一株嗜熱兼氧菌utm601及其應用的製作方法
2023-09-18 20:29:40 3
專利名稱：一株嗜熱兼氧菌utm601及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及環境微生物技術領域，具體地，涉及一種嗜熱兼氧菌菌株UTM601及其在高溫堆肥中的應用。
背景技術：
堆肥化是在微生物作用下通過高溫發酵使有機物礦質化、腐殖化和無害化而變成腐熟肥料的過程。高溫堆肥作為一種微生物學過程，依賴於具一定數量及活力的微生物源。隨著堆肥的產業化、商品化，微生物接菌劑已經成為一項重要的技術而被應用。目前，高溫堆肥採用的發酵工藝一般為好氧發酵，微生物接種劑也主要是中溫好氧菌。好氧發酵必須維持一定的氧濃度。但堆肥是一個複雜系統，對於不同混料比例、堆體的不同部位，鼓風過程的影響範圍和程度都會隨之變化，即便是相同的通風量下，堆體中不同部位的氧含量分布也不一致，這就使得在實際操作中難以把握適當的通風量通風量過小，微生物無法獲得足夠的氧氣，活性降低，甚至會處於厭氧狀態，堆肥反應進程緩慢；通風量過大，堆體的溫度不容易積累，難以保證無害化效果，也影響堆肥的正常進程，且增加能耗，氮素大量損失，降低發酵產物的肥料效益。尤其是在50°C _70°C的堆肥高溫期環境中，常用微生物接種劑的活性還受到溫度的抑制。嗜熱兼氧菌具有嗜熱、兼性厭氧，較中溫菌，具有更高的有機物降解活性和更快的代謝速率的優點，可提高有機物質的降解速率，縮短工藝運行時間，在有機廢物資源化利用領域中具有潛在的應用價值。將嗜熱兼氧菌作為接種劑應用於堆肥，將有效解決以上問題，促進堆肥進程。但目前還未見到關於嗜熱兼氧菌作為接種劑應用於高溫堆肥的公開報告。
發明內容
本發明的目的在於提供一種嗜熱兼氧菌(Anoxybacillus pushchinoensis)及其應用。本發明菌株UTM601是從採自大地綠源環保科技(北京)有限公司堆肥發酵車間的高溫期汙泥堆肥樣品中，在40°C下，經微氧傳代馴化，分離純化、需氧性生長性能測試、降解性能比較試驗篩選後得到的Anoxybacillus sp.菌株，命名為UTM601。該菌株已於2012年3月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為Anoxybacillus pushchinoensis,保藏號 CGMCC No. 5929。本發明菌株UTM601具有如下特性UTM601在NA培養基(牛肉膏3_5g，蛋白腖6_10g，氯化鈉3_5g，瓊脂14_18g，植物凝膠7-9g，蒸餾水1000!111，？117.2)上菌落特徵是形態為不規則狀，表面溼潤，淺黃色，齧蝕狀，扁平，生長迅速，50-70°C培養下36小時菌落直徑約3mm。利用引物引物為27f 5/ -AGAGTTTGA TCC TGG CTC AG-3'和 1492r :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'經 PCR、擴增該菌株的16S rRNA基因序列,獲得序列提交到EzTaxon資料庫(http://www. eztaxon.org/)進行同源性比對，結果顯不與Anoxybacillus pushchinoensis K_1T相似性最高，為98. 80%，此序列是鑑定該菌株的主要特徵依據。其次是上述菌株在微氧條件下生長良好和具有快速降解澱粉的特性為鑑別該菌株的次要特徵。上述嗜熱兼氧菌UTM601的富集馴化方法是高溫期汙泥堆肥樣品IOg加入到90ml的無菌水中，在200rpm的搖床上搖30分鐘，然後取出靜置30分鐘，取IOml上清液接到90ml的NA培養液中，置於水浴搖床上，在60°C下，變速馴化培養以每6小時為一個時間單位，以50rpm為變速單位,逐步增加轉速,直到達到150rpm後，同理逐步減小轉速,此為一個馴化周期；當完成3個馴化周期後，取IOml馴化液轉接至新的NA培養液中，繼續馴化培養，如此傳代3次。
