真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用的製作方法
2023-10-05 00:47:14 2
真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於水果保鮮【技術領域】，具體提供了一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。本發明提供了一種實施該應用的方法，將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配製成塗膜保鮮液，將枇杷放在上述塗膜保鮮液中浸1~4min後取出，晾乾，在常溫條件下貯藏；所述塗膜保鮮液中真姬菇凝集素的質量百分比為：0.1％-0.2%，所述塗膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質量百分比為：1％-2%。該應用採用生物天然提取物，應用到水果保鮮中，安全、無毒、有效，為鮮果保鮮開發有效方法。
【專利說明】真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於水果保鮮【技術領域】，具體涉及一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
【背景技術】
[0002]水果由於含有豐富的碳水化合物、有機酸、維生素及無機鹽等，因而成為了人類重要的營養源。水果不僅味美可口，還具有降血壓、減緩衰老、減肥瘦身、預癌症等優點。但水果生產存在較強的季節性、區域性以及水果本身的易腐性，這使得水果貯藏保鮮的問題日趨突出。目前，國內外在水果保鮮領域採用的保鮮手段主要有低溫保鮮、氣調保鮮、化學保鮮、生物保鮮等。雖然目前水果保鮮技術類型多樣，但由於人們不僅對水果保鮮傳統上的色、香、味要求提高，也更加關注食品的安全性，新型的保鮮技術主要集中在生物保鮮領域。生物保鮮技術在水果中的應用將主要集中在微生物菌體及其代謝產物的保鮮、生物天然提取物的保鮮及利用遺傳基因進行保鮮三方面。目前，該類保鮮技術還處於研究階段，作用機理不明確，相關技術也不成熟，還未得到廣泛的應用。但是安全、無毒、環保的新型生物保鮮技術將會成為今後保鮮行業發展的重要方向。擬為開發安全、無毒、有效的天然抑菌齊?、保鮮劑提供一定的理論基礎，為鮮果保鮮開發有效方法，於是研究一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用具有重要的意義。
【發明內容】
[0003]為了克服上述缺陷，本發明提供了一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
[0004]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用。
[0005]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
[0006]所述真姬菇凝集素是採用真姬菇為原料，結合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩衝液透析技術提取得真姬燕凝集素粗品，利用DEAE-Sepharose Fast Flow (二乙胺乙基_瓊脂糖凝膠)離子交換層析技術進行凝集素粗品純化收集沉澱，經過脫鹽後冷凍乾燥得真姬菇凝集素。
[0007]所述真姬菇脫蛋白多糖是採用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進行提取真姬菇抑菌多糖，經醇沉後收集多糖沉澱為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應用Sevag法脫除其中的蛋白成分進行純化，脫除蛋白後的多糖成分再經過真空冷凍乾燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0008]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配製成塗膜保鮮液，將枇杷放在上述塗膜保鮮液中浸Ilmin後取出，晾乾，在常溫條件下貯藏；所述塗膜保鮮液中真姬菇凝集素的質量百分比為:0.1% -0.2%，所述塗膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質量百分比為:1% -2%。
[0009]所述真姬菇凝集素具體製備步驟為:真姬菇以質量/體積比為1:(3~7)g/ml加入濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，在4°C下浸提24h，4°C、轉速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%-75%硫酸銨飽和度沉澱部分，沉澱復溶於濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止，冷凍乾燥後即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-Sepharose Fast Flow (二乙胺乙基-瓊脂糖凝膠)柱，以 0.05mol/L,ρΗ=7.8 的 PBS憐酸鹽緩衝液進行洗脫並分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細胞檢測洗脫峰的凝血活性，將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow (羧甲基-瓊脂糖凝膠)層析純化,收集、脫鹽後冷凍乾燥即得真姬菇凝集素純品。
[0010]所述真姬菇脫蛋白多糖具體製備步驟為:採用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取溼重為500 g的真姬菇，按質量/體積比為(1-3): lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機勻眾10 min,而後置於90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍乾燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min,收集沉澱為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經Sevag法脫蛋白後，濃縮，加入質量濃度為95%乙醇沉澱，8000rpm離心10 min,沉澱物冷凍乾燥即為真姬燕去蛋白多糖。
