一種人白細胞抗原hla-b27基因螢光定量pcr快速檢測方法及其試劑盒的製作方法

2023-09-16 09:28:55

專利名稱：一種人白細胞抗原hla-b27基因螢光定量pcr快速檢測方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測人白細胞抗原HLA-B27 (Human Leukocyte Antigen B27)基 因的方法，尤其涉及使用螢光定量PCR技術，通過提取人外周血基因組DNA對HLA-B27進行 檢測的方法。本發明進一步涉及用於人白細胞抗原HLA-B27基因檢測的試劑盒。本發明屬 於生物醫藥領域。
背景技術：
人類白細胞抗原(HLA)是人類主要組織相容性複合體(Major Histocompatibity Complex,MHC)的表達產物。HLA基因位於第6對染色體的短臂上，約4000kb。根據功能和 產物的不同，HLA基因分為三類經典的HLA基因、免疫功能相關基因和免疫無關基因等。 HLA基因包括A、B、C、D、DR、DQ、DP等座位，這幾類基因座位內又有不同的位點，是迄今為止 發現多態性最高的基因系統之一，截止目前檢出的HLA基因已經超過1000種。HLA呈現多 態性，即多數的HLA座位有大量的等位基因存在。經典的HLA基因分為I類和II類基因包 含A、B、C等座位，HLA-I類基因位於HLA複合體遠著絲粒端，其表達的產物稱為HLA-I類 分子(或抗原)，由各等位基因編碼的重鏈和15號染色體非HLA基因編碼的輕鏈β 2-Μ共 同構成；HLA-II類基因坐落在複合體近著絲粒短，其表達的產物稱為HLA-II類分子(或抗 原)，是由分子量相近的α鏈和β鏈組合而成的二聚體。HLA-II類基因在其座位和數量 組成方面比I類基因更為複雜。HLA分子主要與同種異體移植中的排斥反應有密切的關係。HLA-I類分子在大多 數有核細胞表面均有表達，體液中也存在大量的HLA-I類分子。它在免疫識別過程中起到 了識別異源性抗原的作用，並經抗原呈遞給T淋巴細胞。HLA-I類分子在病毒和腫瘤細胞 的殺傷過程中起到重要作用。HLA-II類分子主要與來源於傳統的內吞降解途徑產生的多 肽相結合。體外實驗證實，供受體HLA-II類分子不同時，供體的II類抗原能夠直接刺激受 體⑶4陽性的T細胞增殖和淋巴因子分泌。因此在器官移植的匹配中II類抗原比I類抗 原更為重要。HLA分子在免疫應答過程中還起到限制性作用，表現為I類分子結合的是內源 性通道的小片段分子，並將抗原呈遞給CD8陽性的細胞毒性T細胞。而二類分子結合的是 外源性片段，並將抗原呈遞給CD4陽性的輔助性T細胞。此外HLA分子還在個體的自我識 別、生殖、疾病等方面起到一定作用。HLA基因及其分子與疾病的相關性研究始於20世紀60年代。1966年Lilly等在 小鼠體內發現了一個抗Gross白血病病毒基因，定位在小鼠H-2基因的k端。此研究開啟了 人們對HLA與疾病相關性研究的探索先河。後來Amiel研究發現，HLA在某些家族中與霍奇 金病有一定的相關性。這是世界上第一次發現HLA與腫瘤的相關性。1973年Terasaki等 首次報導了在強直性脊柱炎患者人群中HLA-B27基因的出現率遠高於對照組，在強直性脊 柱炎患者中，88-96%的病人HLA-B27基因為陽性，在正常對照人群中，HLA-B27陽性率僅有 4-8%。分子統計學方法證實，HLA-B27陽性的人群罹患強直性脊柱炎的風險性是HLA-B27
3陰性人群的162倍。這一研究發現引起了國際醫學界的高度關注，並引發了世界範圍內HLA 抗原與疾病相關性的研究。在國內曾有學者報導了 21例強直性脊柱炎患者，其中20例呈 HLA-B27陽性。陽性率達95. 24%。孔繁華等曾對514例AS患者進行研究，HLA-B27陽性的 為453例，陽性率為88. 13%。上述各種研究充分說明了 HLA-B27與AS的高度相關性。另 據報導，世界上不同種族不同地區的人群HLA-B27與強直性脊柱炎均有較高的相關性。國內有學者對人白細胞抗原HLA-B27有更深入的研究，對強直性脊柱炎患者的 HLA-I類基因進行限制性片段多態性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)，EcoRI8. lkb、EcoRI5. 2kb 和XbaI21. 9kb 出現的頻率遠高於健康人群。而EcoRI8. Ikb 可能含有強直性脊柱炎易感基因或者與易感基因有連鎖的不平衡關係。