上述嗜熱兼氧菌UTM601的需氧性能測試篩選方法是按接種量5%向已滅菌的裝有50ml、100ml、150ml、200ml、250ml NA培養液的250ml三角瓶進行接種，在60°C下靜置培養3天，檢測培養液的0D_。上述嗜熱兼氧菌UTM601的降解特性的篩選方法是取在NA平板上活化培養的菌株，點接於降解培養基上，在60°C下培養至菌落豐厚，後滴加2%碘液觀察有無透明圈及透明圈的大小，並用遊標卡尺測定透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)。分解能力大小按公式Up=(D/d) 2來判斷，單位為毫米(mm)，Up越大，表示分解能力越大。在降解培養基上傳代培養4代，觀察每代菌的Up情況，淘汰降解能力不穩定菌株，得到降解能力大且穩定的菌株。降解培養基的配方是IOg蛋白腖，3g牛肉膏，5g NaCl，2g可溶性澱粉，16g瓊脂，1000ml蒸餾水，pH 7. 0~7. 2。本發明提供了含有嗜熱兼氧菌UTM601的菌劑。本發明提供了嗜熱兼氧菌UTM601或其發酵產物在汙泥堆肥中的應用。本發明提供了嗜熱兼氧菌UTM601或其發酵產物在製備堆肥接種劑中的應用。本發明提供的製備堆肥接種劑的方法，包括以下步驟I)菌種活化取嗜熱兼氧菌菌株UTM601的菌種接種於培養基，在50_60°C條件下培養l-3d，使種子液的OD6tltl為0. 5-1. 2 ；2)發酵種子液製備將活化的菌種接種於液體培養基中，製備種子液，再將種子液擴大培養，製得發酵種子液；3)將溼料和乾料混合均勻得混合物料，將混合物料平鋪厚度為10_25cm，取步驟
2)的發酵種子液與糖蜜的混合溶液潑灑在混合物物料上，再覆蓋混合物料10-25cm，按前述方法潑灑發酵種子液與糖蜜的混合溶液，如此重複，至混合物料層堆達50-150cm後，蓋上透氣性覆蓋物，待溫度升至55-70°C時，每隔3-6d攪拌I次，直至發酵溫度降至環境溫度，停止發酵，將發酵產物烘乾製得堆肥接種劑。所述的溼料為畜禽糞便。所述的乾料為花生殼粉、豆柏和/或鋸木屑。其中步驟2)所述的種子液的培養條件為50_60°C震蕩培養，轉速為50_200r/min，待種子液的0D_為1-2時，停止培養；所述的發酵種子液的培養方法為將種子液按體積比5%-20%接種於液體培養基擴大發酵培養，培養條件為溫度50-60°C，間隔4-8h通氣10-30min,通氣量體積比0. 3 0. 8:1，100-200rpm攪拌，培養2-6天發酵種子液的OD6tltl在2-3之間停止發酵，得發酵種子液。其中，步驟3)所述混合物料的碳氮比為20-30，含水率為35%_45%。其中，步驟3)所述發酵種子液與糖蜜的混合溶液潑灑在混合物料上的方法是取混合物料重量0. 5%-1%的糖蜜按質量比1:2與步驟2)製得的發酵種子液混合，再按質量比I 3與水混合，然後將混合溶液均勻潑灑在混合物料上。在本發明的實施例中，使用的培養基為NA培養基(牛肉膏3_5g，蛋白腖6_10g，氯化鈉3-5g，瓊脂14-18g，植物凝膠7-9g，蒸餾水1000ml，pH7. 2)。本發明還提供了上述含有UTM601菌株的堆肥接種劑在堆肥中的應用。具體地，將堆肥接種劑按重量比10%_20%與物料混合，添加輔料，使混合物料碳氮比為20-30，含水率50-60%，進行堆肥。本發明從腐熟的汙泥堆肥樣品中分離篩選到一種嗜熱兼氧菌株，該菌株UTM601在50-70°C的微氧與好氧環境中均生長良好，具有能較好的適應溫度高、氧含量分布不均一的堆肥高溫期環境，快速降解有機物質的特點。本發明利用該菌株以有機廢物為載體，製備固態微生物堆肥接種劑，成本低，應用於堆肥時不會對物料水分產生影響。利用本發明的固態微生物堆肥接種劑進行高溫堆肥，可在較低的多水平通風量下，實現物料的高溫發酵，避免了堆肥過程中複雜的通風管理控制問題，具有操作簡單、節能的特點。