[0011]所述真姬菇原料可以是真姬菇下腳料或子實體。
[0012]所述PBS磷酸鹽緩衝液是將Na2HPO4.12H20溶於蒸餾水中配製得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶於蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將製備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合後，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，儲存於冷暗處，備用。
[0013]真姬菇子實體中含有多種活性物質，同時具有多種重要的功能作用，真姬菇下腳料和子實體一樣也具有多種活性物質，其中含有大量具有活性的多糖和活性蛋白，抑菌活性就是其中一種重要的功能作用。結合食品科學中高效的提取技術，對真姬菇中抑菌多糖與凝集素進行有效提取並分離純化，製備複合塗膜保鮮劑，研究複合塗膜保鮮劑對枇杷的高效保鮮作用。前期對真姬菇、雙胞蘑菇、竹蓀、香菇等食用菌開展大量的活性物質提取的試驗並進行抑菌活性的研究，在此基礎上，以真姬菇為實驗材料，對真姬菇多糖和凝集素進行高效提取和分離純化，獲得較高純度的抑菌多糖和凝集素，進行抑制枇杷炭疽病菌活性的初步研究，製備真姬菇多糖與凝集素複合保鮮塗膜，開展複合塗膜保鮮劑對枇杷鮮果的保鮮效果。
[0014]本發明的顯著優點在於:
(I)該應用原料易得，採用下腳料作為原料減小成本，提高工業產值。
[0015](2)採用生物天然提取物，應用到水果保鮮中，安全無毒，減少汙染，對人體健康有
[0016]( 3 )本發明應用對於枇杷保鮮效果明顯，能具有較好的社會經濟效益。
[0017](4)為開發安全、無毒、有效的天然抑菌劑、保鮮劑提供一定的理論基礎，為枇杷鮮果保鮮開發有效方法。
[0018](5)本技術達到菌業廢棄物資源化再利用的目的，資源化利用手段綠色環保，利用效果顯著，同時實現真姬菇有效活性物質首次應用於枇杷保鮮。
【專利附圖】
【附圖說明】[0019]圖1是真姬菇塗膜保鮮劑對枇杷失重率的影響。
[0020]圖2是真姬菇塗膜保鮮劑對枇杷好果率的影響。
[0021]圖3是真姬菇塗膜保鮮劑對枇杷保鮮效果，處理組I塗膜配方A，處理組2塗膜配方B。
[0022]圖4是真姬菇提取物塗膜對枇杷有機酸含量的影響。
[0023]圖5是真姬菇塗膜保鮮劑對枇杷VC含量的影響。
[0024]圖6是枇杷鮮果儲藏期間呼吸強度的變化。
[0025]圖7是真姬菇塗膜保鮮劑對枇杷可溶性固形物的影響。
【具體實施方式】
[0026]下面的實例是為了進一步闡明本發明特徵而非限制本發明。以下實施例為本發明較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應本發明的涵蓋範圍。
[0027]實施例1
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用。
[0028]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
[0029]所述真姬菇凝集素是採用真姬菇為原料，結合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩衝液透析技術提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術進行凝集素粗品純化收集沉澱，經過脫鹽後冷凍乾燥得真姬菇凝集素。
[0030]所述真姬菇脫蛋白多糖是採用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進行提取真姬菇抑菌多糖，經醇沉後收集多糖沉澱為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應用Sevag法脫除其中的蛋白成分進行純化，脫除蛋白後的多糖成分再經過真空冷凍乾燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0031]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配製成塗膜保鮮液，將枇杷放在上述塗膜保鮮液中浸Imin後取出，晾乾，在常溫條件下貯藏；所述塗膜保鮮液中真姬菇凝集素的質量百分比為:0.1%，所述塗膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質量百分比為:2%。
[0032]所述真姬菇凝集素具體製備步驟為:真姬菇以質量/體積比為1:3g/ml加入濃度為0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，在4°C下浸提24h，4°C、轉速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%硫酸銨飽和度沉澱部分,沉澱復溶於濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止,冷凍乾燥後即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-Sepharose FastFlow柱，以0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液進行洗脫並分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細胞檢測洗脫峰的凝血活性,將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化，收集、脫鹽後冷凍乾燥即得真姬菇凝集素純品。