粟佔國等對67例 病人進行研究，結果發現，HLA-B27陽性患者發生強直性脊柱炎的年齡比HLA-B27陰性者早 5年。國外Sachs等研究發現，強直性脊柱炎患者不僅HLA-B27陽性率高於對照組，而且Cwl 和Cw2的比例也明顯升高。採用等點聚焦電泳的方法對強直性脊柱炎患者人白細胞抗原HLA-B27進一步 可以分為 9 種亞型HLA-B*2701、HLA_B*2702、HLA_B*2703、HLA_B*2704、HLA_B*2705、 HLA-B*2706、HLA_B*2707、HLA_B*2708、HLA_B*2709 等，而漢族人中 HLA_B*2704、 HLA-B*2705這兩種等位基因的發生頻率較高，是漢族人群中強直性脊柱炎的高度關聯基 因。這些等位基因序列具有較高的同源性，他們的表達產物各代表一種亞型，彼此僅相差幾 個胺基酸序列。關於HLA-B27與強直性脊柱炎發生的關聯機制，有以下幾種學說1.免疫 應答基因假說，該學說認為HLA-B27基因就是強直性脊柱炎的易感基因，病人的各種症狀 和實驗室檢查提示免疫功能有異常。2.基因連鎖假說，該學說認為HLA-B27是一種疾病相 關基因的遺傳標誌，參與強直性脊柱炎的發生。3.模擬分子假說，認為對於強直性脊柱炎患 者，HLA分子與病原體的抗原性存在交叉，而宿主對相應的病原體有免疫耐受性，從而導致 該病原體的免疫逃避而致病。4.關節致病肽假說，該假說認為關節致病肽是一種存在於關 節中的多肽，該抗原由HLA-B27呈遞，當機體免疫功能紊亂時，HLA-B27對這種多肽的呈遞 性增強，從而引發自身組織損傷。鑑於人白細胞抗原HLA-B27與強直性脊柱炎的高度相關性，加之該病症狀隱匿， 而且與其它關節疾病症狀相似容易漏診和誤診，所以實驗室輔助檢查尤為重要。目前針對 HLA-B27檢測的方法有一是HLA-B27基因檢測，主要是PCR擴增的方法；另一種是檢測B27 抗原，主要是流式細胞法，或者ELISA法；第三種是微量淋巴細胞毒的方法，用於檢測細胞 表面的B27抗原。前一種方法是採用序列特異性引物對HLA-B27進行PCR擴增，檢測到特 異性片段。後兩種主要是檢測HLA-B27分子，流式細胞法主要使用一種螢光標記的特異性 抗體對細胞表面的HLA-B27分子進行檢測，該法具有較好的特異性，但是需要特殊儀器，而 且操作繁瑣，檢測成本較高。而微量淋巴細胞毒的方法其原理是用針對HLA-B27的抗體和 補體孵育待檢測的淋巴細胞，並用相應的螢光染料對陽性細胞進行標記，在螢光顯微鏡下 觀察進行檢測。該法操作流程複雜，容易出現假陽性和假陰性，不宜在臨床上推廣。螢光定量PCR技術其原理是在常規PCR擴增系統中加入一段與靶基因特異互補的 螢光標記探針。探針的5'端標記有報告基團，如FAM、VIC等，3'端標記有螢光淬滅基團， 如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的螢光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不 到螢光信號。隨著PCR擴增的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針就會將探
4針切斷產生螢光信號。在PCR過程中，連續不斷地檢測反應體系中螢光信號的變化。當信號 增強到某一閾值，此時的循環次數(用循環閾值Ct表示)就被記錄下來。CT值和PCR體系 中起始模板的對數之間有著嚴格的線性關係，利用陽性定量標準品擴增的Ct和標準曲線， 再根據待測樣品的Ct值就可以準確定出起始模板核酸的數量。本發明的「一種人白細胞抗 原HLA-B27基因螢光定量PCR快速檢測方法及其試劑盒」就是依據該技術原理實現的，起到 了對HLA-B27基因快速準確檢測的目的。由於該方法引入了特異性擴增引物和螢光探針， 使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性不高和 容易漏診、誤診的問題。

發明內容
