槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用的製作方法
2023-09-11 05:30:00
專利名稱：槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用，尤其涉及槐糖脂在製備抑制白色念珠菌或革蘭氏陽性菌的抗生素藥物中的應用。
背景技術：
近幾十年來，濫用抗生素已經成為一個世界性的重大問題。濫用抗生素的危害除了造成藥物不良反應和增加治療費用之外，最主要的是讓細菌的耐藥性增強，我國已經進入了細菌耐藥性的直線上升時期。目前的研究顯示，我國的金黃色葡萄球菌耐青黴素比例已經高達90％，肺炎的病菌在社區的標本中耐藥比例約20％，而在醫院內的標本中這一比例可達到60％。肺炎鏈球菌已有45％耐青黴素，70％耐紅黴素。導致腸道疾病的大腸桿菌有70％耐環丙沙星。抗生素過度的使用使得很多抗生素失去了效果。
一種新的抗生素研製的費用大約需要十幾億美金和10到15年的過程，而使用不當，3到5年病菌就會對這種藥物產生耐藥性，如果再不遏止這種趨勢，那麼很快我們將沒有對抗細菌等有害微生物的有效武器，很多小病也能致命。因此，對新的抗生素研究，開發，保護是一迫切任務，具有重要意義。
槐糖脂是一種重要的生物表面活性劑，對於它的研究始於二十世紀五、六十年代，其主要是通過微生物發酵獲得。與化學合成的表面活性劑相比，槐糖脂具有表面性能優良、環境友好等許多優點。
近年來，國外對於槐糖脂作為臨床藥物的研究已有了許多文獻報導，關於槐糖脂抑菌作用的研究也有提及，但是，根據文獻和專利檢索，槐糖脂作為抑制白色念珠菌和革蘭氏陽性菌類抗生素藥物研究與開發未見報導。
發明內容
針對目前臨床上濫用抗生素造成的微生物抗藥性日益增強的嚴重問題，以及對新抗生素研究、開發的迫切需求，本發明要解決的問題是提供一種生物表面活性劑槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用，尤其是槐糖脂在製備抑制白色念珠菌或革蘭氏陽性菌的抗生素藥物中的應用。
本發明所述槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用。
上述的槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用中，所述槐糖脂優選在製備抑制白色念珠菌類抗生素藥物中的應用。
其中，所述抗生素藥物有效抑菌的終濃度是20～60mg/L，優選20～50mg/L，最優選20～40mg/L。
或者，上述的槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用中，所述槐糖脂優選在製備抑制革蘭氏陽性菌類抗生素藥物中的應用。
其中，所述抗生素藥物有效抑菌的終濃度是20～100mg/L，優選20～80mg/L，最優選20～50mg/L。
本發明還包括以槐糖脂為有效成分的組合物在製備抗生素藥物中的應用。
利用本發明所述槐糖脂加入藥學上可接受的輔料或賦形劑可以製成任何一種藥劑學上所說的劑型。
以本發明所述槐糖脂為有效成分加入抑菌組分和藥學上可接受的輔料或賦形劑組成抑菌的藥物組合物，同樣也可以製成任何一種藥劑學上所說的劑型。
在上述槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用中，所述槐糖脂在製備抑制白色念珠菌類抗生素藥物劑型是口服製劑、栓劑、軟膏劑、液體製劑之一。
其中，所述口服製劑優選膠囊、片劑、散劑、口服液、顆粒劑、水丸、滴丸之一；最優選為膠囊劑或片劑；液體製劑優選液體洗劑。
在上述槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用中，所述槐糖脂在製備抑制革蘭氏陽性菌類抗生素藥物劑型優選是口服製劑。
其中，所述口服製劑優選膠囊、片劑、散劑、口服液、顆粒劑、水丸、滴丸之一；最優選為膠囊劑或片劑。
上述栓劑、軟膏劑、口服給藥的藥物製劑可以按照本行業已知的方法製備，在製備過程中使用可藥用稀釋劑，例如黏合劑(如預膠化澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基纖維素)、填料(例如乳糖、蔗糖、甘露醇等)、潤滑劑(例如硬脂酸、聚乙二醇、硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化矽)、崩解劑(例如澱粉、羧甲基纖維素鈉)或者潤溼劑(例如十二烷基硫酸鈉)、片劑可以按照本行業已知的方法包衣。
