一種錳配合物及其製備方法和用途的製作方法

2023-10-17 07:25:14 1

專利名稱：一種錳配合物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及磁共振成像(MRI)技術領域，特指一種用於磁共振成像的成像劑及其應用。

背景技術：
磁共振成像(MRI)技術一種無創性快速檢測腦腫瘤和血管的成像方法。磁共振成像具有安全、無創、無電離輻射、無放射性損傷、高時間分辨力及空間分辨力等優點，目前已成為臨床上診斷血管病變、顱內腫瘤等的主要影像學檢查技術。自1983年使用Gd-DTPA進行臨床試驗以來，為提高成像劑的靈敏度和靶向性，降低其毒性，人們對MRI造影劑進行了大量的研發(B.Jebasingh，V.Alexander.Inorg.Chem.，2005，449434-9443)。常用的成像劑為二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)和四乙酸四氮雜環十二烷(Gd-DOTA)。Gd-DTPA和Gd-DOTA為細胞外分布，不能通過正常的血腦屏障，其作用機制是改變局部組織的磁環境而間接增強。由於分子量小、半衰期短、體內信號弱，造影時間短、滲透壓較高，常需加大劑量乃至多次注射，副作用較大(俞開潮，王國平，丁尚武等.波譜學雜誌，2004，21(4)505-525)。為增加成像劑的親脂性，降低其滲透壓，提高對靶組織如肝臟的選擇性，Unger等人合成聚集有順磁性金屬螯合物Gd-DTPA，Mn-EDTA等的脂質體成像劑(Unger E，Shen D K，Fritz T.InvestRadiol.，1994，29S168-169)。雖然連接大分子順磁性成像劑的水質子的弛豫速較小分子成像劑有較大提高，但化合物存在穩定性和生物相溶性等問題。低成本，生物相溶性的腫瘤靶向性大分子順磁性成像劑的研究仍然是一個挑戰。此外由於增進磁共振成像內部結構的可見性的釓基造劑可造成腎源性系統纖維化(NSF)。FDA已要求小分子釓基成像劑生產商在其產品標籤上增加「黑框」警告。超順磁性氧化鐵粒子(SPIO)是目前研究得較多的磁化率型成像劑，其磁矩遠比其它順磁性物質高，對鄰近組織中氫核的弛豫速率起明顯的加速作用，用作成像劑時所需劑量很小，但因其水溶性極小，只能採用勻漿或膠體的形式給藥。超小型超順磁性氧化鐵、單晶氧化鐵微聚體、脂質體包裹的超順磁性氧化鐵等均屬於T2陰性造影劑，不符合人類對亮的、白的物體敏感的特性(1.Li Z，Wei L，GaoM Y.Adv.Mater.，2005，171001-1005；2.Hu F Q，Wei L，ZhouZ.Adv.Mater.，2006，182553-2556)。與此同時，SPIO外包被與其他活性物質的連接也受到較多限制。通過降低成像劑的用量來降低其對生物體的毒性已成為人們研究成像劑的共識。隨著MRI新成像技術(如MR血管造影、灌注MR、擴散加權MRI等)的迅速發展及其在臨床診斷中應用的普及，MRI成像劑的研究和開發面臨更大的挑戰，用於腫瘤診斷的成像劑也越來越受到重視。研製低毒性，高弛豫率，靶向性強，多重作用，體內穩定的造影劑是未來的發展趨勢。
錳為生物體內存在的微量元素，順磁性錳配合物能特異性聚集在腫瘤細胞上，成為新型腫瘤靶向性分子(陳秋雲，黃娟，高靜，郭文杰，「具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物及其製備方法」，中國發明專利號200710192228.5)。進一步研究我們發現螯合型錳配合物在體類能顯著提高腫瘤細胞的成像效果，可作為新型腫瘤靶向型具有治療作用的磁共振成像造影劑。具有腫瘤治療作用的磁共振成像造影劑未見報導。