[0033]所述真姬菇脫蛋白多糖具體製備步驟為:採用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取溼重為500 g的真姬菇，按質量/體積比為1: lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機勻漿10min,而後置於90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍乾燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min,收集沉澱為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經Sevag法脫蛋白後，濃縮，加入質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min，沉澱物冷凍乾燥即為真姬菇去蛋白多糖。[0034]所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
[0035]所述PBS磷酸鹽緩衝液是將Na2HPO4.12H20溶於蒸餾水中配製得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶於蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將製備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合後，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，儲存於冷暗處，備用。
[0036]實施例2
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用。
[0037]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
[0038]所述真姬菇凝集素是採用真姬菇為原料，結合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩衝液透析技術提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術進行凝集素粗品純化收集沉澱，經過脫鹽後冷凍乾燥得真姬菇凝集素。
[0039]所述真姬菇脫蛋白多糖是採用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進行提取真姬菇抑菌多糖，經醇沉後收集多糖沉澱為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應用Sevag法脫除其中的蛋白成分進行純化，脫除蛋白後的多糖成分再經過真空冷凍乾燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0040]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配製成塗膜保鮮液，將枇杷放在上述塗膜保鮮液中浸4min後取出，晾乾，在常溫條件下貯藏；所述塗膜保鮮液中真姬菇凝集素的質量百分比為:0.2%，所述塗膜保鮮液中真姬菇脫 蛋白多糖的質量百分比為:1%。
[0041]所述真姬菇凝集素具體製備步驟為:真姬菇以質量/體積比為1:7g/ml加入濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，在4°C下浸提24h，4°C、轉速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集75%硫酸銨飽和度沉澱部分,沉澱復溶於濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止,冷凍乾燥後即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-Sepharose FastFlow柱，以0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液進行洗脫並分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細胞檢測洗脫峰的凝血活性,將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化，收集、脫鹽後冷凍乾燥即得真姬菇凝集素純品。
[0042]所述真姬菇脫蛋白多糖具體製備步驟為:採用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取溼重為500 g的真姬菇，按質量/體積比為3: lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機勻漿10min,而後置於90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍乾燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min,收集沉澱為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經Sevag法脫蛋白後，濃縮，加入質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min，沉澱物冷凍乾燥即為真姬菇去蛋白多糖。
[0043]所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
[0044]所述PBS磷酸鹽緩衝液是將Na2HPO4.12H20溶於蒸餾水中配製得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶於蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將製備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合後，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，儲存於冷暗處，備用。
[0045]實施例3
