Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測方法
2023-09-15 23:40:40
專利名稱：Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突變G10680A的快速檢測方法，屬Leber遺傳性視神經病研究技術領域。
背景技術：
Leber 遺傳性視神經病(Leber hereditary optic neuropathy, LHON ；MIM 535000)是經典的線粒體遺傳性疾病，即該病為母系遺傳性疾病，主要由mtDNA的點突變引 起發病。LHON有兩大臨床特1、性別偏好，即男性青壯年是易發人群；2、不完全外顯現象， 即攜帶mtDNA原發突變的個體不一定發病。目前對於LHON的研究開展較多，但是對於該病 的流行病學調查較少有報導，歐洲人群調查表明LHON人群頻率為1/50000-1/25000，而在 亞洲人群特別是我國未見流行病學調查數據。超過95%的LHON患者攜帶mtDNA的三個原發突變G11778A、G3460A, T14484C之 一，少數患者會同時攜帶兩個原發突變。臨床上對LHON的診斷除依據典型的臨床症狀和 家族遺傳史外，最終的確診還包括對原發突變的檢測。報導表明，在歐洲和我國LHON人群 中，三個常見原發突變的分布頻率具有較大差異，G11778A在國人LHON患者中的頻率高達 90%, G3460A的頻率只在左右，T14484C佔到約9%的病人，而在歐洲LHON患者中，這 三個突變的頻率分別約為57%，20%和23%。臨床上除確診的LHON患者外，還存在大量的 疑似LHON患者，這些患者具有較典型的LHON臨床症狀，有或缺乏家族母系遺傳史，不攜帶 三個常見原發突變。我們近期研究表明，在收集的16 例(疑似)LHON患者中，有843例 不攜帶三個常見的原發突變，同時我們還發現突變G3635A是我國LHON人群的一個稀有原 發突變，這也進一步說明我國LHON患者與歐洲LHON人群的mtDNA突變圖譜存在差異。針 對這些疑似LHON病例進行研究，有望進一步豐富國人LHON患者mtDNA的突變譜，為我國 LHON疾病的遺傳諮詢和臨床診治提供依據。2009年，Yang等人報導了一個攜帶原發突變 T14484C的我國LHON大家系，該家系表現出完全外顯率，這提示除T14484C外，一定存在其 它的影響因素導致家系所有母系患者的發病，經對先證者mtDNA全序列分析後發現，該家 系同時攜帶突變G10680A。該突變位於線粒體ND4L基因，在脊椎動物中具有較高的保守性， 因此該突變很可能與T14484C協同作用，導致了該LHON家系完全臨床外顯。我們在對10 個無常見原發突變的國人LHON家系研究後，在一個家系中檢測到G10680A的存在。通過進 化醫學分析方法，我們排除了其它mtDNA變異位點致病的可能性，同時未在檢索的來自一 般人群5000多例個體中發現該突變的存在，因此我們提出突變G10680A是該LHON家系發 病的致病因素。我們未發表的數據表明，突變G10680A在我國LHON患者中佔有一定的比例 (約為0. 5% )，這些研究提示G10680A是國人LHON患者的一個稀有致病突變。由於目前缺乏對LHON的有效治療措施，因此通過分子遺傳學檢測對該病進行遺 傳諮詢及臨床預防有著極其重要的作用。因此，對無原發突變Gl 1778A、G3460A、T14484C和 G3635A的LHON患者/家系進行G10680A突變檢測，無疑對於該病的遺傳研究、遺傳諮詢和預防具有重要的意義。目前有很多檢測DNA突變的技術方法，如序列測定、單鏈構象多態性分 析(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、及等位基因特異PCR。其中，等位基因特異 PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)方法操作簡便、快速，所需實驗器材簡單，實驗試劑經 濟，因此該方法被廣泛的應用於DNA突變或單核苷酸多態性(SNP)的檢測。等位基因特異 PCR的原理是將一條引物的3'末端鹼基設計成特異的突變鹼基，配合適當的反向引物，有 突變的DNA因3 『末端與引物配對從而擴增得到突變特異的PCR產物，而無突變的DNA模 板不能與突變特異性引物配對，因此不能擴增得到PCR產物。通過常規的瓊脂糖電泳檢測 PCR產物的有無，進而來判斷檢測樣本DNA是否存在突變。經文獻檢索，未見與本發明檢測突變位點相同的公開報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種快速、簡易、經濟的Leber遺傳性視神經病變線粒體 DNA突變G10680A的快速檢測方法。