一種蘿蔔硫素的提取方法
2023-09-22 18:48:15
專利名稱：：一種蘿蔔硫素的提取方法
技術領域：
：本發明屬於生物化學
技術領域：
，涉及天然產物中有效成分的提取純化工藝，具體為一種從乾燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球中提取蘿蔔硫素的方法。目前，根據流行病學及藥理學的研究表明，癌症發病率低的地方，人們飲食中蔬菜、水果所佔比例較大。蔬菜、水果中存在一種或多種阻止或減慢癌症發展的植物活性成分，如番茄中的番茄紅素、大豆製品中的大豆異黃酮、漿果中的鞣化酸以及十字花科蔬菜中的蘿蔔硫素、吲哚類物質，均被證實具有良好的防癌抗癌作用。在眾多含有抗癌活性成分的蔬菜中，十字花科(洋白菜、花莖甘藍、球莖甘藍青花椰菜、芥蘭、萵苣、白蘿蔔和高麗菜等)中富含多種芥子苷(glucosinolates,簡稱GLs)。葡萄糖萊菔子苷(芥子苷的一種)經黑芥子硫酸苷酶酶解(myrosinase)或酸水解後，產生蘿蔔硫素(sulforaphen，簡稱SF)，它是迄今為止蔬菜中發現的最強的抗癌成分之一。蘿蔔硫素又稱"萊菔子素"，就其化學成分而言，為異硫代氰酸鹽衍生物，易溶於水,相對分子質量177.3，分子式C6H11S2N0，結構式如下蘿蔔硫素是一種多功能誘導物，可誘導機體產生II型解毒酶-谷光甘肽轉移酶和醌還原酶，此酶可對許多致癌物產生抗性，從而起到抗癌作用。蘿蔔硫素具有較強的抗癌作用且為植物活性物質，無毒副作用，所以具有廣闊的市場
背景技術：
：前景。目前，有研究報導從西蘭花中提取蘿蔔硫素的方法，如專利為"一種提取蘿蔔硫素的方法(CN101143842)"，"一種萊菔硫垸的製備方法(CN1982294)"均涉及蘿蔔硫素的提取和純化方法，但這兩種方法製備得到的蘿蔔硫素的轉化率較低，只限於實驗規模製備少量產品，難於大規模地進行工業化的生產。目前，還沒有解決上述問題更好的實施方法。
發明內容本發明的目的是克服上述現有技術的不足，提供一種蘿蔔硫素的提取方法的改進，該提取方法優化了原有提取純化方法，提高了蘿蔔硫素的轉化率，大大降低了蘿蔔硫素的生產成本。本發明的技術方案一種蘿蔔硫素的提取方法，包括以下步驟-(1)用乾燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球為原料，粉碎至3060目後，按重量計加入1.52倍量的水，用5%鹽酸調節pH4.14.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶後，在3134X:的溫度下水解13h;(2)將水解後的西蘭花固液混合物冷凍乾燥成含水率小於5%的粉末；(3)冷凍乾燥後的粉末中，分3次共加入10倍重量的純丙酮，在室溫下共浸提48h，過濾、合併3次製備得到的丙酮浸提液，將濾液於354(TC溫度下真空濃縮得到蘿蔔硫素粗品；(4)將上述製備得到的蘿蔔硫素粗品採用矽膠柱層析，採用乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，收集蘿蔔硫素餾分，354(TC溫度下真空濃縮；(5)將上述經真空濃縮的蘿蔔硫素先用甲醇溶解後，經0.2wm微孔濾膜過濾後，用2040pm的C18矽膠裝柱，採用不同濃度的甲醇水進行梯度洗脫，收集蘿蔔硫素餾分，3540'C溫度下真空乾燥，得到高含量的蘿蔔硫素。上述的一種蘿蔔硫素的提取方法，作為優選，所述的粗芥子硫苷酸酶為芥子硫苷酸酶的粗品，其製備方法是取新鮮甘藍，粉碎至3060目，用50目的雙層紗布過濾後得濾液，濾液在5'C溫度下加入1倍量濾液體積的純丙酮，混合均勻，用高速冷凍離心機5。C下離心，離心機轉速為4000r/min;得沉澱物，即為芥子硫苷酸酶的粗品，將該芥子硫苷酸酶的粗品放入-20'C下進行冷凍保存、備用。