氧化白藜蘆醇或氧化白藜蘆醇聯合抗生素在製備抗真菌感染產品中的應用的製作方法

2023-09-22 20:16:30 1

本發明屬於醫藥
技術領域：
，具體涉及氧化白藜蘆醇或氧化白藜蘆醇聯合硝酸益康唑在製備抗真菌感染產品中的應用。
背景技術：
：隨著生活水平的逐漸提高，人們的衛生防病意識也在不斷的加強。真菌是細菌的一種，能引起動植物和人的各種疾病。不同真菌可以通過不同的方式致病，可以分為以下幾種：(1)致病性真菌感染：由外源性真菌引起，如皮膚癬病菌；(2)條件致病性真菌感染：由內源性真菌引起，如白色念珠菌等；(3)真菌超敏反應性疾病：吸入或食入菌絲或孢子引起蕁麻疹、哮喘等；(4)真菌性中毒症：食用含真菌毒素的黴變糧食所致；(5)真菌毒素：與腫瘤發生有關。人類感染的真菌主要來自外界環境，並通過接觸、吸入或食入而感染。少數致病真菌可直接致病，但多數真菌需要在一定條件下才能致病，後者稱為條件致病菌。其中，皮膚癬菌中的紅色毛癬菌通過接觸傳染，感染指(趾)甲形成足癬，還可以感染而引起頭癬、體癬、股癬、手癬等。而足癬，俗稱腳氣，具有傳染性，其難以治癒、容易交叉傳染，不及時治療，久而久之會引發灰指甲的形成，同時抓撓後極易引發身體其他部位的真菌感染，嚴重影響人們的生活質量。用於臨床的抗真菌藥皆因不能滲透角質而對治療灰指(趾)甲無效。從前的主要治療方法為手術拔除指(趾)甲，多人畏其疼痛而為難，成為許多人特別是年輕人心頭之煩惱。目前，用於治療灰指甲的方法有口服藥和外用藥兩大類。口服藥主要是抗真菌藥物類，如斯皮仁諾(別名：伊曲康唑、依康唑、伊康唑、依他康唑)，但口服藥往往會給人體帶來較大的傷害；久而久之，容易引起指(趾)甲對紅色毛癬菌的耐藥性等很多副作用，且安全性也不斷受到質疑。外用藥物，如硝酸咪康唑、複方苯甲酸軟膏等西藥類，通過塗抹患處，殺滅真菌治療，但是此類藥物往往具有很大的刺激性，使用時還可能會帶來灼燒感和刺痛感，嚴重時難以忍受，且復發率較高。同樣，白色念珠菌為條件致病性真菌，常寄生於人的皮膚、口腔、陰道和腸道黏膜處。隨著免疫功能低下或免疫缺陷的病人日益增多，其感染率不斷增加。其可侵犯人體許多部位，如皮膚皺褶處(腑窩、腹股溝，乳房下，肛門周圍及甲溝，指間)，引起皮膚潮紅、潮溼、發亮，有時病變周圍有小水泡等症狀，同時還會引起鵝口瘡、口角炎、陰道炎、淺表潰瘍、肺炎、腸胃炎、心內膜炎、腦膜炎、腦炎等，偶爾也可發生敗血症。近年來，由於廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑等藥物的大量應用，介入手術的普及，惡性腫瘤、愛滋病等疾病發病率逐年上升等因素，使得念珠菌感染髮病率逐年升高。目前，唑類藥物是臨床治療和預防白色念珠菌感染的首選藥物，唑類藥物的大量應用，在治療白色念珠菌感染的同時又使白色念珠菌的耐藥性提高。因此，開發研究一種新型、高效、天然的抗真菌感染產品是目前所急需的，也是現代醫學研究的熱點。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於：(1)提供氧化白藜蘆醇在製備抗真菌感染產品中的應用；(2)氧化白藜蘆醇聯合抗生素在製備抗真菌感染產品中的應用。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：1、氧化白藜蘆醇在製備抗真菌感染產品中的應用。進一步，所述真菌為紅色毛癬菌或白色念珠菌。進一步，所述氧化白藜蘆醇的製備方法為：(1)取桑枝烘乾粉碎後過100目篩，獲得桑枝粉末；(2)將步驟(1)中製得的桑枝粉末加入無水乙醇或甲醇中，經提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物；將所述桑枝提取物溶於水中，獲得桑枝提取物水溶液，將所述桑枝提取物水溶液經石油醚萃取後再加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，再次萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝的乙酸乙酯、氯仿或丙酮的萃取物；(3)利用聚醯胺柱色譜，依次以體積分數為30％、60％、80％的乙醇溶液對步驟(2)中製得的乙酸乙酯、氯仿或丙酮的萃取物進行洗脫，收集80％的乙醇溶液洗脫液，再利用矽膠柱色譜，以氯仿和甲醇的混合液對所述80％的乙醇溶液洗脫液進行洗脫，收集氯仿和甲醇的混合液洗脫液，對所述氯仿和甲醇的混合液洗脫液進行濃縮，獲得濃縮液，向所述濃縮液加入體積分數為50％的乙醇溶液，混勻至氧化白藜蘆醇晶體析出，製得氧化白藜蘆醇。