本發明提供了檢測人白細胞抗原HLA-B27基因方法，特別是提供了一種使用螢光 定量RT-PCR技術快速準確的檢測出全血或者組織標本中HLA-B27基因的方法。本發明進 一步提供了用於該基因檢測的試劑盒。本發明具體步驟包括⑴樣品的採集和DNA的提取；⑵螢光定量PCR體外擴增 法對樣本進行檢測；(3)擴增反應結束後根據每個擴增反應的螢光強度對相應樣本進行分 析，從而判斷HLA-B27基因的存在。檢索Genbank上的人白細胞抗原HLA-B27基因序列，用生物新信息學的方法，進 行比對分析，並採用人生長激素基因(HGH)作為內參照基因，設計序列特異性引物(SSP， Sequence Specific Primer)和螢光探針如下人白細胞抗原HLA-B27 上遊引物5，-CTTCATCACCGTGGGCTACG-3，(SEQID NO. 1)下遊引物5，-TATCCACGGCGCCCGCGGCT-3，(SEQID NO. 2)螢光探針FAM-5，GACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCG3，-TAMRA(SEQ ID NO. 3)人生長激素基因HGH 上遊引物5，-AGGATCCCAAGGCCCAACT-3，(SEQID NO. 4)下遊引物5，-GGAGCCTGTAGCCATTGCA-3，(SEQID NO. 5)螢光探針FAM-5，ACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTC3，-TAMRA(SEQ ID NO. 6)根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的人白細胞抗原HLA-B27包括了與強 直性脊柱炎相關的HLA-B27基因的所有亞型，其檢測也是針對HLA-B27各亞型。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的HLA-B27基因螢光定量PCR快速檢 測方法，引入了人生長激素基因HGH作為實驗中的內參照基因。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的螢光標記是指檢測HLA-B27和檢測 內參照基因HGH的探針的螢光標記為FAM，淬滅基團為TAMRA。根據本發明的一個優選實施方案，為了完成本發明的檢測方法首先採集標本，該 檢測方法適用標本類型為EDTA或檸檬酸鈉抗凝的人外周血l_2ml左右，需要立即送檢，如 不能立即送檢需要低溫保存。根據本發明的一個優選實施方案，為了完成本發明的檢測方法對上述標本提取 DNA，然後進行擴增檢測。根據本發明的一個優選實施方案，為了完成本發明的檢測方法，HLA-B27和HGH螢光PCR擴增體系(PCR MIX)分別按照如下方式配製，上遊引物(IOuM)=Iul下遊引物(IOuM)=Iul螢光探針(IOuM)0. 5ulPCR 反應液 21.5ul_Total24. 0 μ 1根據本發明的一個優選實施方案，上述PCR反應液包含FQ buffer (由 5 XFQbuffer經雙蒸水稀釋為IX作為工作濃度)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分。根據本發明的一個優選實施方案，上述1 XFQ buffer工作液各主要成分和濃度如 下50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。本發明的另一個目的是提供一種用於快速檢測人白細胞抗原HLA-B27基因的試 劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2) Taq酶系；(3) PCR反應體系(PCR MIX) ； (4)陽 性和陰性質控品。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的螢光定量PCR反應體系(PCRMIX)包 括HLA-B27PCR MIX和HGH PCR MIX，分別是由相應特異性上遊和下遊引物、螢光探針(Fam 螢光標記)、螢光定量PCR反應緩衝液(FQ-Buffer，內含鎂離子、Tris-HCl等)、四種核苷酸 單體(dNTPs)、PCR擴增增強劑和去離子水等成分構成的反應體系。根據本發明的一個優選實施方案，用於檢測HLA-B27及其內參照基因的反應體系 設置為30ul，具體配製方法是上述PCR-MIX24ul、Taq耐熱DNA聚合酶2ul加入提取的DNA 或者陽性質控品或者陰性質控品分別4ul。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的陽性質控品是指HLA-B27的特 異性擴增片段，經過克隆連接到T載體上，構建成的重組質粒，經過絕對定量其濃度為 107copies/mL· HLA-B27和HGH基因普通PCR的擴增結果見圖1。