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I嗜熱兼氧菌UTM601的分離和鑑定稱取IOg高溫期汙泥堆肥樣品(採自大地綠源環保科技(北京)有限公司堆肥發酵車間)置於裝有10粒玻璃珠和90ml無菌水的250ml三角瓶中，在200rpm的搖床上搖30分鐘，然後取出靜置30分鐘，取IOml上清液接到90ml的NA培養液(牛肉膏4g，蛋白腖8g，氯化鈉4g，瓊脂16g，植物凝膠8g，蒸餾水1000ml，pH7. 2)中，置於水浴搖床上，在60°C下，變速馴化培養以每6小時為一個時間單位，以50rpm為變速單位，逐步增加轉速，直到達到150rpm後，同理逐步減小轉速，此為一個馴化周期；當完成3個馴化周期後，取IOml馴化液轉接至新的NA培養液中，繼續馴化培養，如此傳代3次。分別取馴化後的菌懸液lmL，加入到9mL無菌水中，以梯度稀釋法製成10' 1(T2，10_3，10_4，10_5，10' 10_7的稀釋度，取0. ImL平板塗布，每個稀釋度塗布於3個NA培養基平板上。取ImL的無菌水做上述同樣的操作，作為對照處理。在60°C下培養2天，選擇菌落分散較好的平板(在一定的稀釋度下的平板)，挑取生長旺盛的單菌落，在NA培養基上，反覆劃線分離純化3次，再將形態一致的菌落製片，進行簡單染色，在油鏡下觀察菌體形態，多視野下觀察菌體細胞形態，確認菌體形態一致後，接種至LB斜面培養至豐厚，得純化的嗜熱菌株，在4°C下保存，備用。取上述純化的嗜熱菌株，在NA液體培養基中活化培養至0D_為0. 8-1. 0，然後按體積比5%的接種量向已滅菌的裝有50ml、100ml、150ml、200ml、250ml NA培養液的250ml三角瓶進行接種，在60°C下靜置培養3天，檢測培養液的0D_。分解各菌在不同裝液量下的OD6tltl，選擇0D_較大且受裝液量影響小的菌株，作為目標嗜熱兼氧菌株。取上述嗜熱兼氧菌株經在NA平板上活化培養36小時後，點接於降解培養基(IOg蛋白腖，3g牛肉膏，5g NaCl，2g可溶性澱粉，16g瓊脂，IOOOml蒸餾水，pH7. 2)上，在60°C下培養至菌落豐厚，後滴加2%碘液觀察有無透明圈及透明圈的大小，並用遊標卡尺測定透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)。分解能力大小按公式Up= (D/d) 2來判斷，單位為毫米(mm)，Up越大，表示分解能力越大。在降解培養基上傳代培養4代，計算與分析每代菌的Up情況，淘汰降解能力不穩定菌株，得到降解能力大且穩定的菌株，從中選出取Up值最大的菌株作為目標嗜熱微氧降解株，並編號為UTM601。
UTM601在NA培養基(牛肉膏3_5g，蛋白腖6_10g，氯化鈉3_5g，瓊脂14_18g，植物凝膠7-9g，蒸餾水1000!111，？117.2)上菌落特徵是形態為不規則狀，表面溼潤，淺黃色，齧蝕狀，扁平，生長迅速，50-70°C培養下36小時菌落直徑約3mm。以UTM601 的 DNA 為模板，PCR 擴增其 16S rRNA 序列，引物為(27f) :5' -AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3'和(1492r):5' -GGTTAC CTT GTTACGACT T_3' ^CR反應程序為95°C預變性 5min, 95°C變性 30s, 53°C退火 45s，72°C延伸 90s, 30 個循環，72°C延伸 IOmin。擴增產物經電泳檢測其純度後測序，測序結果見序列表SEQ ID No. I所示。獲得的16SrRNA基因序列通過EzTaxon資料庫(http://www. eztaxon. org/)進行比對,結果顯示其與Anoxybacillus pushchinoensis K_1T 相似性最高，為 98. 80%,把該菌株命名為 UTM601,並於2012年3月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為Anoxybacillus pushchinoensis,保藏號為 CGMCC No. 5929。