上述的一種蘿蔔硫素的提取方法，作為優選，所述蘿蔔硫素粗品矽膠柱層析前，需要先在蘿蔔硫素粗品中加入200目的矽膠拌樣，矽膠的加入量為蘿蔔硫素粗品重量的兩倍，經矽膠拌樣後的蘿蔔硫素粗品在紅外燈下烘乾直至丙酮完全揮發即可。上述的一種蘿蔔硫素的提取方法，作為優選，步驟(4)中梯度洗脫前需要先加入3倍柱體積量的乙酸乙酯進行洗脫除雜。上述的一種蘿蔔硫素的提取方法，作為優選，步驟(4)中用於梯度洗脫的洗脫劑為乙酸乙酯與乙醇的混合溶液，該混合溶液中乙酸乙酯與乙醇的體積比為13:97。上述的一種蘿蔔硫素的提取方法，作為優選，步驟(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進行梯度洗脫的操作需要進行三次，三次梯度洗脫時乙酸乙酯與乙醇的體積比分別為1:9，2:8，3:7。上述的一種蘿蔔硫素的提取方法，作為優選，步驟(5)中所述的洗脫劑是濃度為6080%的甲醇。本發明通過優化蘿蔔硫素原有的提取純化工藝(尤其是通過添加粗芥子硫苷酸酶進行酶解)，大大地提高了蘿蔔硫素的轉化率，該提取方法得到的蘿蔔硫素的轉化率高達8cm以上，從而大大地降低了蘿蔔硫素的生產成本。同時，該提取方法還可以根據市場的需要得到不同含量的蘿蔔硫素產品，具有很好的實用性；此外，該提取方法還適用於工業化的大規模的生產。本發明中涉及的配比及其百分含量均以重量計。具體實施例方式以下結合實施例，對本發明的技術方案作進一步說明，但這些實施例的目的並不在於限制本發明的保護範圍。在這些實施例中，除另有說明外，所有百分含量均以重量計。實施例1:粗芥子硫苷酸酶(即芥子硫苷酸酶的粗品)的製備稱取lkg新鮮甘藍，粉碎過30目篩，用50目的雙層紗布過濾後，得到650ml濾液；濾液在5'C下加入1倍濾液體積量的純丙酮，混合均勻，在高速冷凍離心機下離心，離心機轉速為4000r/min，離心時的溫度為4"C;得到41.2g沉澱物，該沉澱物即為芥子硫苷酸酶的粗品，將該芥子硫苷酸酶的粗品放入-20'C下進行冷凍保存、備用。稱取1.0kg西蘭花乾燥種子，粉碎至30目，加入1.5kg水，用5%鹽酸調節pH為4.1,加入粗芥子硫苷酸酶1.10g，在3rc條件下水解ih;將水解後的固液混合物冷凍乾燥，得到1.05kg的粉末，所得到的粉末的含水量應小於5%。用10.5kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量4.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量3kg，浸提1.5h，合併3次浸提液，在35。C溫度下真空濃縮，得到47.71g浸膏，即得含量2.91%的蘿蔔硫素粗品。在上述製備得到的蘿蔔硫素中加入200目的矽膠進行拌樣，矽膠的加入量為蘿蔔硫素粗品重量的兩倍，經矽膠拌樣後的蘿蔔硫素粗品在紅外燈下烘乾至丙酮完全揮發。經烘乾後的蘿蔔硫素粗品裝入200目的矽膠中進行層析，層析時採用幹法上樣，梯度洗脫的方法。所述的蘿蔔硫素粗品層析包括矽膠柱層析和反相矽膠柱層析兩步；其中矽膠柱層析先進行，反相矽膠柱層析後進行。所述的矽膠柱層析分為四步進行1、在矽膠柱中加入3倍柱體積的乙酸乙酯進行洗脫除雜；2、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為h9，進行洗脫，得到餾分l;3、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為2:8，進行洗脫，得到餾分2;4、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為3:7，進行洗脫，得到餾分3;合併餾分l、2、3，在35'C溫度下真空濃縮，得到4.llg含量24.30%的蘿蔔硫素。