一種用於防治阿爾茨海默病藥物作用研究的基因晶片的製作方法

2023-09-17 04:26:05

專利名稱：一種用於防治阿爾茨海默病藥物作用研究的基因晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於防治阿爾茨海默病藥物藥理作用和作用機理研究的基因芯 片還涉及該晶片的製備方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)又稱老年痴呆症，是一種嚴重人類健
康的神經退行性疾病。臨床以進行性記憶力減退、認知功能障礙和行為異常為特徵，以 腦萎縮、腦內出現老年斑和神經原纖維纏結、神經元丟失為其病理特徵。目前已知，各種類型的痴呆至少有32種，而其中AD就佔了其發病率的50 60%之多。根據流行病學調查發現，目前全世界有2500萬以上的AD患者。2008年美 國AD病人估計達到520萬，65歲及65歲以上(13%)人群8個中就有1個為AD患者， 每71秒就有1個人染上AD，到中世紀則每33秒就有1人成為AD患者，不包括護理費 每年用於治療AD的直接費用超過了 1480億美元。在我國通過嚴格統計學抽樣方法抽取 城鄉不同生活環境的老年人群樣本進行統計分析，結果表明，我國AD的患病率並不比 西方國家低，屬於AD重災區。AD患者通常被確診後，平均可活8 10年，有的達20 年，因此每年用於治療AD以及康復護理的花費和給病人家屬帶來的精神負擔使得AD已 成為21世紀許多家庭不得不面對的災難，由此帶來的社會、經濟、家庭和社會公共衛生 問題也日益突出。目前，美國FDA批准的用於AD治療的藥物有5個，包括4個膽鹼酯酶抑制劑 禾口 1個N-甲基-D-門冬氨酸(Nmethyl D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑，這些藥物可使 部分輕度患者的症狀得到改善，在一定程度上延緩病情的發展，但療效有限。因此，目 前有許多國家每年投入大量資金用於AD發病機理研究以及防治藥物的研究開發，各大制 藥公司如雅培(Abbott)、輝瑞(Pfizer)、諾和諾得(Novonordisk)等也將防治AD藥物作 為新藥研究開發的重點之一。有調查顯示，目前促智藥及抗AD藥物在神經精神藥物市 場佔有巨大份額，佔全球銷售額的33%。到2010年，在全球7大藥物市場中，用於AD 治療藥物的市場將達到78億美元，但由於缺少療效好的品種，防治AD的藥物還遠不能 滿足市場需求。AD屬於多因素相關的複雜性疾病，其病因不清，發病機理複雜，涉及多系統、 多環節結構與功能異常。AD發病機制的學說有很多，如基因學說、衰老學說、Αβ學 說、膽鹼能學說、自由基學說、線粒體缺陷學說、神經內分泌免疫調節網絡失衡學說、 傳染學說、免疫炎症學說、鋁中毒學說、鈣超載學說、代謝紊亂學說等。其發生發展涉 及多條功能通路上的生物分子的變化，與多系統、多途徑生物分子網絡的改變有關，並 非單一基因、單一通路或單一系統分子變化的結果。因此，應用傳統的方法針對單一途 徑、單一靶點研究防治AD藥物的藥理作用和作用機理難以取得滿意結果，也不利於發現 藥物的毒副作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於防治AD藥物藥理作用和機理研究的基因晶片。本 發明的基因晶片固定有寡核苷酸探針陣列，其中寡核苷酸對應的基因是與AD發生發展密 切相關的生物分子的基因，包括家族性阿爾茨海默病基因和易感基因、APP以及APP生 理途徑分子、澱粉樣變、微管和細胞骨架重組、突觸功能、神經傳遞和離子通道、神經 再生、神經內分泌免疫調節網絡、免疫應激以及蛋白質代謝的病理生理分子的基因。具體地說，本發明的基因晶片上固定的寡核苷酸探針對應的基因為(1)家族性 阿爾茨海默病基因；(2)阿爾茨海默病易感基因；(3) APP和APP生理相關蛋白基因； (4)分泌酶基因；(5)澱粉樣化相關分子基因；(6)參與β澱粉樣蛋白降解的相關分子基 因；(7)通過胞吞清除β澱粉樣蛋白的分子基因；(8)參與β澱粉樣蛋白代謝的其他分 子基因；(9)微管和細胞骨架重組相關分子基因；(10)突觸可塑性調節相關分子基因； (11)突觸傳遞相關分子基因；(12)突觸發生相關分子基因；(13)神經傳遞相關分子基 因；(14)神經發生表達基因；(15)中樞神經系統發育相關基因；(16)軸突導向相關分 子基因；(17)膠質發生相關分子基因；(18)樹突形態建成相關分子基因；(19)下丘腦 分泌相關分子基因；(20)垂體分泌相關分子基因；(21)卵巢分泌相關分子基因；(22) 胸腺分泌相關分子基因；(23)甲狀腺分泌相關分子基因；(24)胰島分泌相關分子基因； (25)小腸分泌分子基因；(26)免疫因子基因；(27)免疫應激基因，包括急性應激、炎性 應激、淋巴細胞激活、細胞因子以及其他免疫應激基因；(28)膠質免疫系統相關分子基 因；(29)信號轉導基因；(30)蛋白質代謝基因；(31)線粒體相關分子基因。更具體地說，本發明的基因晶片上固定的寡核苷酸探針對應的基因為下表中所 列200個基因表1防治AD藥物作用研究基因晶片所選基因一覽表