發明內容
本發明的目的是提供一種製備新型磁共振成像劑的方法。新型磁共振成像劑成分為二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合錳螯合物。試驗結果顯示能顯著提高體內肝癌細胞MRI成像的特性。本發明的成像劑可通過腹腔注射或靜脈注射。該成像劑可用於腫瘤的體外和體內磁共振成像。也可用於區別正常組織和腫瘤細胞的磁共振成像劑。這是首次報導的具有治療效果的多功能成像劑，與臨床運用的單一成像功能的成像劑不同。
一種錳配合物，為二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合錳，分子式C17H21Cl2MnN3O2，結構如式1
式1 式1簡寫為LMnCl2，其中L代表N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺，其結構式見式2
式2 製備上述所說錳配合物的方法是 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶於水溶液中，控制溫度在20-40℃；加入氯化胺為催化劑，氯化銨與MnCl2的摩爾比為0.2∶1，最佳反應溫度為30℃，反應時間1-4小時，最佳反應時間為2小時。產物經矽膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。
上述錳配合物肝癌體內磁共振成像方面的運用，與不加錳配合物的空白水溶液相比(見圖1)，配合物能顯著提高腫瘤診斷效果，說明配合物具有磁共振成像功能和腫瘤靶向性，可用作腫瘤磁共振成像造影劑。目前臨床運用的磁共振成像劑主要為釓基造(Gd-DTPA)，增進磁共振成像內部結構的可見性的釓基造劑可造成腎源性系統纖維化(NSF)。FDA已要求小分子釓基成像劑生產商在其產品標籤上增加「黑框」警告。本發明實驗數據表明多齒配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺錳配合物具有順磁性，一次注射0.5ml濃度為5mg/ml的配合物水溶液在體類能顯著提高腫瘤細胞的磁共振成像效果。錳配合物在90分鐘內能持續增強腫瘤部位的成像效果，說明具有良好的穩定性和腫瘤靶向性。由於用量低，錳為生物體內存在的微量元素，由於配合物還具有良好的抗腫瘤活性，所以配合物可作為新型低毒性多功能腫瘤靶向型磁共振成像造影劑。這是首次報導的具有治療效果的多功能成像劑，與臨床運用的單一成像功能的成像劑不同。



