是1∶1～40；所述的殼聚糖的分子量是50～160萬，脫乙醯度是66～98％，可以是單一殼聚糖，也可是由具有不同分子量和脫乙醯度的殼聚糖組成的混合物所述的殼聚糖溶液所用的溶劑是甲酸、乙酸、丙酸、鹽酸、檸檬酸、酒石酸、或穀氨酸；2)將油相和佔其0.1～4v％的表面活性劑一起攪拌5～30分鐘，轉速為500～2000轉/分鐘；所述的油相是液體石蠟、棉籽油、花生油、玉米油、大豆油、橄欖油、葵花籽油、或其與石油醚的混合物；所述的表面活性劑是Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80、Span 83、Span 85、Tween20、Tween40、Tween60、Tween61、Tween80、Tween81、Tween85或其任意比例的混合物；3)將步驟1)的水相加入到步驟2)的油相中，攪拌形成穩定的乳液；其中水相與油相的體積比是1∶1～20，攪拌30～60分鐘，轉速為500～2000轉/分鐘；4)向步驟3)製得的乳液中加入濃度為1～65％(w/v)的硫酸銨溶液，殼聚糖溶液與硫酸銨溶液的體積比為1∶1～20，繼續攪拌0.5～5小時後停止；5)離心分離步驟4)製得的分散體系，將上層液體倒出，分出下層硫酸銨沉澱的微球，依次用純水、石油醚、無水乙醇充分洗滌，低溫真空乾燥後即得本發明的具有生物活性藥物的殼聚糖微球。
使用本方法得到的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的粒徑均一，其直徑分布係數(如式I定義，CV值)可控制在25％以內，在優化條件下可控制在15％以內，直徑可在25～2000微米內自由調節。
直徑分布係數(coefficientof variation，cv)＝{[(di-d)2/N]1/2/d}×100％(式I)上式中，di為各個微球的直徑，d為數平均直徑，N為用於計算直徑的微球數量，N＞300個。
本發明提供的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的生物活性藥物的包埋率在90％以上，在優化的條件下達到99.2％；生物活性藥物包埋後，藥物的活性在50％以上，在優化的條件下達到93.5％；在37℃下，一定釋放介質中微球可以控制釋放出有活性的藥物。
本發明使用乳化分散/硫酸銨沉澱法製備的殼聚糖微球作為藥物的載體，在保持了殼聚糖的良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性的同時，解決了現有製備方法中藥物活性低、粒度分布廣的問題，可以得到粒徑均一的藥物微球，且較高的保留了藥物的生物活性，而且具有控釋作用，有望在大規模生物技術藥物的微球製劑製備上得到使用。
本發明提供的具有生物活性藥物的殼聚糖微球及其製備方法還能夠帶來下列效應1、本發明提供的粒徑均一的具有生物活性藥物的殼聚糖微球，除可用作該類藥物的長效注射製劑外，調節製備參數還可作為口服製劑和靶向製劑使用；2、本發明提供的製備方法可用於所有的生物活性藥物的包埋，如蛋白質、核酸、酶、激素、疫苗等生物活性物質，溫和的製備條件可保持這類藥物的生物活性；3、本發明提供的溫和的製備方法，也可用於包埋化學藥物。
圖1實施例1製備的溶菌酶殼聚糖微球的放大40倍的掃描電鏡圖。
圖2比較例1製備的溶菌酶殼聚糖微球的放大40倍的掃描電鏡圖。
圖3實施例1和比較例1製備的溶菌酶殼聚糖微球的粒徑分布圖(測定儀器雷射粒度儀COULTER LS230)，其中曲線1代表實施例1製得的微球，曲線2代表比較例1製得的微球。
圖4實施例1製備的溶菌酶殼聚糖微球在37℃，pH＝7.4的PBS緩衝液中的釋放曲線。
具體實施例方式
實施例1(乳化分散/硫酸銨沉澱法)將2g殼聚糖(分子量60萬，脫乙醯度87.2％)溶於100mL 0.2mol/L乙酸溶液製成殼聚糖溶液。取10mL該溶液，溶入30.2mg溶菌酶形成水相。取50mL液體石蠟(油相)加入到反應器中，加入1mLspan80和1mLTween80，攪拌，轉速為1500轉/分鐘，分散10分鐘後，加入上述配製的溶有溶菌酶的殼聚糖溶液(水相)，以同樣的轉速繼續攪拌分散30分鐘，形成穩定的乳液；向此乳液中加入濃度為50％(w/v)的硫酸銨溶液40mL，繼續攪拌1小時後停止。離心分離，將上層液體倒出，分出下層硫酸銨沉澱的微球，依次用純水、石油醚、無水乙醇充分洗滌沉澱，室溫真空乾燥，即得本發明的包埋有溶菌酶的殼聚糖微球。