本發明基於AS-PCR的原理，將突變特異的引物3'端第一位設計成A鹼基(見 表1，L10680A)，用於擴增突變型DNA;在引物3'端第二位引入一個錯配鹼基(鹼基A突 變成鹼基T，形成T/T錯配)，增強引物對突變DNA模板擴增的特異性；在mtDNA序列上遠 離G10680A突變的區域，即包含4866-5461範圍，設計了一對內參引物(見表1，L4887/ H5442)，用於監測PCR擴增反應體系是否合適及反應是否正常進行擴增。採用上述兩對引 物(L10680A/H10972和L4887/H544》，在一個PCR反應中對待測標本DNA樣品進行擴增。 無論檢測的標本DNA是否含有G10680A突變，內參引物L4887/H5442都會擴增出PCR產物， 這樣就避免了由於PCR失敗而造成的突變G10680A假陰性的檢測結果。PCR擴增產物經瓊 脂糖電泳檢測，依據突變特異的電泳圖譜對G10680A突變進行基因分型，實現基因突變的 方便快速檢測。由於線粒體DNA突變具有異質性，即突變的與正常的mtDNA共存的現象，如果檢 測方法的靈敏度不夠高，則會在有突變異質性的患者中不能檢測到突變，從而導致假陰性 結果。本發明通過將正常人與含有G10680A突變病人的DNA樣品按不同比例混合，進行 AS-PCR，以檢測本技術方法的靈敏度，並提供本技術檢測到的最低水平的突變DNA的技術參數。本發明利用等位基因特異PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)方法檢測Leber遺 傳性視神經病變線粒體DNA突變G10680A，具體步驟如下(I)DNA提取使用常規酚/氯仿法或試劑盒法從臨床樣本中提取基因組DNA。(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應。PCR反應引物擴增引物序列及產物大小見表1表IAS-PCR所用引物組成、序列及產物大小引物名稱引物位置引物序列5' -3'產物大小用途L10680A10661-10680ntAGTCTTTGCCGCCTGCGAta312 bp檢測10680AH1097210972-10952ntTCAGGTAGTTAGTATTAGGAGL48874866-4887ntTGACAAAAACTAGCCCCCATCT596 bp內參H54425461-5442ntGCGATGAGTGTGGGGAGGAAPCR 反應體系總體系為 20 μ L，包含 30ng 基因組 DNA，IOmM Tris-HCl(pH 8.3)， 1. 5mM MgCl2, 50mM KCl，0. 5U TaKaRa rTaq, 175μΜ dNTP，突變特異引物 L10680A和 H10972 及內參引物L4887和H5442各0. 3 μ M。PCR 反應程序94°C，預變性 3min ；94°C變性 20s，61°C退火 20s，72°C延伸 30s，重 復30個循環；72°C延伸5min。(3) PCR產物檢測取PCR產物3 μ L在1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩衝液為 IX TAE, 150V恆壓電泳15min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統下觀察拍照。(4)靈敏度檢測能檢到的最低水平的突變DNA的濃度以lng、2. 5ng、5ng、IOng和15ng的含有 G10680A突變的DNA為模板，用與步驟(2)和(3)相同的PCR反應體系和程序擴增並檢測。能檢到的最低水平的突變異質性將正常人DNA樣本與含有G10680A突變的患者 DNA樣本在總量為30ng的情況下按設定比例混合，使突變的DNA樣本比例分別為5%、10% 和20%，將混合好的DNA模板按照與步驟(2)和(3)相同的PCR反應體系和程序擴增並檢 測。本發明與其它現有技術相比，具有快速、簡單、經濟、準確、靈敏的特點，儀器設備 要求不高，適合於在大規模的臨床樣本檢測中推廣應用。本發明對於Leber遺傳性視神經 病變的遺傳研究及諮詢具有重要的意義。
圖1為用本發明方法進行等位基因特異PCR檢測LHON線粒體突變G10680A的電 泳圖譜。圖2為本發明方法的靈敏度檢測電泳圖譜。
具體實施方案1、引物設計根據mtDNA G10680A突變，將突變特異的引物3'端第一位設計成A鹼基(見表1， L10680A)，用於擴增突變型DNA，同時在引物3'端第二位引入一個錯配鹼基(鹼基A突變 成鹼基T，形成T/T錯配)，以增強引物對於突變位點的特異性，在下遊設計另一個引物(表 1，H10972)，和突變特異性引物一起擴增出一條312bp的突變特異的片段。同時，在mtDNA 4866-5461區段設計了 一對內參引物(見表1，L4887/H5442)，無論有無G10680A突變，內參 引物都能擴增得到一條596bp的片段。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列