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用。[0046]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
[0047]所述真姬菇凝集素是採用真姬菇為原料，結合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩衝液透析技術提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術進行凝集素粗品純化收集沉澱，經過脫鹽後冷凍乾燥得真姬菇凝集素。
[0048]所述真姬菇脫蛋白多糖是採用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進行提取真姬菇抑菌多糖，經醇沉後收集多糖沉澱為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應用Sevag法脫除其中的蛋白成分進行純化，脫除蛋白後的多糖成分再經過真空冷凍乾燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0049]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配製成塗膜保鮮液，將枇杷放在上述塗膜保鮮液中浸
2.5min後取出，晾乾，在常溫條件下貯藏；所述塗膜保鮮液中真姬菇凝集素的質量百分比為:0.15%，所述塗膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質量百分比為:1.5%。
[0050]所述真姬菇凝集素具體製備步驟為:真姬菇以質量/體積比為1:5g/ml加入濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，在4°C下浸提24h，4°C、轉速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集57.5%硫酸銨飽和度沉澱部分，沉澱復溶於濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液,裝入透析袋中除鹽,透析至外透析液無S042-檢出為止,冷凍乾燥後即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-SepharoseFast Flow柱，以0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液進行洗脫並分管收集，檢測波長280nm,以兔血紅細胞檢測洗脫峰的凝血活性,將具有凝血活性的通過CM-Sepharose FastFlow層析純化，收集、脫鹽後冷凍乾燥即得真姬菇凝集素純品。
[0051]所述真姬菇脫蛋白 多糖具體製備步驟為:採用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取溼重為500 g的真姬菇，按質量/體積比為2: lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機勻漿10min,而後置於90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍乾燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min,收集沉澱為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經Sevag法脫蛋白後，濃縮，加入質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min，沉澱物冷凍乾燥即為真姬菇去蛋白多糖。
[0052]所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
[0053]所述PBS磷酸鹽緩衝液是將Na2HPO4.12H20溶於蒸餾水中配製得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶於蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將製備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合後，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，儲存於冷暗處，備用。
[0054]實施例4
本實施例以真姬菇菇腳樣品為例進一步闡述本發明的一種具體實施方法，本發明包括但不限於本實施例。
[0055]試驗菌株:真姬燕(Hypsizygusmarmoreus (Peck) H.E.Bigelow)燕腳，由福建省順昌神農燕業有限公司提供；枇杷炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),由福建師範大學生命科學院提供。
[0056]試驗水果:枇杷購買於福州市水果市場，運回實驗室後剔除次果，選擇大小、顏色一致，沒有機械損傷的果實進行冷藏。
[0057]藥品試劑:葡萄糖、蔗糖、蛋白腖、牛肉膏、酵母膏、瓊脂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、維生素B1、抗壞血酸、2，6- 二氯酚靛酚、草酸、碳酸氫鈉、石油醚60-90、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、無水乙醇、甲醛、戊二醛、醋酸異戊酯、鋨酸、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，以上試劑均為普通國產分析純。CM-纖維素鈉鹽300-800 (上海潤捷化學試劑有限公司)，薄層層析矽膠GF254化學純(青島海洋化工有限公司)，層析矽膠(100-200目，國藥試劑)，Sephadex LH-20 凝膠(瑞典 GE Healthcare), Epon812 環氧樹脂。