用雷射粒度儀(COULTER LS230)測試包埋有溶菌酶的殼聚糖微球的直徑，平均直徑是153.24微米，其形態如圖1的掃描電鏡圖所示，其粒徑分布係數是20.01％，如圖3所示，粒徑均一。
取100mg上述包埋有溶菌酶的殼聚糖微球放入醋酸-醋酸鈉緩衝液中降解，定時用還原糖法測定溶菌酶的活性，並用紫外分光光度法在A＝280nm處測定溶菌酶的濃度，16小時後溶菌酶全部釋放出後，測定其濃度，並換算為包埋率。在該條件下溶菌酶的包埋率是92.4％。釋放出的溶菌酶的活性為包埋前活性的93.1％。
將溶菌酶的殼聚糖微球置於37℃，pH＝7.4的PBS緩衝液中，以100轉/分鐘的速度振蕩，每隔一定時間取樣，用紫外分光光度法在A＝280nm處測定溶菌酶的濃度。溶菌酶在該條件下可以以一定速度釋放，見圖4。
比較例1(戊二醛交聯法)將2g殼聚糖(分子量60萬，脫乙醯度87.2％)溶於100mL 0.2mol/L乙酸溶液製成殼聚糖溶液。取10mL該溶液，溶入30.2mg溶菌酶形成水相。取50mL液體石蠟(油相)加入到反應器中，加入1mLspan80和1mLTween80，攪拌，轉速為1500轉/分鐘，分散10分鐘後，加入上述配製的溶有溶菌酶的殼聚糖溶液(水相)，以同樣的轉速繼續攪拌分散30分鐘後，加入10mL 15％(v/v)的戊二醛水溶液，繼續攪拌1小時後停止。離心分離，用石油醚充分洗滌，室溫真空乾燥後即得用戊二醛交聯的包埋有溶菌酶的殼聚糖微球。用雷射粒度儀(COULTER LS230)測試其直徑，平均直徑149.5微米，其形態如圖2的掃描電鏡圖所示，其粒徑分布係數是51.29％，如圖3所示，粒徑不均一。
取100mg用戊二醛交聯法製備的溶菌酶的殼聚糖微球放入醋酸-醋酸鈉緩衝液中降解，定時用還原糖法測定溶菌酶的活性，並用紫外分光光度法在A＝280nm處測定溶菌酶的濃度，25小時後溶菌酶全部釋放出後，測定其濃度，並換算為包埋率。在該條件下溶菌酶的包埋率是67.2％。釋放出的溶菌酶的活性為包埋前活性的5.46％。
實施例2(乳化分散/硫酸銨沉澱法)將3g殼聚糖(分子量85萬，脫乙醯度76.3％)溶於100mL 0.25mol/L乙酸溶液製成殼聚糖溶液。取10mL該溶液，溶入10.5mg溶菌酶形成水相。取50mL花生油(油相)加入到反應器中，加入0.5mLspan80和1.0mLTween60，攪拌，轉速為1000轉/分鐘，分散10分鐘後，加入上述配製的溶有溶菌酶的殼聚糖溶液(水相)，以同樣的轉速繼續攪拌分散30分鐘後，加入濃度為60％(w/v)的硫酸銨溶液80mL，繼續攪拌1小時後停止。離心分離，依次用純水、石油醚、無水乙醇充分洗滌沉澱，室溫真空乾燥後即得本發明的包埋有溶菌酶的殼聚糖微球。用雷射粒度儀(COULTER LS230)測試包埋有溶菌酶的殼聚糖微球的直徑，平均直徑是284.3微米，其粒徑分布係數是22.41％。
取100mg包埋有溶菌酶的殼聚糖微球放入醋酸-醋酸鈉緩衝液中降解，定時用還原糖法測定溶菌酶的活性，並用紫外分光光度法在A＝280nm處測定溶菌酶的濃度，20小時後溶菌酶全部釋放出後，測定其濃度，並換算為包埋率。在該條件下溶菌酶的包埋率是98.4％。釋放出的溶菌酶的活性為包埋前活性的91.1％。
實施例3(乳化分散/硫酸銨沉澱法)將4g殼聚糖(分子量101萬，脫乙醯度67.9％)溶於100mL 0.25mol/L乙酸溶液製成殼聚糖溶液。取10mL該溶液，溶入100.5mg溶菌酶形成水相。取50mL大豆油(油相)加入到反應器中，加入1mLspan80和1mLTween81，攪拌，轉速為1200轉/分鐘，分散10分鐘後，加入上述配製的溶有溶菌酶的殼聚糖溶液(水相)，以同樣的轉速繼續攪拌分散30分鐘後，加入濃度為10％(w/v)的硫酸銨溶液60mL，繼續攪拌1小時後停止。離心分離，依次用純水、石油醚、無水乙醇充分洗滌沉澱，室溫真空乾燥後即得本發明的包埋有溶菌酶的殼聚糖微球。用雷射粒度儀(COULTER LS230)測試包埋有溶菌酶的殼聚糖微球的直徑，平均直徑是200.4微米，其粒徑分布係數是19.08％。