所述的反相矽膠柱層析步驟如下將上述製備得到的24.30%的蘿蔔硫素用10ml純甲醇溶解，經O.lum微孔濾膜過濾後；用20nm的C18矽膠裝柱，採用不同濃度的甲醇水為洗脫劑進行梯度洗脫，該梯度洗脫操作重複3次，第一次洗脫劑是濃度為80%的甲醇，第二次洗脫劑是濃度為70%的甲醇，第三次洗脫劑是濃度為60%的甲醇；收集第二次洗脫得到的餾分，3(TC溫度下真空濃縮除去甲醇後，經冷凍乾燥，得到含量為95.10y。的蘿蔔硫素937.5mg。實施例2:稱取1.kg西蘭花千燥種子，粉碎至60目，加入3kg水，用5%鹽酸調節pH為4.5，加入粗芥子硫苷酸酶1.10g(實施例1製備得到的)，在34'C條件下水解3h;將水解後的固液混合物冷凍乾燥，得到1.05kg的粉末，所得到的粉末的含水量應小於5%。用10.5kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量4kg，浸提2小時，第二次丙酮用量3.5kg，浸提lh，第三次丙酮用量3kg，浸提lh，合併3次浸提液，在4CTC真空濃縮，得到46.54g浸膏，即得含量2.83%的蘿蔔硫素粗品；在上述製備得到的蘿蔔硫素中加入300目的矽膠進行拌樣，矽膠的加入量為蘿蔔硫素粗品重量的兩倍，經矽膠拌樣後的蘿蔔硫素粗品在紅外燈下烘乾直至丙酮完全揮發。經烘乾後的蘿蔔硫素粗品裝入200目的矽膠中進行層析，層析時採用幹法上樣，梯度洗脫的方法。所述的蘿蔔硫素粗品層析包括矽膠柱層析和反相矽膠柱層析兩步；其中矽膠柱層析先進行，反相矽膠柱層析後進行。所述的矽膠柱層析分為四步進行1、在矽膠柱中加入3倍柱體積的乙酸乙酯進行洗脫除雜；2、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為l:9,進行洗脫，得到餾分l;3、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為2:8，進行洗脫，得到餾分2;4、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為3:7,進行洗脫，得到餾分3;合併餾分l、2、3，在35。C溫度下真空濃縮，得到3.98g含量23.30%的蘿蔔硫素。所述的反相矽膠柱層析步驟如下將上述製備得到的23.30%的蘿蔔硫素用10ml純甲醇溶解，經0.3um微孔濾膜過濾後；用40um的C18矽膠裝柱，採用不同濃度的甲醇水為洗脫劑進行梯度洗脫，該梯度洗脫操作重複3次，第一次洗脫劑是濃度為80%的甲醇，第二次洗脫劑是濃度為70%的甲醇，第三次洗脫劑是濃度為60%的甲醇；收集第二次洗脫得到的餾分，40'C溫度下真空濃縮除去甲醇後，經冷凍乾燥，得到含量為95.20%的蘿蔔硫素870.5mg。實施例3:稱取lkg新鮮西蘭花花球，粉碎至30目，加入1.5kg水，用5%鹽酸調節pH為4.3，加入粗芥子硫苷酸酶1.10g(實施例l製備得到的)，在3rC條件下水解2h;將水解後的固液混合物冷凍乾燥，得到157.32g的粉末；用1.7kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.7kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0.5kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.5kg，浸提1.5h，合併3次浸提液，在35。C真空濃縮，得到11.05g浸膏，即得含量2.53%的蘿蔔硫素粗品；在上述製備得到的蘿蔔硫素粗品中加入200目的矽膠進行拌樣，矽膠的加入量為蘿蔔硫素粗品重量的兩倍，經矽膠拌樣後的蘿蔔硫素粗品在紅外燈下烘乾直至丙酮完全揮發。經烘乾後的蘿蔔硫素粗品裝入200目的矽膠中進行層析，層析時採用幹法上樣，梯度洗脫的方法。所述的蘿蔔硫素粗品層析包括矽膠柱層析和反相矽膠柱層析兩步；其中矽膠柱層析先進行，反相矽膠柱層析後進行。