分離和擴增血液間充質幹細胞的方法
2023-05-06 20:51:36
分離和擴增血液間充質幹細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，尤其是一種分離和擴增血液間充質幹細胞的方法。該方法包括以下步驟：步驟a：收集血液樣品，步驟b：分離血液樣品中單核細胞成分，步驟c：將單核細胞成分接種於高分子材料修飾的培養皿，步驟d：分離間充質幹細胞，步驟e：培養和擴增間充質幹細胞。本發明使用了成分確定的包被成分對細胞培養板進行包被，有效提高了分離的純度和效率。在α-MEM中添加b-FGF，EGF，TGF-β等細胞因子能夠穩定的維持幹細胞生長，能夠實現血液間充質幹細胞的大量擴增。
【專利說明】分離和擴增血液間充質幹細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其是一種分離和擴增血液間充質幹細胞的方法。
【背景技術】
[0002]幹細胞是指生物體內能夠進行自我更新，並維持機體各組織細胞新陳代謝的一群細胞。同時，在生物體內各種組織受到內源或外源性的損害時，幹細胞可以被激活執行分化功能，從而達到修復該組織的目的。間充質幹細胞在適當的條件下，具有強大的增值能力和分化能力，能夠修復多種組織損傷，包括骨骼，肌肉，神經等組織，因此，間充質幹細胞在再生醫學治療領域引起了越來越多的重視。
[0003]已經證明血液中含有分化能力較高，免疫排斥反應較小的間充質幹細胞。各級血庫、臍帶血銀行的建立為實現自體細胞移植提供基礎。但是，由於血液中間充質幹細胞含量極低(以臍帶血為例，I X IO8個單核細胞中僅含有0.5-30個，而成年血液中幹細胞數量遠低於此數量)，因此如何高效分離和擴增這些細胞成為了阻礙血液間充質幹細胞向臨床轉化的難題。目前，多利用該細胞在培養皿的吸附能力，對臍帶血間充質幹細胞進行分離，但是成功率低，並且在擴增過程中難以保持幹細胞特性。本發明包括利用高分子化學材料對培養皿進行修飾，配合添加多種生長因子的培養基，構建血液間充質幹細胞擴增環境，實現了該細胞的高效擴增和分離。
[0004]骨髓當中含有豐富的間充質幹細胞，因此得到了最為廣泛和深入的研究。研究證實，骨髓間充質幹細胞表達特定的表面抗原表型，比如，⑶45-，⑶34-，⑶29+，⑶90+，⑶73+和CD105+。在體外和體內環境中可向骨骼，軟骨，神經以及胰島等細胞分化。另外，骨髓間充質幹細胞具有免疫調節的功能，分泌多種免疫相關信號分子，從而在免疫性疾病治療過程中發揮作用。但是，儘管骨髓間充質幹細胞細胞較易分離和培養，但是，骨髓來源有限，難以滿足臨床大量的需求。即便是進行病人的自體移植，患者也必須承擔額外的痛苦。在其他組織，比如肌肉，脂肪，腦以及血液等其它組織也能分離獲得間充質幹細胞。這些細胞有與骨髓間充質幹細胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去血液外，應用其他組織的間充幹細胞面臨著和應用骨髓間充質幹細胞相同的問題，及樣品稀缺，不足以滿足臨床需求。
[0005]已經證實，血液中含有活性很強的幹細胞群，包括造血幹細胞和間充質幹細胞。血液中的間充質幹細胞與骨髓幹細胞相似，有著相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文獻表明,血液幹細胞有著更原始的幹細胞特性和更低的免疫原性。同時,應用血液治療糖尿病，神經損傷以及血管壞死等疾病也屢見報導。
【發明內容】
[0006]本發明的方法通過獲取血液，利用特定的高分子化學物質而不是使用成分難以確定的細胞外基質，對其中的間充質幹細胞進行分離純化，並配合適當的培養基，實現對血液的高效擴增。
[0007]本發明解決其技術問題所採用的技術方案是:一種分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，包括以下步驟:
步驟a:收集血液樣品，
步驟b:分離血液樣品中單核細胞成分，
步驟c:將單核細胞成分接種於高分子材料修飾的培養皿，
步驟d:分離間充質幹細胞，
步驟e:培養和擴增間充質幹細胞。
[0008]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述血液樣品自醫院採集，或自血液庫中獲取。
[0009]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述血液樣品是人的血液樣品。
[0010]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述血液樣品採集自於早產或正常分娩胎兒以及成年人血液。
[0011]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述血液樣品均經過肝素抗凝，羥甲基纖維素裂解紅細胞，密度梯度離心獲取單核細胞成分之後進行接種。
[0012]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述步驟c中，高分子材料是指聚乙二醇(PEG)和精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D) (RGD)按同種濃度Iml:0.01g混合。本發明提出聚乙二醇(PEG)和精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D) (RGD)Olg的比例混合，可以比較好的分離和純化血液中的間充質幹細胞，從而既提高了分離純化效率，也避免了使用化學成分極其複雜的細胞外基質。
[0013]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述步驟e中，培養和擴增間充質幹細胞是指應用血液間充質幹細胞培養基進行培養和擴增。
[0014]根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述血液間充質幹細胞培養基包括:a -MEM, Pen-Strep, b_FGF，EGF, TGF- β。本發明使用含有 a -MEM, Pen-Strep, b-FGF, EGF,TGF-β的培養基，在前期可以維持原代細胞的活性，在後期可以高效擴增血液間充質幹細胞。其中，α-ΜΕΜ為α-最小必需極限培養基；Pen-Str印為青黴素-鏈黴素，b-FGF為b-成纖維細胞生長因子，EGF為表皮細胞生長因子，TGF-β為轉化生長因子。
[0015]本發明所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的主要步驟如下:
在無菌條件下獲取血液，25-200ml，經過肝素抗凝。血液間充質幹細胞的分離純化過程在取樣後24小時內進行。
[0016]首先，使用同體積a -MEM稀釋抗凝過的血液，與5g/L的甲基纖維素按4:1混合，靜置30分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心後，用PBS緩衝液製成單細胞懸液，疊加到相對密度1.077的淋巴細胞分離液上，2500rpm離心20min，取界面層，加PBS緩衝液製成單細胞懸液，離心洗滌。將細胞加入用聚乙二醇(PEG)和R⑶修飾的細胞培養板上。細胞在α-ΜΕΜ中培養，該培養基中含有Pen-Str印，b-FGF, EGF, TGF-β等添加成分。細胞達到90%融合時，進行傳代。傳代時，使用普通培養皿，並在上述含有添加成分的培養基中進行細胞的擴增。[0017]本發明的有益效果是，本發明使用了成分確定的包被成分對細胞培養板進行包被，有效提高了分離的純度和效率。在α-ΜΕΜ中添加b-FGF，EGF，TGF-β等細胞因子能夠穩定的維持幹細胞生長，能夠實現血液間充質幹細胞的大量擴增，從而完成了本發明。【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0019]圖1是本發明培養臍帶血間充質幹細胞20天後的結果。
【具體實施方式】
[0020]現結合以下實例來更加詳細的描述本發明的用於臍帶血中間充質幹細胞分離和擴增的方法。提供實例的目的僅在於示例性的闡述名發明，不能將其理解為是對本發明範圍和實質的限制。
[0021]實施例1:修飾細胞培養板
將聚乙二醇(PEG)和R⑶材料按0.25g:8ml的比例重溶於氯仿中，取培養容器，把上述溶液均勻塗布於其上，低溫下抽吸48h，得到透明的覆蓋於玻片上的生物材料。加入IOmg /mL的Sulf0.LC.SPDP磷酸鹽緩衝液(PBS，pH:8.0)0.5mL，室溫下不停振動，反應12h ;PBS緩衝液衝洗3次，室溫下不停振動，反應24h ；PBS緩衝液衝洗3次，自然乾燥。材料經環氧乙烷消毒後備用。
[0022]實施例2:分離和擴增臍帶血間充質幹細胞
將在無菌條件下採集的臍帶血以體積比1:1與細胞在α-ΜΕΜ混合稀釋，與5g/L的甲基纖維素按4:1混合，靜置30分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心後，用PBS緩衝液製成單細胞懸液，疊加到相對密度1.077的淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque上,2500rpm離心20min，取界面層，加 PBS緩衝液製成單細胞懸液，離心洗滌。
[0023]因為淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque的比重為1.077g/ml,其比單核細胞重但比紅細胞輕，因此可以將單核細胞與殘留的紅細胞分離。收集界面層即可收集到比較純的單核細胞。
[0024]將獲取的單核細胞用PBS緩衝液稀釋，2000rpm,離心lOmin，去掉上清液，並加入新的PBS緩衝液打散，稀釋。以同樣的條件再洗滌一次，可見沉積於離心管底部的細胞。
[0025]隨後，使用添加10%胎牛血清的臍帶血間充質幹細胞培養基均勻打散收集到的細胞。臍帶血間充質幹細胞培養基是指在添加l%Pen-Strep, 50ng/ml b-FGF, 10ng/mlEGF,lOng/ml TGF-β等生長因子的α-ΜΕΜ培養基。
[0026]細胞打散後，接種於實施例1製備的細胞培養板，7天後更換培養基。洗滌培養板，除去未貼壁細胞。繼續使用添加10%胎牛血清的臍帶血間充質幹細胞培養基培養，每7天換液一次，直至細胞接近90%融合。
[0027]將90%融合細胞用胰酶進行消化，接種於一般培養板，使用10%胎牛血清的臍帶血間充質幹細胞培養基培養，3天換液一次。直至融合，並進行下一次傳代。
[0028]實施例3:培養的間充質幹細胞表面抗原表徵
為了確定上述細胞具有間充質幹細胞表面抗原的特徵，使用FACs對細胞表面進行分析。結果顯不於表1。
[0029]表1
【權利要求】
1.一種分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，該方法包括以下步驟: 步驟a:收集血液樣品， 步驟b:分離血液樣品中單核細胞成分， 步驟c:將單核細胞成分接種於高分子材料修飾的培養皿， 步驟d:分離間充質幹細胞， 步驟e:培養和擴增間充質幹細胞。
2.根據權利要求1所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述血液樣品自醫院採集，或自血液庫中獲取。
3.根據權利要求1所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述血液樣品是人的血液樣品。
4.根據權利要求1或2或3所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述血液樣品採集自於早產或正常分娩胎兒以及成年人血液。
5.根據權利要求4所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述血液樣品均經過肝素抗凝，羥甲基纖維素裂解紅細胞，密度梯度離心獲取單核細胞成分之後進行接種。
6.根據權利要求1所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述步驟c中，高分子材料是指聚乙二醇和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸按同種濃度Iml:0.01g混合。
7.根據權利要求1所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述步驟e中，培養和擴增間充質幹細胞是指應用血液間充質幹細胞培養基進行培養和擴增。
8.根據權利要求7所述的分離和擴增血液間充質幹細胞的方法，其特徵是，所述血液間充質幹細胞培養基包括:a -MEM, Pen-Strep, b_FGF，EGF, TGF-β。
【文檔編號】C12N5/0775GK103789260SQ201410046445
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月10日 優先權日:2014年2月10日
【發明者】孫博 申請人:江蘇霖峰細胞技術股份有限公司