取100mg包埋有溶菌酶的殼聚糖微球放入醋酸-醋酸鈉緩衝液中降解，定時用還原糖法測定溶菌酶的活性，並用紫外分光光度法在A＝280nm處測定溶菌酶的濃度，21小時後溶菌酶全部釋放出後，測定其濃度，並換算為包埋率。在該條件下溶菌酶的包埋率是90.4％。釋放出的溶菌酶的活性為包埋前活性的83.1％。
權利要求
1.一種具有生物活性藥物的殼聚糖微球，由生物活性藥物與殼聚糖組成，兩者的質量比是1∶1～40，生物活性藥物均勻分散在殼聚糖中。
2.如權利要求1所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球，其特徵在於所述的殼聚糖的分子量是50～160萬，脫乙醯度是66～98％。
3.如權利要求1所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球，其特徵在於所述的殼聚糖為由具有不同分子量和脫乙醯度的殼聚糖組成的混合物。
4.一種權利要求1所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，包括如下的步驟1)將生物活性藥物溶解或分散在0.5～5％(w/v)的殼聚糖溶液中作為水相，生物活性藥物與殼聚糖的質量比是1∶1～40；2)將油相和佔其0.1～4v％的表面活性劑一起攪拌5～30分鐘，轉速為500～2000轉/分鐘；3)將步驟1)的水相加入到步驟2)的油相中，攪拌形成穩定的乳液；其中水相與油相的體積比是1∶1～20，攪拌30～60分鐘，轉速為500～2000轉/分鐘；4)向步驟3)製得的乳液中加入濃度為1～65％(w/v)的硫酸銨溶液，殼聚糖溶液與硫酸銨溶液的體積比為1∶1～20，繼續攪拌0.5～5小時後停止；5)離心分離步驟4)製得的分散體系，將上層液體倒出，分出下層硫酸銨沉澱的微球，洗滌，乾燥，得到本發明的具有生物活性藥物的殼聚糖微球。
5.如權利要求4所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於所述的殼聚糖的分子量是50～160萬，脫乙醯度是66～98％。
6.如權利要求4所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於所述的殼聚糖是由具有不同分子量和脫乙醯度的殼聚糖組成的混合物。
7.如權利要求4所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於所述的殼聚糖溶液所用的溶劑是甲酸、乙酸、丙酸、鹽酸、檸檬酸、酒石酸、或穀氨酸。
8.如權利要求4所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於所述的油相是液體石蠟、棉籽油、花生油、玉米油、大豆油、橄欖油、葵花籽油、或其與石油醚的混合物。
9.如權利要求4所述的具有生物活性藥物的殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於所述的表面活性劑是Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80、Span 83、Span 85、Tween20、Tween40、Tween60、Tween61、Tween80、Tween81、Tween85或其任意比例的混合物。
全文摘要
本發明涉及一種具有生物活性藥物的殼聚糖微球及其製備方法。其為將生物活性藥物溶解或分散於殼聚糖的溶液中，與加有表面活性劑的油相物質混合，經攪拌形成穩定的乳液後加入一定濃度的硫酸銨水溶液，攪拌沉澱一定時間後分離洗滌，真空乾燥後即得到包埋了生物活性藥物的粒徑均一的殼聚糖微球控釋載體。該方法解決了現有製備方法中藥物活性低、粒度分布廣的問題，可以得到粒徑均一的藥物微球，且較高的保留了藥物的生物活性，而且具有控釋作用，有望在大規模生物技術藥物的微球製劑製備上得到使用。
文檔編號A61K9/16GK1833726SQ20051005538
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月18日 優先權日2005年3月18日
發明者李巧霞, 宋玉珍, 仰振球, 樊紅雷 申請人:中國科學院過程工程研究所