圖1錳配合物對大鼠體內腫瘤磁共振成像的影響。
(a)空白；(b)注射後30分鐘；(c)，注射後60分鐘；(d)注射後90分鐘
具體實施例方式 1試劑和原料 實驗中所用試劑均為分析純，除特別註明外，未經進一步處理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析儀測定，紅外光譜用Fr-IR 169(固體用KBr壓片)。
抗腫瘤試驗試劑如下(1)RPMI 1640培養基(RPMI 1640+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO3 2.2g/l+青黴素0.13g/l+鏈黴素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培養基(DMEM+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO3 2.2g/l+青黴素0.13g/l+鏈黴素0.15g/l)。(3)MTT(美國Amresco公司產品)。
2、錳配合物的合成 實施例1(最佳反應條件舉例) 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶於水溶液中，控制在30℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應時間2小時。產物經矽膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield，63％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實施例2 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比2∶1溶於水溶液中，控制在20℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應時間1小時。產物經矽膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield25％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實施例3 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶於水溶液中，控制在40℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應時間1小時。產物經矽膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield45％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實施例4 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶於水溶液中，控制在20℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應時間4小時。產物經矽膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield55％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實施例5抗腫瘤活性測定 以實施例1得到的配合物為受試化合物 篩選的細胞株有人癌細胞株(HepG2，U251)(由江蘇大學藥學院提供)。測定採用溴化四氮唑藍(MTT)法。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性溴化四氮唑藍還原為難溶性的藍紫色結晶物(Formazan)並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值。
操作步驟如下 3.1.1接種取處於指數生長期，狀態良好的細胞一瓶，加入適量胰蛋白酶 消化液，消化使貼壁細胞脫落，用含12％小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養液配成細胞懸液，計數，並將細胞密度調整稀釋至2.2*104/ml.取細胞懸液接種於96孔板上，180ul/孔(含腫瘤細胞4000/孔)。
3.1.2培養將培養板轉入恆溫CO2培養箱中，在37℃，5％CO2及飽和溼度條件下培養24小時。
3.1.3加藥受試化合物先用DMSO或超純水配製成0.1M濃度，再作4個稀釋度，濃度依次為10-4M，10-5M，10-6M，10-7M。加入受試化合物，20ul/孔，培養48小時。每組設3個平行孔，並重複3次。
3.1.4染色 3.1.4.1將MTT加入96孔板(貼壁細胞)中，20ul/孔，置於培養箱中孵育4小時，吸棄孔內上清液，加入DMSO100ul/孔，置平板搖床上震蕩5分鐘。
3.1.4.2將MTT加入96孔板中(懸浮細胞)，20ul/孔，置於培養箱中孵育4小時，再加入20％SDS 50ul/孔，置於培養箱中過夜。
3.1.5測定酶標儀設定波長為570nm，參考波長為630nm，測定96孔板每孔吸光值，記錄結果並計算細胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。
3.3數據處理 3.3.1細胞抑制率的計算 抑制率＝(對照組平均OD值-給藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100％ IC50的計算根據中國藥科大學新藥篩選中心提供的IC50軟體計算所得。
MTT法測試結果示於表1。
表1錳配合物對癌細胞抑制作用MTT實驗數據
錳配合物[LMnCl]對種癌細胞U251半數抑制率需要的化合物濃度IC50為4.5umol/L，錳配合物[LMnCl2]癌細胞半數抑制率需要的化合物濃度為IC50為在12umol/L。而MnCl2在小於300umol/L對腫瘤細胞的生長沒有抑制作用。這說明本發明的錳配合物具有良好的抗腫瘤活性，可作為抗癌藥用先導物。
實施例6腫瘤體內成像實驗 以實施例1得到的錳配合物為受試化合物 腫瘤體內磁共振成像實驗用西門子3.0TMR成像儀測定。將肝癌細胞HepG-2接種於體重170-200克的腋下。接種腫瘤5天後的大鼠用於成像實驗。核磁共振成像採用multislice-multiecho T1-weighted spin-echo sequence成像方法，掃描參數為TR＝800ms、TE＝11.4ms，影像切片厚度1mm。每一個動物首先在注射探針前作一次腫瘤掃描，然後在靜脈注射後每隔30分鐘掃描一次。腹腔靜脈注射方式，一次注射0.5ml濃度為5mg/ml成像劑的水溶液。成像結果示於圖1。
圖1數據顯示與不含錳配合物的空白水溶液相比，錳配合物顯著增強腫瘤細胞的磁共振成像清晰度。目前臨床運用的磁共振成像劑主要為釓基造(Gd-DTPA)，增進磁共振成像內部結構的可見性的釓基造劑可造成腎源性系統纖維化(NSF)。FDA已要求小分子釓基成像劑生產商在其產品標籤上增加「黑框」警告。本發明數據錳配合物一次注射0.5ml濃度為5mg/ml在體類能顯著提高腫瘤細胞的成像效果，由於用量低，錳為生物體內存在的微量元素，所以配合物可作為新型低毒性多功能腫瘤靶向型磁共振成像造影劑。
權利要求
1.一種錳配合物，其特徵在於所述錳配合物具有如下結構
2.權利要求1所述錳配合物的製備方法，具體為將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶於水溶液中，以氯化銨為催化劑進行合成，氯化銨與MnCl2的摩爾比為0.2∶1，反應溫度為20-40℃，反應時間1-4小時，產物經矽膠色譜柱層析純化，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物。
3.權利要求1所述錳配合物的製備方法，其特徵在於反應溫度為30℃，反應時間2小時。
4.權利要求1所述錳配合物的在製備抗腫瘤藥物中以及在製備腫瘤磁共振成像造影劑中的應用。
5.權利要求1所述錳配合物作為腫瘤磁共振成像造影劑使用的量為一次使用0.5ml濃度為5mg/ml的錳配合物水溶液。
全文摘要
一種錳配合物及其製備方法和用途，涉及磁共振成像(MRI)技術領域，所述錳配合物為二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合錳，分子式C17H21Cl2MnN3O2，所述錳配合物的製備方法，具體為將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶於水溶液中，控制在20-40℃；以氯化銨為催化劑進行合成，氯化銨與MnCl2的摩爾比為0.2∶1，反應溫度為30℃，反應時間1-4小時，產物經矽膠色譜柱層析純化，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物。上述錳配合物肝癌體內磁共振成像方面的運用，與不加錳配合物的空白水溶液相比，配合物能顯著提高腫瘤診斷效果，說明配合物具有磁共振成像功能和腫瘤靶向性，可用作腫瘤磁共振成像造影劑。
文檔編號A61K31/555GK101812092SQ20101015881
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者陳秋雲 申請人:江蘇大學