所述的矽膠柱層析分為四步進行1、在矽膠柱中加入3倍柱體積的乙酸乙酯進行洗脫除雜；2、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為l:9，進行洗脫，得到餾分l;3、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為2:8，進行洗脫，得到餾分2;4、在矽膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為3:7，進行洗脫，得到餾分3;合併餾分1、2、3，在35。C溫度下真空濃縮，得到0.96g含量20.21%的蘿蔔硫素。所述的反相矽膠柱層析步驟如下將上述製備得到的20.21%的蘿蔔硫素用2ml純甲醇溶解，經0.2um微孔濾膜過濾後；用30um的C18矽膠裝柱，採用不同濃度的甲醇水為洗脫劑進行梯度洗脫，該梯度洗脫操作重複3次，第一次洗脫第二次洗脫劑是濃度為70%的甲醇，第三次洗脫劑是濃度為60%的甲醇；收集第二次洗脫得到的餾分，4(TC溫度下真空濃縮除去甲醇後，經冷凍千燥，得到含量為94.70%的蘿蔔硫素147.6mg。本發明提供的蘿蔔硫素提取方法具有很高的轉化率，不僅適用於工業化生產，而且降低了生產成本。以下通過具體實驗數據來比較說明本發明提供的蘿蔔硫素提取方法與現有方法之間的區別。由於蘿蔔硫素是以前體葡萄糖萊菔子苷的形式存在的，葡萄糖萊菔子經過水解後才能轉化為苷蘿蔔硫素，水解過程的轉化率直接決定了所採用提取工藝的收率。通常採用的水解方法有二種，一是僅控制水解過程的pH值(專利CN1982294採用此法)；二是在控制pH值得同時，加入抗壞血酸(CN101143842)。本發明採用了加入粗芥子硫苷酸酶和調節PH值的方法，使水解轉化率得到了很大提高。以下進行了三種轉化方法的對比試驗。1、採用專利一種萊菔硫垸的製備方法(CN1982294)的方法迸行蘿蔔硫素的轉化稱取100g西蘭花乾燥種子，粉碎至50目，加入180g水，用5%鹽酸調節pH為4.2，在28。C條件下水解2h;將水解後的固液混合物冷凍乾燥，得到101.llg的粉末；用l.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0,3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合併3次浸提液，在35。C真空濃縮，得到3.52g浸膏，即得含量2.11%的蘿蔔硫素粗品；2、採用專利一種提取蘿蔔硫素的方法(CN101143842)"進行蘿蔔硫素的轉化稱取100g西蘭花乾燥種子，粉碎至3060目，加入180g水，用5%鹽酸調節pH為4.0，在28'C條件下水解2h;將水解後的固液混合物冷凍乾燥，得到106.llg的粉末；用1.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合併3次浸提液，在35。C真空濃縮，得到3.82g浸膏，即得含量2.31%的蘿蔔硫素粗品；3、稱取100g西蘭花千燥種子，粉碎至40目，加入180g水，用5%鹽酸調節pH為4.5，加入粗芥子硫苷酸酶O.11g在31'C條件下水解2h;將水解後的固液混合物冷凍乾燥，得到108.53g的粉末；用1.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合併3次浸提液，在35"C真空濃縮，得到4.51g浸膏，即得含量2.93%的蘿蔔硫素粗品；三種方法蘿蔔硫素的轉化率見表1。表1三種轉化方法比較tableseeoriginaldocumentpage12從對比實施例可知，本發明提供的蘿蔔硫素提取方法將葡萄糖萊菔子轉化為蘿蔔硫素的轉化率大大提高，從而大大地降低了蘿蔔硫素的生產成本。