對陽性質控品進行梯度 稀釋，其擴增的動力學曲線和標準曲線如圖2和3。根據本發明的一個優選實施方案，稀釋陽性質控品(107COpieS/ml)，濃度梯度為 每 mil. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OX IO1Copies,進行靈敏度實驗， 結果證實本試劑盒檢測靈敏度為1. OX 102COpieS/ml，該螢光定量PCR方法的靈敏度和精 確性優於普通PCR方法。為了完成本發明的方法，首先採集標本，用無菌注射器抽取受檢者靜脈血1-2 毫升，注入無菌EDTA(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。標本可立即用於檢測，也可保存 於-20°C待檢，保存期為6個月。2-8°C保存時不應超過24小時。標本運送時應採用0°C冰 壺。然後進行DNA提取將抗凝血搖勻，取500 μ 1轉至一潔淨的1. 5ml離心管中，加入Iml 紅細胞裂解液(RCLB)，劇烈震蕩30s，3000g離心5min，棄上清。重複上述操作兩次至無明 顯紅色沉澱。加入Iml生理鹽水，劇烈震蕩15s，IOOOOg離心5min，棄上清。沉澱加50ul核 酸提取液100°C恆溫IOmin, 13，OOOg離心3min,取上清4 μ 1進行PCR反應。根據本發明的再一個優選實施方案，取出HLA-B27和HGH PCR MIX、Taq酶系，室 溫融化並振蕩混勻後，10，OOOrpm離心10s。對於每個標本都設定一個HGH內參照檢測，內 參照和HLA-B27同步進行，同時設置一個陽性對照和陰性對照。計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔淨離心管中，充分混勻，10，OOOrpm離心10s，向設定的PCR反應管中分別加 入PCR MIX和Taq酶系，向每管中加入處理後樣品(所獲得的DNA樣品)或HLA-B27陽性 質控品和陰性質控品4 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心30秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反 應槽內，按對應順序設置陰性控品、陽性質控品、內參照以及未知標本，並設置樣品名稱、標 記螢光基團種類(報告基團為FAM，猝滅基團為TAMRA)和循環條群ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM 7300/7500 和 MJ Opticon 等儀器循環條件 930C- 2分鐘，後93°C 30秒一55°C 45秒，採集螢光信號，40個循環。LightCycler等使用 毛細管的儀器循環條件93°C— 2分鐘，後93°C 5秒一56°C 45秒，採集螢光信號，共40個 循環。反應結束後，使用手動調整閾值使陰性質控品Ct值在40以上，Ct值小於35個循 環的為陽性；Ct值在35-40個循環之間，為灰區，需要進行重複試驗。重複試驗之後，如果 Ct值仍然在35-40個循環之間，判斷為陽性，沒有螢光值增長為陰性。判斷結果時應當注 意陽性對照的Ct值均應小於30，且呈標準S型擴增曲線。陰性質控品應當全部陰性，曲 線不呈S型增長。以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。根據本發明的一個優選實施方案，用已知標本對該試劑盒進行特異性實驗，結果 證實，本試劑盒特異性較好，吻合度為100%。本發明的試劑盒經過多次不同的重複實驗證實，具有良好的重複性和穩定性。 在-20°C條件下試劑盒可有效期可以達12個月。
四

圖1顯示常規PCR擴增特異性片段，2%的瓊脂糖凝膠電泳，經PCR擴增後，其擴增 產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下觀察，可看到與目的片段大小一致的電泳條帶，從 左到右依次是分子量Marker、人白細胞抗原HLA-B27、內參基因HGH和陰性對照PCR的擴增 結果。圖2顯示陽性質控品擴增動力曲線，梯度稀釋；圖3為陽性質控品標準曲線。
