水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法
2023-09-13 04:27:25 2
專利名稱：水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種檢測技術領域的方法，特別是一種水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法。
背景技術：
賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲是一類寄生於人和動物體內的腸道原蟲。發達國家人類介水腸傳播疾病的病因中，原蟲是介水傳播的主要原因之一。汙染飲用水的主要原蟲為腸賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲。當前關於兩蟲最權威的美國EPA1623檢測方法成本昂貴，實驗條件要求高。如1623方法中涉及大量昂貴消耗品，如專用濾囊、免疫磁珠分離試劑盒、螢光染色試劑盒、DAPI等，這些都屬於一次性消費品，且不可回收再利用。考慮到目前中國的具體國情，即資金方面、實驗室條件以及實驗人員的技術水平都有限等，此方法在國內普通自來水廠無法得以推廣實施。
經對現有技術文獻檢索發現，餘貴英等(水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲檢測方法的探討.中國衛生檢驗雜誌，Vol.14，No.5，2004)採用膜過濾一梯度分離-GiemSa染色、膜過濾一IMS一GiemSa染色對EPA1623《免疫磁分離螢光抗體法》的3個關鍵步驟一原蟲濾囊過濾濃縮一磁抗體分離(IMS)一螢光抗體染色鑑定(IFA)做了適當的改進，並對原蟲的染色特徵，形態結構和回收率的檢測進行了方法學的探討和比較分析。其結果中對於膜-IMS-GiemSa染色，由於濾囊改成了濾膜，螢光染色改成了Giemsa染色，成本比囊-IMS-IFA約降低了60％，同時實驗條件要求也較低，不需要貴重儀器設備如螢光顯微鏡等，但必須由有工作經驗的實驗員觀察結果，以減少誤差，而且成本實際仍然較高；而膜-梯度分離-Giemsa染色是傳統的檢測方法，操作簡便，成本很低，僅相當於囊-IMS-IFA的10％，但由於未經IMS的特異性分離，染片背景較複雜，有較多藻類及雜質幹擾，形態結構特徵的鏡檢確認有一定的難度。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法。使其可減輕賈第蟲和隱孢子蟲傳統檢測方法中背景較多雜質的幹擾，提高形態結構特徵的鏡檢確認準確度。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明通過採用微孔濾膜過濾，經乙酸乙酯福馬林(10∶1)梯度分離，鐵蘇木和改良抗酸聯合染色法檢測水環境中隱孢子蟲和賈第氏蟲，通過膜濾前篩網水樣預處理減輕後續鏡檢背景複雜性，通過鐵蘇木和改良抗酸染色法分別實現對賈第蟲和隱孢子蟲的最佳染色。
包括如下具體步驟1)採集至少10L水樣，24小時內運回實驗室，4℃避光保存或立即過濾；2)水樣先用500目篩網過濾水樣，然後用孔徑3μm的濾膜進行抽濾；3)抽濾結束後，將濾膜連同濾膜上的附著物放入三角瓶中並加入50mL清洗緩衝液；4)用約5-10mL清洗緩衝液手洗濾膜，將濾膜上的附著物充分洗淨，洗液全部收集到三角瓶中；5)將裝有濾膜及緩衝液的三角瓶置于振蕩器上振蕩15min，並重複三次。以使濾膜上的隱孢子蟲卵囊與賈第鞭毛蟲孢囊被釋放出來；6)振蕩完成後，將三角瓶中的液體全部轉入50mL離心管中，8000r/min離心15min；7)離心結束後，取出離心管並小心吸去上層清液，吸去上清液時需非常小心，以免振蕩到下層沉澱，若下層沉澱被振蕩到，可考慮再次離心，但離心次數越少越好；8)在離心管中加入1mL 10％福馬林溶液，振蕩，使沉澱和福馬林溶液充分混勻；9)再加入10mL乙酸乙酯至50mL離心管中，振蕩離心管，使管內物質充分混勻；10)將50mL離心管置於離心機中，3500r/min離心15min；11)離心結束後取出離心管，離心管內液體此時分為2層，小心棄去上層；12)吸取適量混和後的懸浮液塗於兩片載波片上，晾乾；13)晾乾後，滴加50μL無水乙醇固定塗片，室溫乾燥；