權利要求1、一種蘿蔔硫素的提取方法，包括以下步驟(1)用乾燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球為原料，粉碎至30～60目後，按重量計加入1.5～2倍量的水，用5％鹽酸調節pH4.1～4.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶後，在31～34℃的溫度下水解1～3h；(2)將水解後的西蘭花固液混合物冷凍乾燥成含水率小於5％的粉末；(3)冷凍乾燥後的粉末中，分3次共加入10倍重量的純丙酮，在室溫下共浸提4～8h，過濾、合併3次製備得到的丙酮浸提液，將濾液於35～40℃溫度下真空濃縮得到蘿蔔硫素粗品；(4)將上述製備得到的蘿蔔硫素粗品採用矽膠柱層析，採用乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，收集蘿蔔硫素餾分，35～40℃溫度下真空濃縮；(5)將上述經真空濃縮的蘿蔔硫素先用甲醇溶解後，經0.2μm微孔濾膜過濾後，用20～40μm的C18矽膠裝柱，採用不同濃度的甲醇水進行梯度洗脫，收集蘿蔔硫素餾分，35～40℃溫度下真空乾燥，得到高含量的蘿蔔硫素。2、如權利要求1所述的一種蘿蔔硫素的提取方法，其特徵在於所述的粗芥子硫苷酸酶為芥子硫苷酸酶的粗品，其製備方法是取新鮮甘藍，粉碎至3060目，用so目的雙層紗布過濾後得濾液，濾液在5'c溫度下加入r倍量濾液體積的純丙酮，混合均勻，在高速冷凍離心機下離心，離心機轉速為4000r/min,離心時的溫度為46t:;得沉澱物，即為芥子硫苷酸酶的粗品，將該芥子硫苷酸酶的粗品放入-2(TC下進行冷凍保存、備用。3、如權利要求1所述的一種蘿蔔硫素的提取方法，其特徵在於所述蘿蔔硫素粗品矽膠柱層析前，需要先在蘿蔔硫素粗品中加入200目的矽膠拌樣，矽膠的加入量為蘿蔔硫素粗品重量的兩倍，經矽膠拌樣後的蘿蔔硫素粗品在紅外燈下烘乾直至丙酮完全揮發即可。4、如權利要求1所述的一種蘿蔔硫素的提取方法，其特徵在於步驟(4)中梯度洗脫前需要先加入3倍柱體積量的乙酸乙酯進行洗脫除雜。5、如權利要求1所述的一種蘿蔔硫素的提取方法，其特徵在於步驟(4)中用於梯度洗脫的洗脫劑為乙酸乙酯與乙醇的混合溶液，該混合溶液中乙酸乙酯與乙醇的體積比為13:97。6、如權利要求1所述的一種蘿蔔硫素的提取方法，其特徵在於步驟(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進行梯度洗脫的操作需要進行三次，三次梯度洗脫時乙酸乙酯與乙醇的體積比分別為h9，2:8，3:7。7、如權利要求1所述的一種蘿蔔硫素的提取方法，其特徵在於步驟(5)中所述的洗脫劑是濃度為6080%的甲醇。全文摘要本發明屬於生物化學
技術領域：
。目的是提供一種蘿蔔硫素的提取方法的改進，該提取方法優化了原有提取純化方法，提高了蘿蔔硫素的轉化率，大大降低了蘿蔔硫素的生產成本。一種蘿蔔硫素的提取方法，包括以下步驟1.用乾燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球為原料，粉碎後，加入水，調節pH4.1～4.5，加入粗芥子硫苷酸酶後，水解；2.將水解後的西蘭花冷凍乾燥成粉末；3.在粉末中，加入純丙酮，浸提，過濾、合併丙酮浸提液，將濾液真空濃縮成蘿蔔硫素粗品；4.該蘿蔔硫素粗品梯度洗脫，收集餾分，真空濃縮；5.將蘿蔔硫素先用甲醇溶解後，經微孔濾膜過濾後，用C18矽膠裝柱，採用甲醇水梯度洗脫，收集蘿蔔硫素餾分，真空乾燥，得蘿蔔硫素。文檔編號C12P11/00GK101544995SQ20091009819公開日2009年9月30日申請日期2009年5月7日優先權日2009年5月7日發明者刑健彬,童雲標,陳安良,陳張金申請人:杭州臨安天鴻生物科技有限公司