為了更好地理解本發明的實質，下面以槐糖脂的藥理實驗及結果來說明槐糖脂作為抑制白色念珠菌或革蘭氏陽性菌類抗生素藥物的應用。
槐糖脂的製備(1)菌種選擇擬威克酵母變種Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipidCGMCC No.1576；(2)斜面培養將菌種接種於基本無機鹽培養基，其中添加質量體積比為1.5～2.0％的瓊脂，25～35℃條件下，靜止培養24～48小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環於20～100mL含有質量體積比為4～14％的葡萄糖和1～8％的菜籽油的基本無機鹽培養基中，25～35℃條件下，振蕩培養24～48小時，製得種子液；(4)擴大培養以5～10％的體積比的接種量，將種子液接種於100～1000mL含有質量體積比為4～14％的葡萄糖和1～8％的菜籽油的基本無機鹽培養基中，25～35℃條件下，振蕩培養96～288小時；(5)收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液靜置，使其自然沉降，收集沉積在搖瓶底部的淺黃色粘稠液體，之後以4000～7000轉/分鐘將所述粘稠物質離心，收集沉澱部分；即為槐糖脂粗提物；(6)分離產物將上述經離心得到的沉澱物中加入其體積量為3～10倍的乙酸乙酯，在25～37℃下，萃取2～8小時；
(7)過濾將上述乙酸乙酯萃取液在25～37℃下，用Whatman No.2濾紙過濾，收集濾渣；(8)洗滌上述步驟(3)得到的濾渣用其體積量為3～10倍的乙酸乙酯在25～37℃下，洗滌2～4次；(9)減壓蒸餾洗滌完畢後收集濾渣，在溫度50～70℃，壓力0.2～0.8Kg/cm2，真空度為0.02～0.08Mpa的條件下進行減壓蒸餾，將濾液中的乙酸乙酯蒸發去除；(10)收集物乾燥將上述收集的減壓蒸餾殘渣，在50～100℃，真空度0.02～0.08Mpa條件下，真空乾燥12～24小時，製得固體槐糖脂。
白色念珠菌的菌體製備將斜面保存的白色念珠菌取一接種環轉接到液體YEPD培養基中，在25～37℃下培養10～20小時，製成菌懸液。
革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌)的菌體製備將斜面保存的革蘭氏陽性菌取一接種環轉接到液體LB培養基中，在25～37℃下培養10～20小時，製成菌懸液。
白色念珠菌抑菌試驗槐糖脂以二甲亞碸溶解製成母液，備用。
取槐糖脂母液加到YEPD液體培養基中，使其終濃度為20～60mg/L，取上述白色念珠菌菌懸液0.8mL接種到80mL YEPD液體培養基中，在25～37℃下培養6～24小時，于波長560～620下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。
革蘭氏陽性菌抑菌試驗槐糖脂以二甲亞碸溶解製成母液，備用。
取槐糖脂母液加到LB液體培養基中，使其終濃度為20～100mg/L，取上述革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌)菌懸液0.8mL接種到80mL液體LB培養基中，在25～37℃下培養6～24小時，于波長560～620nm下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。
其中，所述的白色念珠菌抑菌試驗中，槐糖脂的終濃度優選是20～50mg/L，培養溫度優選是28～32℃，培養時間優選是6～15小時，OD值測定波長為580～600nm。
其中，所述的革蘭氏陽性菌抑菌試驗中，槐糖脂的終濃度優選是20～80mg/L，培養溫度優選是28～32℃，培養時間優選是8～18小時，OD值測定波長為580～600nm。
上述培養基配方是YEPD培養基(g/L)(用於白色念珠菌培養)酵母膏10，蛋白腖20，葡萄糖20，pH6.5。
LB培養基(g/L)(用於革蘭氏陽性菌培養)蛋白腖10，酵母抽提物5，NaCl10，pH7.4。
結果顯示極低劑量的槐糖脂在較短的作用時間(＜24小時)對白色念珠菌的生長可以達到完全抑制(見圖1)，同時與目前在臨床抑制白色念珠菌的效果最好的苦參鹼相比，槐糖脂的用量(20mg/L)只是後者用量(20g/L)的1/1000，並且槐糖脂成本也僅是苦參鹼的十幾分之一。
對革蘭氏陽性菌的研究表明，在槐糖脂濃度50mg/L下，槐糖脂可以完全抑制金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌的生長。(見圖2，圖3)本發明利用擬威克酵母變種發酵產生槐糖脂，具有工藝方法簡便、成本低、純度高的特點。