五具體實施例方式實施例1 :HLA_B27檢測標本的採集和運送用無菌注射器抽取受檢者靜脈血1-2毫升，注入無菌EDTA (或檸檬酸鈉)抗凝管， 立即混勻。標本可立即用於檢測，也可保存於-20°C或者-70°C冰箱。標本2-8°C保存下不 應超過24小時；-20°C保存期為6個月；-70°C以下可以長期保存。標本避免反覆凍融，標本 運送時應採用0°C冰壺。實施例2 基因組DNA的提取用本試劑盒配備的DNA提取試劑，將抗凝血搖勻，取500 μ 1轉至一潔淨的1. 5ml 離心管中，編號標記。加入Iml IX紅細胞裂解液(RCLB，由本試劑盒配備10XRCLB經雙蒸 餾水按1 9比例配製成1 XRCLB)，劇烈震蕩30s，3000g離心5min，棄上清。重複上述步 驟兩次至無明顯紅色沉澱。若紅色沉澱仍比較明顯，需要再重複上述步驟一次。加入Iml 生理鹽水，劇烈震蕩15s，IOOOOg離心5min，棄上清。沉澱加50 μ 1試劑盒配備的核酸提取 液，100°C恆溫IOmin, 13，OOOg離心3min,取上清4 μ 1進行PCR反應。實施例3 本檢測方法及試劑盒的適用儀器
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適用儀器主要包括ABIGeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、 ABI PRISM 7300等，以及LightCycler等使用毛細管的儀器、MJOpticon系列或取得資格認 證的定量PCR儀。實施例4 人白細胞抗原HLA-B27基因的檢測從試劑盒中取出用於檢測人白細胞抗原HLA-B27和內參基因HGH的PCRMIX、Taq 酶系，室溫融化並振蕩混勻後，10，OOOrpm離心10s。設所需要的PCR反應管管數為N則N =樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照+等樣本數的內參基因檢測)，每個HLA-B27和內參 基因HGH測試反應體系分別按照如下表配製
試劑PCR MIXTaq酶系用量24 μ 12μ 1計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔淨離心管中，充分混勻，10，OOOrpm離 心10s，每個PCR反應管中分別加入26 μ 1反應液(包含Taq酶系)，向每管中加入處理後 樣品(所獲得的DNA樣品)或HLA-B27陽性質控品和陰性質控品4 μ 1，10，OOOrpm瞬時 離心30秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性控品、陽性質 控品、內參照基因以及未知標本，並設置樣品名稱、標記螢光基團種類(報告基團為FAM， 猝滅基團為 TAMRA)和循環條件:ABI PRISM7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等使用薄壁管的儀器，循環條件93°C— 2分鐘，後93°C 30 秒一550C 45秒，採集螢光信號，40個循環；LightCycler等使用毛細管的儀器，循環條件 93°C — 2分鐘，後93 °C 5秒一56 °C 45秒，採集螢光信號，共40個循環。實施例5 結果分析和判定反應結束後，使用手動調整閾值使陰性質控品Ct值在40以上，Ct值小於35個循 環的為陽性；Ct值在35-40個循環之間為灰區，需要進行重複試驗。重複試驗之後，如果Ct 值仍然在35-40個循環之間判斷為陽性，沒有螢光值增長為陰性。判斷結果時應當注意陽性對照Ct值均應小於30，且陽性對照和內參照基因檢測 呈標準S型擴增曲線。陰性質控品應當全部陰性，曲線不呈S型增長。否則，如果陽性對照 或者內參基因檢測不呈標準S型擴增曲線，或者陰性對照呈標準S型擴增曲線，此次試驗均 應視為無效，全部試驗應重新進行。實施例6 本發明方法試劑盒的推廣應用使用本發明的方法和試劑盒，對大量標本進行定量PCR檢測，並最終經測序實驗 驗證。結果顯示本發明方法的試劑盒，靈敏度為102copies，準確性和特異性達100%，重 復性和穩定性較好，本試劑盒的保存條件和有效期為-20°C，12個月。本方法的發明可為人 白細胞抗原HLA-B27的檢測提供準確快速的方法，並作為強直性脊柱炎等HLA-B27相關疾 病的輔助診斷。六、序列表SEQUENCE LISTING北京索奧生物醫藥科技有限公司 一種人白細胞抗原HLA-B27基因螢光定量PCR快速檢測方法及其試劑盒