[0058]實驗儀器:電熱恆溫培養箱；旋轉蒸發儀RE52-1 ;SHB-1IIS循環水式多用真空泵；奧豪斯電子天平CPl 14 ；LMQ-R3260自動高壓滅菌鍋；UD_650型桌上式潔淨工作檯；恆溫培養振蕩器ZHWY-200B ；ZF-1型石英紫外檢測儀(上海顧村電光儀器廠)；層析柱(Φ1.6cmX60cm、Φ2.6cmX40cm) ;HL_2N恆流泵(上海滬西分析儀器廠)；冷凍乾燥機FD-1A-50B ；S-100N自動分部收集器(上海滬西分析儀器廠)；Leica EM UC6超薄切片機JE0L/E0掃描電子顯微鏡JEOL透視電子顯微鏡。HWF-1型紅外二氧化碳分析儀金壇市現代儀器廠；酸鹼滴定管。
[0059]培養基:
(I) PDA培養基:馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水lOOOmL，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然後用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化後補足水至1000 mL。
[0060](2)孟加拉紅培養基:孟加拉紅培養基為廣東環凱微生物科技有限公司生產，孟加拉紅培養基31.6g，水lOOOmL。
[0061]塗膜保鮮劑配方:配方A: 1%真姬菇脫蛋白多糖+0.1%真姬菇凝集素；配方B:1%真姬菇脫蛋白多糖；c K:對照組。
[0062]試驗方法
(I)真姬菇菇腳去蛋白多糖的製備
採用熱水浸提法提取真姬菇菇腳多糖，稱取500 g (溼重)真姬菇菇腳，按質量/體積比為2:1 (即w:v=2:1)加入蒸餾水，用高速組織搗碎機勻漿10 min，而後置於90°C水浴鍋浸提8 h, 5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍乾燥濃縮至1/10, 3倍95%乙醇沉澱,8000 rpm離心10 min，收集沉澱為菌絲粗多糖。粗多糖經Sevag法脫蛋白後，濃縮，95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min,沉澱物冷凍乾燥即為真姬燕燕腳去蛋白多糖。
[0063](2)真姬菇凝集素的製備
各種真姬菇以質量/體積比為1:5加入PBS磷酸鹽緩衝液(0.05mol/L, pH=7.8)在4°C下浸提24h,4°C下冷凍離心(8000r/min,40 min),取上清液。上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%?75%硫酸銨飽和度沉澱部分。沉澱復溶於少量的PBS磷酸鹽緩衝液(0.05mol/L，pH=7.8)裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止，冷凍乾燥後即為凝集素粗品。將凝集素粗品上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以PBS磷酸鹽緩衝液(0.05mol/L,pH=7.8)進行洗脫並分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細胞檢測各峰的凝血活性，收集活性峰，再將活性峰通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化,收集、脫鹽後冷凍乾燥即得真姬菇凝集素純品，將所得凝集素經SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)檢測，顯示為約35kDa大小的單一條帶。
[0064]所述PBS磷酸鹽緩衝液是先進行母液的配製:0.2M Na2HPO4:稱取71.6gNa2HPO4.12H20，溶於 1000ml 水；0.2M NaH2PO4:稱取 31.2g NaH2PO4.2H20，溶於 1000ml水。再進行PBS磷酸鹽緩衝液(pH=7.8 0.05mol/L)的配製:先配0.2M PBS磷酸鹽緩衝液(ρΗ=7.8，100ml):取 8.5ml 0.2mol/L 的 NaH2PO4, 91.5ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4,即可；然後將配得的0.2M PBS磷酸鹽緩衝液(pH=7.8)稀釋四倍，在溫度為121° C下滅菌30min，即得0.05M PBS磷酸鹽緩衝液(pH=7.8)，儲存於冷暗處，備用。
[0065](3)抑枇杷炭疽病菌活性檢測
採用菌絲生長速率法(林陳強，林戎斌，蔡海松，等.虎奶菇抑菌物質與食品防腐劑抑菌活性的比較[J].食用菌學報，2007，14(3):62-66.):
①菌餅製備:取活化的枇杷炭疽病菌，接於PDA培養基上，於28°C ±1培養5?6d，用無菌水洗下分生孢子，製成孢子懸液(濃度約為106個/mL)。取5mL孢子懸液，倒入熔化並冷卻至45°C?50°C的孟加拉紅培養基中，搖勻後，迅速分裝培養皿中，每個培養皿中倒入10mL，待凝固後置於恆溫培養箱中，28°C ± I倒置培養2?3d至菌絲長滿全皿。用直徑為
0.9cm的打孔器製成若干菌餅備用。
[0066]②含藥培養基平板製備:準確將0.1mL藥液塗布孟加拉紅培養基上製成含藥培養基平板，在對照上則塗布相同體積的溶劑。
[0067]③抑制菌絲生長實驗:用接種針挑取菌餅輕放於含藥培養基中央(每皿一塊菌餅，菌絲面朝下)，每個處理設3個平行，並設對照。28°C ± I恆溫培養一段時間後用十字交叉法測菌落直徑，計算供試真菌菌絲生長相對抑制率，比較抑制效果。計算公式:相對抑制率(％)=(對照菌落平均直徑一處理菌落平均直徑)+ (對照菌落平均直徑一菌餅直徑)X 100%ο
[0068]根據藥劑濃度的對數值(X)和菌絲生長抑制率的機率值(y)，用0rigin8.0軟體擬合直線毒力回歸方程，並求出半數抑制濃度(IC50)，比較真姬菇多糖和真姬菇凝集素對枇杷炭疽病菌的抑制作用。
[0069](4)塗膜方法及枇杷生理指標測定
塗膜方法:每組樣品選用大小均勻的枇杷10顆，分別在不同的保鮮液中浸Imin後取出，涼幹，放入搪瓷盤中，在常溫條件下貯藏，每組重複4次，並每隔2d進行隨機取樣分析。
[0070](5)生理指標測定
1)失重率[10]=(失重克數/原克數)X100%
2)好果率=(完好果數/檢查總果數)X100%
當爛斑直徑大於IOmm時，則認定該果實為腐爛果；
3)可溶性固形糖的測定:用WYA阿貝折光儀測定；
4)VC測定:2，6- 二氯靛酚滴定法；
5)有機酸測定:酸鹼滴定法；
6)呼吸強度測定:用紅外二氧化碳分析儀測定。
[0071]試驗結果與分析