14)乾燥後，一片用鐵蘇木素液染5-10min。然後加0.5％鹽酸酒精脫色，水洗，晾乾，最後用中性樹膠封片，並用油鏡觀察並計數；15)另一片先用染色液5-10min，接著水洗，然後滴加硫酸，1-10min，水洗，最後滴加溶液，1min後水洗，晾乾，中性樹膠封片，油鏡觀察並計數。
所述的染色液，是指酸性復紅4g，95％酒精20mL，石炭酸8mL，蒸餾水100ml；所述的硫酸，是指濃硫酸10mL，緩緩加入90mL蒸餾水中，邊加邊攪拌；所述的溶液，是指孔雀綠0.2g，溶於100mL蒸餾水。
採用本發明提供的檢測方法可以有效減輕鏡檢背景雜質幹擾，採用Giemsa染色雖對隱孢子蟲和賈第氏蟲染色效果均比較好，但鐵蘇木素染色對賈第氏蟲的效果更好，並且操作比較簡單，實驗時間也比較短；而改良抗酸染色方法是對隱孢子蟲效果更好的方法，採用改良抗酸染色隱孢子蟲卵囊被染成紅色，而其他的雜質為藍綠色，很強的顏色對比，對最終隱孢子蟲的確認有很大幫助。
具體實施例方式
以下結合具體的實施例對本發明的技術方案作進一步詳細描述。
實施例採用上海某汙水廠出水水樣。整個發明實現過程如下取汙水廠出水10L水樣，按具體實施步驟1-11操作後，將剩餘的水層和沉澱充分混勻。分別吸取150μL混合後的液體塗於4片載波片上，晾乾後滴加50μL無水乙醇固定塗片，室溫乾燥。乾燥後分別進行Giemsa染色、抗酸染色、鐵蘇木染色和改良抗酸染色。不同染色方法比選實驗結果如下表所示
注「+」表示鏡檢觀察到兩蟲，「-」表示沒有觀察到。G表示賈第鞭毛蟲，C表示隱孢子蟲。
實驗結果顯示採用500目篩網預先將水樣過濾後，鏡檢時視野雜質影響明顯減輕。對於染色效果，5次實驗中Giemsa染色效果較平均，對賈第鞭毛蟲有2次檢出，隱孢子蟲也有2次；抗酸染色有對賈第鞭毛蟲染色很差，只有1次檢出，而對隱孢子蟲染色效果較好，有2次檢出；鐵蘇木染色對賈第鞭毛蟲的檢出率最高，有3次，但對隱孢子蟲的檢出率較差，只有1次；改良抗酸染色對賈第鞭毛蟲染色較差，只有1次，但是對隱孢子蟲的染色效果最好，有3次。
從四種染色結果看Giemsa染色是一種對隱孢子蟲和賈第氏蟲染色效果均比較好的染色方法。兩蟲檢出率處於四種染色方法中上水平。抗酸染色的效果對隱孢子蟲和賈第氏蟲都比較差，抗酸染色主要是針對抗酸桿菌。鐵蘇木素染色對賈第氏蟲的效果最好，是檢出率最高的染色方法，並且操作比較簡單，實驗時間也比較短。改良抗酸染色方法是對隱孢子蟲效果最好的方法，但對賈第氏蟲的效果很差。採用改良抗酸染色隱孢子蟲卵囊被染成紅色，而其他的雜質為藍綠色，很強的顏色對比，對最終隱孢子蟲的確認有很大幫助。因此採用鐵蘇木和改良抗酸聯合染色要比同時採用Giemsa染色效果好。
採用本發明檢測方法可有效改進傳統病原學檢測賈第蟲和隱孢子蟲方法。採用500目篩網預過濾水樣可明顯減輕鏡檢視野雜質的影響，採用鐵蘇木素染色和改良抗酸染色聯合檢測兩蟲效果優於單獨採用Giemsa染色。
權利要求
1.一種水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵在於，通過採用微孔濾膜過濾，經乙酸乙酯和福馬林為10∶1梯度分離，鐵蘇木和改良抗酸聯合染色法檢測水環境中隱孢子蟲和賈第氏蟲，通過膜濾前篩網水樣預處理減輕後續鏡檢背景複雜性，通過鐵蘇木和改良抗酸染色法分別實現對賈第蟲和隱孢子蟲的染色。