本發明所述槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用中，價格低廉，用量少，抑菌效果顯著，對人體無任何毒副作用。將其開發為臨床外用洗液、軟膏劑、栓劑或口服製劑等藥物劑型，可以實現有效抑制在臨床上極其常見的條件性致病菌白色念珠菌和一些革蘭氏陽性菌的生長，甚至在某些方面可全面作為抗生素替代藥物，極具誘人的應用前景。
圖1槐糖脂對白色念珠菌的抑制曲線顯示槐糖脂濃度在20mg/L下，能夠完全抑制白色念珠菌的生長。
圖2槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑制曲線顯示槐糖脂濃度在50mg/L下，能夠完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。
圖3槐糖脂對蠟狀芽孢桿菌的抑制曲線顯示槐糖脂濃度在20mg/L下，能夠完全抑制蠟狀芽孢桿菌的生長。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明內容作進一步的說明。
實施例1槐糖脂的製備(1)菌種選擇擬威克酵母變種(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid)CGMCC No.1576(2)斜面培養將菌種接種於基本無機鹽培養基，其中添加質量體積比為1.6％的瓊脂，25℃條件下，靜止培養24小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環於20mL含有質量體積比為4％的葡萄糖和1％的菜籽油的培養基中，25℃條件下，振蕩培養24小時，製得種子液；(4)擴大培養以5％的體積比的接種量，將種子液接種於100mL含有質量體積比為1％的菜籽油的培養基中，25℃條件下，振蕩培養96小時；(5)收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液靜置，使其自然沉降，收集沉積在搖瓶底部的淺黃色粘稠液體，之後以5000轉/分鐘將上述粘稠物質離心，收集固態部分，即為槐糖脂粗提物。
(6)乙酸乙酯萃取將上述經離心得到的沉澱物中加入其體積量為5倍的乙酸乙酯，在30℃下，萃取4小時。
(7)過濾將上述乙酸乙酯萃取液在30℃下，用Whatman No.2濾紙過濾，收集濾渣。
(8)洗滌上述得到的濾渣用其體積量為5倍的乙酸乙酯在30℃下，洗滌3次。
(9)減壓蒸餾洗滌完畢後收集濾渣，在溫度70℃，壓力0.4kg/cm2，真空度為0.04Mpa的條件下進行減壓蒸餾，將濾液中的乙酸乙酯蒸發去除；(10)收集物乾燥將上述收集的減壓蒸餾殘渣，在70℃，真空度0.04Mpa條件下，真空乾燥16小時；製得固體槐糖脂。
實施例2槐糖脂的製備(1)菌種選擇擬威克酵母變種(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid)CGMCC No.1576(2)斜面培養將菌種接種於基本無機鹽培養基，其中添加質量體積比為1.6％的瓊脂，30℃條件下，靜止培養36小時；(3)種子培養將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環於50mL含有質量體積比為8％的葡萄糖和3％的菜籽油的培養基中，30℃條件下，振蕩培養36小時，製得種子液；(4)擴大培養以7％的體積比的接種量，將種子液接種於500mL含有質量體積比為3％的菜籽油的培養基中，30℃條件下，振蕩培養200小時；(5)收集發酵產物將步驟(4)所得的發酵液靜置，使其自然沉降，收集沉積在搖瓶底部的淺黃色粘稠液體，之後以6000轉/分鐘將上述粘稠物質離心，收集固態部分，為槐糖脂粗提物。
(6)分離產物將上述經離心得到的沉澱物中加入其體積量為7倍的乙酸乙酯，在37℃下，萃取6小時。
(7)過濾將上述乙酸乙酯萃取液在37℃下，用Whatman No.2濾紙過濾，收集濾渣。
(8)洗滌上述得到的濾渣用其體積量為7倍的乙酸乙酯在37℃下，洗滌3次。
(9)減壓蒸餾洗滌完畢後收集濾渣，在溫度70℃，壓力0.8kg/cm2，真空度為0.08Mpa的條件下進行減壓蒸餾，將濾液中的乙酸乙酯蒸發去除；(10)收集物乾燥將上述收集的減壓蒸餾殘渣，在100℃，真空度0.08Mpa條件下，真空乾燥24小時；製得固體槐糖脂。