(I)真姬菇去蛋白多糖抑制枇杷炭疽病活性
採用菌絲生長速率法測定了 0.3125,0.6250、1.250,2.500,5.0OOmg.mL_l 5個梯度濃度的真姬菇去蛋白多糖對枇杷炭疽病菌菌絲生長的抑制活性(表I)。經0rigin8.0軟體擬合直線毒力回歸方程(該步驟由實驗人員指導通過計算機軟體完成，下同)，可知72h後，真姬菇去蛋白多糖對枇杷炭疽病菌菌絲生長的P IC50為0.56 mg.mL_l。
[0072]
【權利要求】
1.真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用。
2.真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用。
3.根據權利要求1所述的真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用，其特徵在於:所述真姬菇凝集素是採用真姬菇為原料，結合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩衝液透析技術提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術進行凝集素粗品純化收集沉澱，經過脫鹽後冷凍乾燥得真姬菇凝集素。
4.根據權利要求2所述的真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，其特徵在於:所述真姬菇脫蛋白多糖是採用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進行提取真姬菇抑菌多糖，經醇沉後收集多糖沉澱為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應用Sevag法脫除其中的蛋白成分進行純化，脫除蛋白後的多糖成分再經過真空冷凍乾燥得真姬菇脫蛋白多糖。
5.根據權利要求1或2所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，其特徵在於:將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配製成塗膜保鮮液，將枇杷放在上述塗膜保鮮液中浸Ilmin後取出，晾乾，在常溫條件下貯藏；所述塗膜保鮮液中真姬菇凝集素的質量百分比為:0.1%-0.2%，所述塗膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質量百分比為:1% -2%ο
6.根據權利要求3所述的真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應用，其特徵在於:所述真姬菇凝集素具體製備步驟為:真姬菇以質量/體積比為1:(3~7)g/ml加入濃度為0.05mol/L，pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，在4°C下浸提24h，4°C、轉速為8000r/min下冷凍離心40min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%~75%硫酸銨飽和度沉澱部分,沉澱復溶於濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無SO42-檢出為止，冷凍乾燥後即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-S印harose Fast Flow柱，以0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液進行洗脫並分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細胞檢測洗脫峰的凝血活性，將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化，收集、脫鹽後冷凍乾燥即得真姬菇凝集素純品。
7.根據權利要求4所述的真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應用，其特徵在於:所述真姬菇脫蛋白多糖具體製備步驟為:採用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取溼重為500 g的真姬燕，按質量/體積比為(1~3): lg/ml加入蒸懼水,用高速組織搗碎機勻眾10 min,而後置於90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍乾燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min,收集沉澱為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經Sevag法脫蛋白後，濃縮，加入質量濃度為95%乙醇沉澱，8000 rpm離心10 min，沉澱物冷凍乾燥即為真姬菇去蛋白多糖。
8.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於:所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
9.根據權利要求3或6所述的應用，其特徵在於:所述PBS磷酸鹽緩衝液是將Na2HPO4? 12H20溶於蒸餾水中配製得到濃度為0.2 mo I/L的Na2HPO4，將NaH2PO4.2H20溶於蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將製備得到NaH2PO4、Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合後，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩衝液，儲存於冷暗處，備用。
【文檔編號】A23B7/154GK103461471SQ201310396752
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】林勇, 毛方華, 張迪, 肖冬來, 王宏雨, 曾輝 申請人:福建省農業科學院食用菌研究所