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6PatentIn version 3. 3120DNA人工合成1cttcatcacc gtgggctacg 20220DNA人工合成2tatccacggc gcccgcggct 20325DNA人工合成3gacgacacgc tgttcgtgag gttcg 25419DNA人工合成4aggatcccaa ggcccaact19519DNA人工合成5ggagcctgta gccattgca19626DNA人工合成6accactcagg gtcctgtgga cagctc 26
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權利要求
本發明為一種使用螢光定量PCR的技術檢測人白細胞抗原HLA B27(Human LeukocyteAntigenB27)基因的方法，通過提取人外周血基因組DNA，設計人白細胞抗原HLA B27序列特異性引物(SSP，Sequence Specific Primer)和特異性螢光探針，配以PCR反應緩衝液、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過PCR體外擴增法對人白細胞抗原HLA B27基因進行快速實時定量檢測。本發明的成果是一種用於檢測人白細胞抗原HLA B27基因的試劑盒，可用於強直性脊柱炎等疾病的輔助診斷。
2.根據權利要求1所述的一種檢測人白細胞抗原HLA-B27螢光定量PCR檢測方法及其 試劑盒，特徵在於試劑盒中同時引入了人生長激素(HGH，Human Growth Hormone)基因作為 實驗過程中的內參照。
3.根據權利要求1所述的雙色螢光PCR檢測方法及其試劑盒，所設計的用於檢測人白 細胞抗原HLA-B27的SSP弓丨物(序列特異性引物)和螢光探針序列為上遊引物5』 -CTTCATCACCGTGGGCTACG-3，； 下遊引物5，-TATCCACGGCGCCCGCGGCT-3，； 螢光探針FAM-5，GACGACACGCTGTTCGTGAGGTTCG3，-TAMRA。所設計的作為人白細胞抗原HLA-B27檢測的內參照的HGH基因的特異性引物和螢光探 針序列為上遊引物5，-AGGATCCCAAGGCCCAACT-3，； 下遊引物5，-GGAGCCTGTAGCCATTGCA-3，； 螢光探針FAM-5，ACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTC3，-TAMRA。 其中探針螢光標記均為FAM，淬滅基團均TAMRA。
4.根據權利要求1所述用於檢測人白細胞抗原HLA-B27和HGH的單份螢光PCR擴增體 系分別按照如下方式配製，上遊引物(10uM) :lul 下遊引物(10uM) :lul 螢光探針(10uM) 0. 5ul PCR 反應液 21.5ulTotal24. 0 u 1上述 PCR 反應液包含各 200uM dNTPs,50mM Tris-HCl (pH8. 0)、5mM MgC12、50mM KC1、 0. 01%的明膠等。在PCR反應液加入2ulTaq酶系和4ul提取物即可以對HLA-B27基因進 行擴增檢測。
5.根據權利要求1所述體外擴增法其擴增適用儀器和擴增條件為ABI PRISM 7700、 ABIPRISM5700、ABIGeneAmp7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon 等擴增儀，93°C—2 分鐘，然後93°C 30秒一55°C 45秒(採集螢光信號)，40個循環；LightCycler等擴增儀， 93°C— 2分鐘，然後93°C 5秒一56°C 45秒(採集螢光信號)，共40個循環。
全文摘要
本發明提供了一種使用螢光定量PCR技術(PCR-螢光探針法)從人外周血樣品中快速準確的檢測與強直性脊柱炎高度相關的人白細胞抗原HLA-B27基因的方法。該方法包括(1)採集樣品；(2)樣本預處理和提取DNA；(3)螢光探針體外擴增法對樣本進行檢測；(4)擴增反應結束後根據每個擴增反應的螢光強度對相應樣本進行分析，從而判斷患者是否攜帶與強直性脊柱炎高度相關的人白細胞抗原HLA-B27基因，作為臨床強直性脊柱炎的輔助診斷，實現了對人白細胞抗原HLA-B27基因的實時快速檢測。
文檔編號G01N21/64GK101928768SQ20091014819
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者任美峰, 劉健翊, 史成軍, 徐貴峰 申請人:北京索奧生物醫藥科技有限公司