進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與無水乙醇或甲醇的質量體積比為1mg：20ml。進一步，步驟(2)中，所述桑枝提取物水溶液與石油醚的體積比為1：1；經石油醚萃取後的桑枝提取物水溶液與所述乙酸乙酯、氯仿或丙酮的體積比為1：1。進一步，步驟(2)中，所述提取具體為在350w下微波提取三次，每次30min。進一步，步驟(3)中，所述聚醯胺柱色譜中聚醯胺顆粒大小為80-100目。進一步，步驟(3)中，所述氯仿和甲醇的體積比為14:1。2、氧化白藜蘆醇聯合抗生素在製備抗真菌感染產品中的應用。進一步，所述抗生素為硝酸益康唑。本發明的有益效果在於：本發明的有益效果在於：本發明公開了氧化白藜蘆醇及氧化白藜蘆醇聯合抗生素在抗真菌感染疾病藥物中的應用，氧化白藜蘆醇成分天然、安全性好，對紅色毛癬菌和白色念珠菌均具有良好的抗菌能力，對兩種菌的最小抑菌濃度分別為0.5mg/ml和1mg/ml。當氧化白藜蘆醇與抗生素硝酸益康唑聯合運用時，相同使用濃度下，對紅色毛癬菌和白色念珠菌的抑菌效果均優於單獨使用兩種物質，其中，硝酸益康唑單獨作用紅色毛癬菌和白色念珠菌時的最小抑菌濃度分別為1μg/ml和1mg/ml，當兩者聯合作用於紅色毛癬菌時，氧化白藜蘆醇濃度為0.250mg/ml、硝酸益康唑濃度為0.500μg/ml，對紅色毛癬菌的抑菌率可到99.38％；當兩者聯合作用於白色念珠菌時，氧化白藜蘆醇濃度為0.250mg/ml、硝酸益康唑濃度為0.25mg/ml，可見，以天然的氧化白藜蘆醇取代部分硝酸益康唑用於抑制真菌，可減少硝酸益康唑的使用量，有利於新型、高效、天然的抗真菌感染藥物的研發。附圖說明為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：圖1為實施例2中不同濃度的氧化白藜蘆醇對紅色毛癬菌的抑菌率圖；圖2為實施例5中不同濃度的氧化白藜蘆醇對白色念珠菌生長曲線的影響圖；圖3為實施例6中不同濃度的氧化白藜蘆醇對白色念珠菌的時間-殺菌圖。具體實施方式下面將對本發明的優選實施例進行詳細的描述。本發明實施例中使用的材料及主要試劑如下：rpm-1640培養基(含l-谷醯胺，不含碳酸氫鈉，含ph指示劑)，購於上海士豐生物科技有限公司；二甲基亞碸(dmso)、mtt、硝酸益康唑(miconazolenitrate，mn)，購於上海生工生物工程有限公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿，均為分析純，購於重慶川東化工集團有限公司；桑枝(湖桑32號)，採自重慶市蠶業科學技術研究院桑樹資源圃；紅色毛癬菌，編號為atcc28188，購買於上海士豐生物科技有限公司；白色念珠菌，編號為cmcc(f)98001，購買於中國獸藥所。實施例1氧化白藜蘆醇的製備(1)取無病蟲害桑枝，烘乾粉碎後過100目篩，獲得桑枝粉末；(2)將步驟(1)中製得的桑枝粉末加入無水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液並混合，將提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物，所述桑枝粉末與無水乙醇的質量體積比為1mg：20ml；將所述桑枝提取物溶於水中，獲得桑枝提取物水溶液，將所述桑枝提取物水溶液經石油醚萃取後再加入乙酸乙酯中，再次萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝的乙酸乙酯萃取物，所述桑枝提取物水溶液與石油醚的體積比為1：1，經石油醚萃取後的桑枝提取物水溶液與乙