實施例3槐糖脂作為抑制白色念珠菌的抗生素藥物的應用白色念珠菌的菌體製備將斜面保存的白色念珠菌取一接種環轉接到液體YEPD培養基中，在25℃下培養20小時，製成菌懸液。
槐糖脂以二甲亞碸溶解製成濃度為5g/L母液，備用。
取槐糖脂母液加到YEPD液體培養基中，使其終濃度為20mg/L，取上述白色念珠菌菌懸液0.8mL接種到80mL YEPD液體培養基中，在25℃下培養24小時，于波長580下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。檢測白色念珠菌試驗抑菌情況。
實施例4槐糖脂作為抑制白色念珠菌的抗生素藥物的應用白色念珠菌的菌體製備將斜面保存的白色念珠菌取一接種環轉接到液體YEPD培養基中，在30℃下培養15小時，製成菌懸液。
槐糖脂以二甲亞碸溶解製成濃度為5g/L母液，備用。
取槐糖脂母液加到YEPD液體培養基中，使其終濃度為30mg/L，取上述白色念珠菌菌懸液0.8mL接種到80mL YEPD液體培養基中，在30℃下培養10小時，于波長590下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。檢測白色念珠菌試驗抑菌情況。
實施例5槐糖脂作為抑制白色念珠菌的抗生素藥物的應用白色念珠菌的菌體製備將斜面保存的白色念珠菌取一接種環轉接到液體YEPD培養基中，在37℃下培養10小時，製成菌懸液。
槐糖脂以二甲亞碸溶解製成濃度為5g/L母液，備用。
取槐糖脂母液加到YEPD液體培養基中，使其終濃度為50mg/L，取上述白色念珠菌菌懸液0.8mL接種到80mL YEPD液體培養基中，在32℃下培養15小時，于波長600下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。檢測白色念珠菌試驗抑菌情況。
上述YEPD培養基配方是酵母膏10g/L，蛋白腖20g/L，葡萄糖20g/L，pH6.5。
實施例6槐糖脂作為抑制革蘭氏陽性菌的抗生素藥物的應用金黃色葡萄球菌菌體製備將斜面保存的革蘭氏陽性菌取一接種環轉接到液體LB培養基中，在25℃下培養20小時，製成菌懸液。
革蘭氏陽性菌抑菌試驗槐糖脂以二甲亞碸溶解製成母液，備用。
取槐糖脂母液加到LB液體培養基中，使其終濃度為20mg/L，取上述革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)菌懸液0.8mL接種到80mL液體LB培養基中，在28℃下培養20小時，于波長580nm下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。檢測槐糖脂抑菌情況。
實施例7槐糖脂作為抑制革蘭氏陽性菌的抗生素藥物的應用蠟狀芽孢桿菌菌體製備將斜面保存的革蘭氏陽性菌取一接種環轉接到液體LB培養基中，在29℃下培養15小時，製成菌懸液。
革蘭氏陽性菌抑菌試驗槐糖脂以二甲亞碸溶解製成母液，備用。
取槐糖脂母液加到LB液體培養基中，使其終濃度為50mg/L，取上述革蘭氏陽性菌(蠟狀芽孢桿菌)菌懸液0.8mL接種到80mL液體LB培養基中，在30℃下培養12小時，于波長590nm下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。檢測槐糖脂抑菌情況。
實施例8槐糖脂作為抑制革蘭氏陽性菌的抗生素藥物的應用金黃色葡萄球菌菌體製備將斜面保存的革蘭氏陽性菌取一接種環轉接到液體LB培養基中，在29℃下培養15小時，製成菌懸液。
革蘭氏陽性菌抑菌試驗槐糖脂以二甲亞碸溶解製成母液，備用。
取槐糖脂母液加到LB液體培養基中，使其終濃度為80mg/L，取上述革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)菌懸液0.8mL接種到80mL液體LB培養基中，在32℃下培養18小時，于波長600nm下測定培養液的OD值，以OD值表示培養液中的菌數作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪製抑菌曲線。檢測槐糖脂抑菌情況。
上述LB培養基配方是蛋白腖10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.4。
實施例9槐糖脂作為治療白色念珠菌感染的抗生素藥物栓劑的製備取實施例1製取的槐糖脂40g，以每粒栓劑含槐糖脂50mg的混合量，直接溶解於已加熱熔化的棕櫚油酸甘油酯中，混勻，然後加入預先用肥皂、甘油各1份與90％乙醇5份製成的潤滑劑潤滑後的栓劑模孔中成形，即得槐糖脂栓劑。每粒栓劑含槐糖脂50mg。