實施例2堆肥接種劑的製備(I)(I)製備活化液取本發明微生物UTM601的4°C保存斜面I支接種至5支裝有IOml的已滅菌的NA液體培養液試管，在55°C的恆溫水浴中培養I. 5天得斜面活化菌液。斜面活化菌液的OD600為0. 8。(2)製備種子液上述斜面活化菌液試管I支接種至IL無菌NA液體培養液中，在水浴搖床上震蕩培養，培養溫度55°C，振蕩頻率50rpm，培養3天後得種子液。種子液的0D_為 I. 2。(3)發酵種子液的製備上述種子液按5% (v/v)的接種量接種至已滅菌的發酵罐中，進行擴大發酵培養。擴大發酵培養的條件是溫度55°C，間隔4小時通氣15分鐘，通氣量體積比0. 5:l,200rpm攪拌，培養4天得發酵種子液。發酵種子液的OD6tltl為2. 5。(4)以雞糞便為溼料，花生殼粉為乾料，將溼料和乾料混合均勻得混合物料，使碳氮比為28，含水率為40%，將混合物料平鋪於水泥地面厚度為10cm，取混合物料重量0. 5%的糖蜜按質量比1:2與步驟2)製得的發酵種子液混合，再按質量比1:3與水混合，然後將混合溶液均勻潑灑在混合物料上。再覆蓋混合物料10cm，按前述方法潑灑發酵種子液與糖蜜的混合溶液，如此重複，至混合物料層堆達50cm後，蓋上草簾，待溫度升至55°C時，每隔6d攪拌I次，直至發酵溫度降至環境溫度，停止發酵，將發酵產物乾燥製得固態堆肥接種劑。實施例3堆肥接種劑的製備(2 )(I)製備活化液，培養條件是取本發明微生物UTM601的4°C保存斜面I支接種至5支裝有IOml的已滅菌的NA液體培養基試管，500C的恆溫水浴中培養2天，斜面活化菌液的 OD6tltl 為 I. 2。(2)製備種子液，培養溫度50°C，振蕩頻率160rpm，培養4天後得種子液，種子液的OD600 為 I. 5。(3)發酵種子液的製備中，上述種子液的接種量為15% (v/v)，擴大發酵培養的條件是溫度50°C，間隔5小時通氣20分鐘，通氣量體積比0. 3:1，160rpm攪拌，培養2天得發酵種子液。發酵種子液的0D_為2。(4)以豬糞便為溼料，豆柏為乾料，將溼料和乾料混合均勻得混合物料，使碳氮比為20，含水率為35%，將混合物料平鋪於水泥地面厚度為18cm，取混合物料重量1%的糖蜜按質量比1:2與步驟2)製得的發酵種子液混合，再按質量比1:3與水混合，然後將混合溶液均勻潑灑在混合物料上。再覆蓋混合物料18cm，按前述方法潑灑發酵種子液與糖蜜的混合溶液，如此重複，至混合物料層堆達90cm後，蓋上草蓆，待溫度升至62°C時，每隔5d攪拌I次，直至發酵溫度降至環境溫度，停止發酵，將發酵產物乾燥製得固態堆肥接種劑。實施例4堆肥接種劑的製備(3 )(I)製備活化液，培養條件是取本發明微生物UTM601的4°C保存斜面I支接種至5支裝有IOml的已滅菌的NA液體培養液試管，60°C的恆溫水浴中培養I天，斜面活化菌液的 OD6tltl 為 0. 5。(2)製備種子液，培養溫度60°C，振蕩頻率200rpm，培養2天後得種子液，種子液的OD600 為 I。(3)發酵種子液的製備中，上述種子液的接種量為20% (v/v),擴大發酵培養的條件是溫度60°C，間隔8小時通氣30分鐘，通氣量體積比0.8:1, IOOrpm攪拌，培養6天得發酵種子液。發酵種子液的0D_為3。(4)以牛糞便為溼料，鋸木屑粉為乾料，將溼料和乾料混合均勻得混合物料，使碳氮比為30，含水率為45%，將混合物料平鋪於水泥地面厚度為25cm，取混合物料重量0. 8%的糖蜜按質量比1:2與步驟2)製得的發酵種子液混合，再按質量比1:3與水混合，然後將混合溶液均勻潑灑在混合物料上。再覆蓋混合物料25cm，按前述方法潑灑發酵種子液與糖蜜的混合溶液，如此重複，至混合物料層堆達150cm後，蓋上透氣性覆蓋物，待溫度升至70°C時，每隔3d攪拌I次，直至發酵溫度降至環境溫度，停止發酵，將發酵產物乾燥製得固態堆肥接種劑。實施例5堆肥接種劑的應用取10噸實施例2製備的堆肥接種劑與60噸生汙泥、20噸花生殼粉充分混合後進行堆置發酵。同時以不添加本發明堆肥接種劑為對照，進行實驗。堆肥時間為30天，期間每天檢測堆體溫度，間隔5天翻堆一次，待堆溫達到65°C時翻堆；每5天於位於堆體表層15cm處，按5點採樣法的原則取樣並充分混勻後，檢測堆肥腐熟度指標，對堆肥結束時樣品還檢測其養分等理化指標。結果分析如下表I實施例2的堆肥接種劑對堆肥溫度的影響分析權利要求