權利要求
1.一種用於防治阿爾茨海默病藥物作用研究的基因晶片，其特徵在於晶片上固定寡 核苷酸探針陣列，上述寡核苷酸探針對應的基因是與AD發生發展密切相關的生物分子的 基因，包括家族性阿爾茨海默病基因和易感基因、APP以及APP生理途徑分子、澱粉樣 變、微管和細胞骨架重組、突觸功能、神經傳遞和離子通道、神經再生、神經內分泌免 疫調節網絡、免疫應激以及蛋白質代謝的病理生理分子的基因。
2.根據權利要求1所述基因晶片，其中晶片上固定的寡核苷酸探針對應的基因包括 31個功能群(1)家族性阿爾茨海默病基因；(2)阿爾茨海默病易感基因；(3) APP和 APP生理相關蛋白基因；(4)分泌酶基因；(5)澱粉樣化相關分子基因；(6)參與β澱 粉樣蛋白降解的相關分子基因；(7)通過胞吞清除β澱粉樣蛋白的分子基因；(8)參與 β澱粉樣蛋白代謝的其他分子基因；(9)微管和細胞骨架重組相關分子基因；(10)突觸 可塑性調節相關分子基因；(11)突觸傳遞相關分子基因；(12)突觸發生相關分子基因； (13)神經傳遞相關分子基因；(14)神經發生表達基因；(15)中樞神經系統發育相關基 因；(16)軸突導向相關分子基因；(17)膠質發生相關分子基因；(18)樹突形態建成相 關分子基因；(19)下丘腦分泌相關分子基因；(20)垂體分泌相關分子基因；(21)卵巢 分泌相關分子基因；(22)胸腺分泌相關分子基因；(23)甲狀腺分泌相關分子基因；(24) 胰島分泌相關分子基因；(25)小腸分泌分子基因；(26)免疫因子基因；(27)免疫應 激基因，包括急性應激、炎性應激、淋巴細胞激活、細胞因子以及其他免疫應激基因； (28)膠質免疫系統相關分子基因；(29)信號轉導基因；(30)蛋白質代謝基因；(31)線 粒體相關分子基因。
3.根據權利要求1所述基因晶片，其中晶片上固定的寡核苷酸探針對應的基因如下
4.根據權利要求1-3任一所述基因晶片，其特徵在於寡核苷酸探針按照功能群進行有 序排列為陣列，寡核苷酸陣列為所列200個基因的寡核苷酸基因探針。
5.根據權利要求4所述基因晶片，其特徵在於寡核苷酸探針的長度為60mer。
6.根據權利要求4所述基因晶片，其中寡核苷酸探針的核苷酸序列為
7.根據權利要求4所述基因晶片，其特徵在於每張晶片上分隔為4個區域，其中每個 區域所點基因以及基因的排序陣列是相同的，每個區域都包括上述的200個基因的寡核 苷酸探針，每個區域的每個基因都是雙次點樣。
8.一種用於防治阿爾茨海默病藥物作用研究基因晶片的製備方法，包括如下步驟(1)DNA方陣的構建DNA方陣是由上述200個基因的長度為60mer的寡核苷酸探 針組成，在片基上排布的方式為每張晶片上分隔為4個區域，其中每個區域所點基因以 及基因的排序陣列是相同的，每個區域都包括上述200個基因，每個區域的每個基因都 是雙次點樣；(2)探針的合成設計各基因的寡核苷酸探針，採用離線固相化學方法合成上述200 個基因的寡核苷酸探針，採用PAGE方法對合成的寡核苷酸探針進行純化，並採用分光光 度計方法質檢合格後方能用於點樣；(3)合成後點樣利用自動點樣裝置將步驟(2)中預先製備好的寡核苷酸探針依照步 驟(1)所述直接點在預先進行表面化學處理的片基上，點樣後將晶片和探針進行固化。
9.根據權利要求8所述基因晶片的製備方法，其中200個基因的寡核苷酸探針的核苷 酸序列如權利要求6所示。
10.權利要求1-3所述基因晶片在製備阿爾茨海默病診斷試劑、篩選阿爾茨海默病防 治藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種用於防治阿爾茨海默病(AD)藥物作用研究的基因晶片。該晶片上固定寡核苷酸基因探針陣列，其中寡核苷酸是與AD發生發展過程密切相關的重要生物分子基因，涉及家族性AD病基因和易感基因、澱粉樣變、微管和細胞骨架重組、突觸功能、神經傳遞和離子通道、神經再生、免疫調節、免疫應答、信號轉導、線粒體以及蛋白質代謝等病理生理分子。本發明的晶片可用於AD防治藥物包括化學藥、生物技術藥、單味中藥和中藥複方及其提取物藥理作用及作用機理的研究，亦可用於防治AD藥物的篩選、配伍組方等研究，還可用於AD發病機制研究以及臨床病例的輔助和鑑別診斷。本發明的基因晶片克服了採用單靶標的方法研究多因素疾病藥物的缺陷，具有良好的應用前景。
文檔編號C40B40/06GK102010891SQ200910092218
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月7日 優先權日2009年9月7日
發明者周文霞, 孫琰, 張永祥, 張癸榮, 楊勝, 王杉, 程肖蕊, 耿淼, 舒蕾, 董蕾, 蔣寧, 趙月瑩, 鄭越, 鍾乃鳳, 黃璜 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所