5及產物大小見表1。2、樣本採集採集3例經過DNA序列測定證實攜帶有G10680A突變的DNA樣本和3例正常人全 血樣本。3、樣品基因組DNA提取使用酚/氯仿法提取全血樣本中基因組DNA。4、PCR 擴增PCR 反應體系總體系為 20 μ L，包含 30ng 基因組 DNA，IOmM Tris-HCl (pH 8. 3)， 1. 5mM MgCl2, 50mM KCl，0. 5U TaKaRa rTaq, 175μΜ dNTP，突變特異引物 L10680A和 H10972 及內參引物L4887和H5442各0. 3 μ M。PCR 反應程序94°C，預變性 3min ；94°C變性 20s，61°C退火 20s，72°C延伸 30s，重 復30個循環；72°C延伸5min。5、PCR產物檢測PCR產物檢測取PCR產物3 μ L在1. 5 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩衝液為 IX TAE, 150V恆壓電泳15min，溴化乙啶染色5min，凝膠成像系統下觀察拍照。6、靈敏度檢測能檢到的最低水平的突變DNA濃度以lng、2. 5ng、5ng、IOng和15ng的含有 G10680A突變的DNA為模板，用與步驟4和5相同的PCR反應體系和程序擴增並檢測；能檢到的最低水平的突變異質性將正常人DNA樣本與含有G10680A突變的患者 DNA樣本在保持總量為30ng模板DNA的情況下按一定比例混合，使突變的DNA樣本比例分 別為5%、10%和20%，將混合好的DNA模板用與步驟4和5相同的PCR反應體系和程序擴 增並檢測。用本發明方法進行等位基因特異PCR檢測LHON線粒體突變G10680A的電泳結果 (見圖1)。其中泳道1為未加DNA模板進行PCR擴增的陰性對照，泳道2-4為無突變G10680A 的正常人DNA樣本擴增結果，泳道5-7為有G10680A突變的LHON患者DNA樣本擴增結果， 泳道M為2000bp的核酸分子量標準。圖中596bp的條帶為內參條帶，除了陰性對照外，所 有的檢測樣本都有此條帶，表明PCR體系和條件合適，擴增成功；312bp的條帶為突變特異 條帶，只有G10680A突變存在的樣本才會擴增出此條帶。本發明方法的靈敏度檢測結果(見圖2)。其中泳道1為未加DNA模板進行PCR 擴增的陰性對照；泳道2-6分別為以lng、2. 5ng、5ng、10ng和15ng含有G10680A突變的 DNA為模板進行擴增的結果；泳道7-9為突變的與正常的DNA在總量為30ng模板DNA的情 況下混合，使突變的DNA比例分別為5%、10%和20%，再進行擴增的結果；泳道10為含有 G10680A突變的LHON患者DNA樣本擴增結果；泳道M為2000bp的核酸分子量標準。如圖所 示，本發明提供的實驗條件最少能採用5ng的DNA為模板進行有效的擴增檢測。在DNA模 板總量為30ng的情況下，本發明能檢測到低至10%的G10680A突變的異質性水平。
權利要求
1. 一種Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測方法，包括基因 組DNA提取、引物設計、PCR擴增、電泳檢測步驟，其特徵在於本快速檢測方法的具體步驟如 下(1)使用酚/氯仿法或試劑盒提取法從臨床樣本中提取基因組DNA；(2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應，PCR反應引物為
全文摘要
本發明涉及一種Leber遺傳性視神經病變線粒體DNA突變G10680A的快速檢測方法，屬Leber遺傳性視神經病變研究技術領域。本發明基於AS-PCR的原理，將突變特異的引物3′端第一位設計成A鹼基L10680A，同時在引物3′端第二位引入一個錯配鹼基(鹼基A突變成鹼基T，形成T/T錯配)，在線粒體DNA序列的4866-5461區域，設計一對內參引物L4887/H5442。採用上述兩對引物(L10680A/H10972和L4887/H5442)，在一個PCR反應中對待測標本DNA樣品進行擴增。PCR擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，依據突變特異的電泳圖譜對G10680A突變進行基因分型，實現突變基因的快速檢測。本發明具有簡單、快速、經濟、靈敏的特點。本發明對於Leber遺傳性視神經病變的遺傳研究及諮詢具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102146443SQ20111000171
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者姚永剛, 張阿梅 申請人:中國科學院昆明動物研究所