實施例10槐糖脂作為治療白色念珠菌感染的抗生素藥物軟膏劑的製備取實施例1製取的槐糖脂40g加入液狀石蠟125g加熱至80℃，另取甘油50g，羥苯乙酯1g，加蒸餾水至835g，也加熱至80℃，然後將油相加入水相中，邊加邊攪拌至冷，裝入塑料軟管，每管裝入量為25g，即得槐糖脂軟膏劑。
實施例11槐糖脂作為治療白色念珠菌感染的抗生素藥物液體洗劑製備取實施例1製取的槐糖脂40g，加入二甲亞碸至1000g，使槐糖脂溶解，裝入100mL塑料瓶中，即得。
實施例12槐糖脂作為治療革蘭氏陽性菌感染的抗生素藥物口服膠囊劑的製備以重量份(公斤)計，稱取槐糖脂7份、賦形劑(澱粉)13份。將槐糖脂與賦形劑按所述重量份混合，乾燥，製備成粉狀，過篩得細粉，裝入明膠硬膠囊，每粒膠囊裝入量是0.143g。其中每粒膠囊含槐糖脂0.05g、賦形劑(澱粉)0.093g。
上述膠囊劑服用方法每次2～3粒，每日三次。
實施例13以槐糖脂為有效成分的組合物作為抗生素藥物栓劑的製備取實施例1製取的槐糖脂40g和苦參鹼100g，以每粒栓劑含槐糖脂50mg，含苦參鹼125mg的混合量，直接溶解於己加熱熔化的棕櫚油酸甘油酯中，混勻。隨後加入預先用肥皂、甘油各1份與90％乙醇5份製成的潤滑劑潤滑後的栓劑模孔中成形，即得栓劑。每粒栓劑含槐糖脂50mg，含苦參鹼125mg。
實施例14槐糖脂所作的動物實驗取實施例11中製取的作為治療白色念珠菌感染的槐糖脂抗生素藥物液體洗劑用於動物實驗。
取小鼠60隻，在每隻鼠右前肢腋下切開小的創口，接種白色念珠。24h後從傷口處取樣進行顯微觀察，發現有45隻小鼠已感染有白色念珠菌。將小鼠分為9組，5組作為處理組，用上述槐糖脂液體製劑每日分三次進行塗擦，另外4組作為陰性對照組，用生理鹽水進行相同次數的塗擦。連續給藥10天。觀察處理組和對照組傷口癒合情況，並分別從處理組和對照組傷口處取樣，用培養酵母的YEPD平板進行培養。
從實驗結果看，處理組在24h內無菌落出現，在24h到48h之間，5組處理組的平板均只有零星菌落出現，平均菌落數為3。對照組在24h內有大量菌落出現，無法計數。
權利要求
1.槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用，其特徵在於，所述槐糖脂在製備抑制白色念珠菌類抗生素藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述抗生素藥物濃度為20～60mg/L。
4.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述抗生素藥物劑型是口服製劑、栓劑、軟膏劑、液體製劑之一。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述口服製劑為膠囊劑或片劑。
6.如權利要求1所述的槐糖脂在製備抗生素藥物中的應用，其特徵在於，所述槐糖脂在製備抑制革蘭氏陽性菌類抗生素藥物中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述抗生素藥物濃度為20～100mg/L。
8.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述抗生素藥物劑型是口服製劑。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述口服製劑為膠囊劑或片劑。
10.以槐糖脂為有效成分的組合物在製備抗生素藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種槐糖脂或以槐糖脂為有效成分的組合物在製備抗生素藥物中的應用，特別涉及其在製備抑制白色念珠菌或革蘭氏陽性菌類抗生素藥物中的應用。本發明利用擬威克酵母變種發酵製備槐糖脂，具有工藝方法簡便、成本低、純度高的特點，並且涉及的槐糖脂或以槐糖脂為有效成分的組合物抑菌效果顯著，對人體無任何毒副作用。將其開發為臨床外用洗液、軟膏劑、栓劑或口服製劑等藥物劑型，可以實現有效抑制在臨床上極其常見的條件性致病菌白色念珠菌和一些革蘭氏陽性菌的生長，甚至在某些方面可全面作為抗生素替代藥物，極具誘人的應用前景。
文檔編號A61K9/08GK101019875SQ200710013200
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月29日 優先權日2007年1月29日
發明者宋欣, 曲音波, 邵凌健 申請人:山東大學