酸乙酯的體積比為1：1；(3)利用聚醯胺柱色譜，依次以體積分數為30％、60％、80％的乙醇溶液對步驟(2)中製得的乙酸乙酯萃取物進行洗脫，收集80％的乙醇溶液洗脫液，其中聚醯胺顆粒大小為80-100目；再利用矽膠柱色譜，將氯仿和甲醇按體積比14:1混合，以該混合液對所述80％的乙醇溶液洗脫液進行洗脫，收集氯仿和甲醇的混合液洗脫液，對所述氯仿和甲醇的混合液洗脫液進行濃縮，獲得濃縮液，向所述濃縮液加入體積分數為50％的乙醇溶液，混勻至氧化白藜蘆醇晶體析出，製得氧化白藜蘆醇，將製得的氧化白藜蘆醇溶於100％的二甲基亞碸(dmso)製得濃度為100mg/ml的氧化白藜蘆醇樣液，存於-20℃冰箱備用。實施例21、氧化白藜蘆醇對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度(mic)檢測用二倍稀釋法將實施例1中製備的氧化白藜蘆醇樣液加入rpm-1640培養基中至氧化白藜蘆醇的濃度分別為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml。取96孔細菌培養板，每孔加入100μl濃度為106cfu/ml的紅色毛癬菌菌液及100μl各濃度的氧化白藜蘆醇樣液，並設置空白對照(不含氧化白藜蘆醇樣液的培養基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)，同時設置對照培養板(不加菌液)。28℃恆溫培養箱中培養93h，通過肉眼觀察，得出氧化白藜蘆醇對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度為0.5mg/ml。然後將96孔培養板取出，每孔加入20μl5.0mg/ml的mtt試劑，28℃下恆溫孵育3-4h後，取出96孔培養板，2500r/min離心5min，每孔吸出100μl上清液棄去，再加入100μl二甲亞碸，震蕩30min後再次離心，將上清液轉移至新96孔板中，酶標儀530nm下檢測吸光值，根據實驗數據通過公式：抑制率(％)＝(1-測定孔od530nm值/空白對照孔od530nm值)×100％計算各濃度氧化白藜蘆醇對紅色毛癬菌的抑菌率，結果見表1，並繪製成圖，如圖1所示，由表1和圖1可知：氧化白藜蘆醇對紅色毛癬菌的抑制率具有濃度依賴性，隨著濃度的升高，氧化白藜蘆醇(oxy)對紅色毛癬菌的抑制活性在逐漸增強，在濃度為0.5mg/ml時其對紅色毛癬菌的抑制率達到98.69％，可得出其mic值為0.500mg/ml。表1不同濃度氧化白藜蘆醇樣液對紅色毛癬菌的抑菌率不同濃度組濃度mg/ml抑制率(％)空白0010.007810.46±0.38g20.015614.38±2.30f30.0312529.41±2.46e40.062547.06±1.00d50.12568.63±2.10c60.2586.27±2.47b70.598.69±0.38a8199.35±0.38a註：肩字母相同表示差異不顯著，肩字母不同表示差異顯著(p<0.01)2、硝酸益康唑(mn)對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度(mic)檢測將硝酸益康唑溶於100％的二甲基亞碸(dmso)中製得濃度為10mg/ml的硝酸益康唑樣液，用二倍稀釋法將硝酸益康唑樣液加入rpm-1640培養基中至硝酸益康唑的濃度分別為16.00、8.00、4.00、2.00、1.0、0.50、0.25、0.125μg/ml。取96孔細菌培養板，每孔加入100μl濃度為106cfu/ml的紅色毛癬菌菌液及100μl各濃度的硝酸益康唑樣液，並設置空白對照(不含硝酸益康唑樣液的培養基+菌液)、溶劑對照(dmso溶液+菌液)，同時設置對照培養板(不加菌液)。28℃恆溫培養箱中培養93h，通過肉眼觀察，得出硝酸益康唑對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度為1.0μg/ml。