1.嗜熱兼氧菌(Anoxybacilluspushchinoensis)菌株 UTM601,其保藏編號為 CGMCCNo.5929。
2.權利要求I所述的嗜熱兼氧菌UTM601或其發酵產物在堆肥中的應用。
3.權利要求I所述的嗜熱兼氧菌UTM601或其發酵產物在製備堆肥接種劑中的應用。
4.含有權利要求I所述嗜熱兼氧菌UTM601的堆肥接種菌劑。
5.一種製備權利要求4所述堆肥接種劑的方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)菌種活化取權利要求I所述嗜熱兼氧菌菌株UTM601的菌種接種於培養基，在50-60°C條件下培養l-3d，使種子液的OD6tltl為0. 5-1. 2 ； 2)發酵種子液製備將活化的菌種接種於液體培養基中，製備種子液，再將種子液擴大培養，製得發酵種子液； 3)將溼料和乾料混合均勻得混合物料，將混合物料平鋪厚度為10-25cm，取步驟2)的發酵種子液與糖蜜的混合溶液潑灑在混合物物料上，再覆蓋混合物料10-25cm，按前述方法潑灑發酵種子液與糖蜜的混合溶液，如此重複，至混合物料層堆達50-150cm後，蓋上透氣性覆蓋物，待溫度升至55-70°C時，每隔3-6d攪拌I次，直至發酵溫度降至環境溫度，停止發酵，將發酵產物烘乾製得堆肥接種劑。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述的種子液的培養條件為50-60°C震蕩培養，轉速為50-200r/min，待種子液的0D_為1_2時，停止培養；所述的發酵種子液的培養方法為將種子液按體積比5%-20%接種於液體培養基擴大發酵培養,培養條件為溫度50-600C，間隔4-8h通氣10-30min，通氣量體積比0. 3^0. 8:1,100_200rpm攪拌，培養2_6天發酵種子液的OD6tltl在2-3之間停止發酵，得發酵種子液。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述混合物料的碳氮比為20-30，含水率為35%-45%。
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述發酵種子液與糖蜜的混合溶液潑灑在混合物料上的方法是取混合物料重量0. 5%-1%的糖蜜按質量比1:2與步驟2)製得的發酵種子液混合，再按質量比1:3與水混合，然後將混合溶液均勻潑灑在混合物料上。
9.權利要求4所述的堆肥接種劑在堆肥中的應用。
10.權利要求9所述的應用，其特徵在於，將堆肥接種劑按重量比10%-20%與物料混合，添加輔料，使混合物料碳氮比為20-30，含水率50-60%，進行堆肥。
全文摘要
本發明提供了一株嗜熱兼氧菌(Anoxybacillus pushchinoensis)UTM601，其保藏編號為CGMCC No.5929，該菌株UTM601在50-70℃的微氧與好氧環境中均生長良好，具有能較好的適應溫度高、氧含量分布不均一的堆肥高溫期環境、快速降解有機物質的特點。本發明還提供了利用該菌株製備堆肥接種劑的方法。本發明菌株以有機廢物為載體，製備固態微生物堆肥接種劑，成本低，應用於堆肥時不會對物料水分產生影響。利用本發明固態微生物堆肥接種劑進行高溫堆肥，可在較低的多水平通風量下，實現物料的高溫發酵，避免了堆肥過程中複雜的通風管理控制問題，具有操作簡單、節能的特點。
文檔編號C05F17/00GK102732465SQ20121022696
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年5月14日
發明者劉永躍, 周順桂, 汪湧, 許宜北 申請人:大地綠源環保科技(北京)有限公司