2.根據權利要求1所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，包括如下具體步驟1)採集≤10L的水樣運回實驗室保存；2)水樣過濾，抽濾；3)將濾膜連同濾膜上的附著物放入瓶中並加入50mL清洗緩衝液；4)用5-10mL清洗緩衝液手洗濾膜，將濾膜上的附著物充分洗淨，洗液全部收集到瓶中；5)將裝有濾膜及緩衝液的瓶置于振蕩；6)將瓶中的液體全部轉入離心管離心；7)取出離心管、吸去上層清液；8)在離心管中加入1mL 10％福馬林溶液，振蕩，使沉澱和福馬林溶液充分混勻；9)再加入10mL乙酸乙酯至50mL離心管中，振蕩離心管，使管內物質充分混勻；10)將離心管離心；11)離心管內液體此時分為2層，棄去上層；12)吸取適量混和後的懸浮液塗於兩片載波片上，晾乾；13)晾乾後，滴加50μL無水乙醇固定塗片，室溫乾燥；14)乾燥後，一片用鐵蘇木素液染色，然後脫色，水洗，晾乾，最後用中性樹膠封片，並用油鏡觀察並計數；15)另一片先用染色液5-10min，接著水洗，然後滴加硫酸，1-10min，水洗，最後滴加溶液，1min後水洗，晾乾，中性樹膠封片，油鏡觀察並計數。
3.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟1)中，採集的水樣，24小時內運回，並且要求4℃避光保存。
4.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟2)中，過濾是指水樣先用500目篩網過濾水樣；抽濾是指用孔徑3μm的濾膜進行抽濾。
5.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟5)中，振蕩是指將瓶置于振蕩器上振蕩15min，並重複三次。
6.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟6)中，離心是指8000r/min離心15min。
7.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟7)中，吸去上清液時若下層沉澱被振蕩到，則再次離心。
8.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟10)中，離心是指置於離心機中3500r/min離心15min。
9.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟14)中，用鐵蘇木素液染色5-10min，然後加0.5％鹽酸酒精脫色。
10.根據權利要求2所述的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，其特徵是，步驟15)中，所述的染色液，是指酸性復紅4g，95％酒精20mL，石炭酸8mL，蒸餾水100ml；所述的硫酸，是指濃硫酸10mL，加入90mL蒸餾水攪拌；所述的溶液，是指孔雀綠0.2g，溶於100mL蒸餾水。
全文摘要
本發明涉及的是一種檢測技術領域的水中賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊的檢測方法，通過採用微孔濾膜過濾，經乙酸乙酯和福馬林為10∶1梯度分離，鐵蘇木和改良抗酸聯合染色法檢測水環境中隱孢子蟲和賈第氏蟲，通過膜濾前篩網水樣預處理減輕後續鏡檢背景複雜性，通過鐵蘇木和改良抗酸染色法分別實現對賈第蟲和隱孢子蟲的染色。本發明可減輕賈第蟲和隱孢子蟲傳統檢測方法中背景較多雜質的幹擾，提高形態結構特徵的鏡檢確認準確度。
文檔編號C12Q1/24GK1908621SQ20061003013
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月17日 優先權日2006年8月17日
發明者白曉慧, 萬紫微, 曾莉 申請人:上海交通大學