然後將96孔培養板取出，每孔加入20μl5.0mg/ml的mtt試劑，28℃下恆溫孵育3-4h後，取出96孔培養板，2500r/min離心5min，每孔吸出100μl上清液棄去，再加入100μl二甲亞碸，震蕩30min後再次離心，將上清液轉移至新96孔板中，酶標儀530nm下檢測吸光值，根據實驗數據通過公式：抑制率(％)＝(1-測定孔od530nm值/空白對照孔od530nm值)×100％計算各濃度硝酸益康唑對紅色毛癬菌的抑菌率，結果見表2。表2不同濃度硝酸益康唑樣液對紅色毛癬菌的抑菌率註：肩字母相同表示差異不顯著，肩字母不同表示差異顯著(p4.0，則為拮抗效應。表3相同濃度氧化白藜蘆醇和硝酸益康唑混合溶液對紅色毛癬菌的抑菌率不同濃度組濃度抑菌率(％)空白0011/256mic3.7±3.44h21/128mic8.64±2.57g31/64mic17.28±0.36f41/32mic38.27±1.63e51/16mic62.96±1.78d61/8mic87.65±3.62c71/4mic91.98±1.98b81/2mic99.38±0.62a註：肩字母相同表示差異不顯著，肩字母不同表示差異顯著(p4.0，則為拮抗效應。氧化白藜蘆醇和硝酸益康唑的fici指數為：fici(氧+抗)＝1/4+1/4＝0.5，即氧化白藜蘆醇與硝酸益康唑聯合使用對白色念珠菌的抑制作用具有協同效應。實施例4氧化白藜蘆醇對白色念珠菌的最小殺菌濃度(mbc)檢測在實施例3中最小抑菌濃度的基礎上，按照mic的試驗方法，將實施例1中製備的氧化白藜蘆醇樣液加入rpm-1640培養基中至氧化白藜蘆醇的濃度分別為2mic、4mic、8mic、16mic，取96孔細菌培養板，每孔加入100μl濃度為106cfu/ml的白色念珠菌菌液，再加入100μl將培養基稀釋後的各濃度的氧化白藜蘆醇溶液，並設置空白對照(不含樣液的培養基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)。28℃培養箱中培養48h，然後每孔取20μl菌液接種在新鮮的營養瓊脂培養基上，過夜培養，無活菌生長的最小濃度即為最小殺菌濃度，經測試得到氧化白藜蘆醇對白色念珠菌的最小殺菌濃度4mg/ml。實施例5氧化白藜蘆醇對白色念珠菌生長曲線的影響將培養至對數期的白色念珠菌用rpm-1640培養基稀釋至107cfu/ml，取1ml稀釋好的菌液分別加入三組含實施1中製備的氧化白藜蘆醇樣液的新鮮rpm-1640培養基中，各組培養基體積為20ml，其中氧化白藜蘆醇濃度分別為1mic、1/2mic、1/4mic，同時設置溶劑對照組(dmso溶液+菌液)。在28℃，120rpm條件下培養，每隔兩小時用酶標儀在600nm下測其吸光值，繪製生長曲線，結果如圖2，由圖2可知，與溶劑對照組相比，氧化白藜蘆醇濃度為mic值時，其完全抑制了白色念珠菌的生長，濃度為1/2mic值時，其對白色念珠菌的生長起到了延遲作用，在24h之後白色念珠菌才開始生長，濃度為1/4mic值時，其對白色念珠菌的生長起到了一定的抑制作用，在該濃度下，白色念珠菌的生長速度始終低於溶劑對照組。實施例6氧化白藜蘆醇對白色念珠菌的時間-殺菌曲線培養至對數期的菌液稀釋至107cfu/ml，取1ml稀釋好的菌液分別加入三組含實施1中製備的氧化白藜蘆醇樣液的新鮮rpm-1640培養基中，各組培養基體積為20ml，其中氧化白藜蘆醇濃度分別為1mic、2mic、4mic，同時設置溶劑對照組(dmso溶液+菌液)。搖勻後在28℃，150rpm條件下培養，每隔0、2、4、8、12、16、20、24和48h取樣，用無菌水稀釋成10倍和100倍，在28℃下於固體培養基上培養48h，並進行觀察與計數，繪製其時間-殺菌曲線，結果如圖3所示，由圖3可知，氧化白藜蘆醇對白色念珠菌的時間-殺菌作用具有時間和濃度依賴性，既隨著時間的延長和濃度的增加其對白色念珠菌的殺傷作用在逐漸增強，在濃度達到4mic時，其作用48h之後可以將白色念珠菌完全殺死。本發明中，除了用無水乙醇製備桑枝提取物，還可用甲醇；除了用乙酸乙酯製備桑枝萃取物，還可用氯仿或丙酮。最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。當前第1頁12