葛根提取物在2型糖尿病治療中的應用的製作方法

2023-09-19 22:49:05

專利名稱：葛根提取物在2型糖尿病治療中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，同時，本發明涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強信號傳導途徑中胰島素信號的方法；另外，本發明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得提取物並選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用於預防和/或治療2型糖尿病；最後，本發明涉及葛根(Pueraria Tuberosa)提取物的藥物組合物。
背景技術：
2型胰島素抗性性糖尿病是一種隱襲疾病，佔糖尿病病例的95％以上。這種異質疾病在流行病中的比例正在增加，估計其世界範圍的發病率每年增長6％以上1，2。該病主要表現為高血糖症，原因是葡萄糖對胰島素的反應性降低或抵抗而使葡萄糖進入骨骼肌、脂肪和肝臟存在障礙3，4。大量證據表明游離脂肪酸(FFAs)對胰島素無效負有責任。體內循環中升高的游離脂肪酸伴隨著胰島素功能損傷，並通常與肥胖和2型糖尿病相關聯5-7。血漿游離脂肪酸濃度經脂類注入而升高，導致鼠和人骨骼肌中的胰島素抗性7-9。分離的肌肉帶或培養的肌肉細胞與游離脂肪酸的培養，或脂蛋白酶在骨骼肌中的表達，減少了胰島素介導的葡萄糖吸收6-12。這些報導表明，胰島素敏感組織中越多的脂類沉積促進了胰島素的無效和抵抗。游離脂肪酸誘導的胰島素活性損傷似乎與胰島素信號傳導缺陷有關。游離脂肪酸引起的葡萄糖轉運降低與胰島素刺激的胰島素受體底物(IRS-1)磷酸化和IRS-1相關磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3-K)活化的抑制有關13-15。噻唑烷二酮(TZD)的治療減少了對抗靶組織中胰島素作用的循環遊離脂肪酸，從而提高了胰島素活性16-18。經過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)的活化來誘導脂肪細胞中甘油激酶基因的表達，TZD增進了甘油整合入甘油三酯，並因此降低了脂肪細胞對游離脂肪酸的分泌，這幫助了胰島素的致敏作用19。

發明內容
本發明的主要目的是開發一種預防和/或治療2型糖尿病的方法。
本發明的另外一個主要目的是開發一種增進葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜的方法，來增強信號傳導途徑中的胰島素信號。
本發明的另外一個目的是開發一種簡單、廉價的方法來獲得葛根提取物並選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用於預防和/或治療2型糖尿病。
本發明還有一個目的是開發一種用於預防和/或治療2型糖尿病的藥物組合物。
本發明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，本發明還涉及一種增進葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化及Glut4易位到靶細胞膜來增強信號傳導途徑中胰島素信號的方法；另外，本發明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得葛根提取物並選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用於預防和/或治療2型糖尿病；最後，本發明涉及葛根提取物的藥物組合物。
具體實施例方式
因此，本發明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，同時，本發明也涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜的方法，來增強信號傳導途徑中的胰島素信號；另外，本發明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得葛根提取物並選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)，用於預防和/或治療2型糖尿病；最後，本發明涉及葛根提取物的藥物組合物。
本發明的另一個實施方式中，涉及預防和/或治療有需要的受試者的2型糖尿病的方法，所述方法包括給該受試者注入藥用有效量的植物葛根(Pureria tuberosa)提取物或提取物的正丁醇餾分或LupinosideA4(LPA4)，可選的與一種或多種添加劑一起給藥。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述受試者是動物。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述受試者是人。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述餾分的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
本發明的另外一個實施方式中，涉及權利要求1所要求保護的方法，其中Lupinoside的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
本發明的另外一個實施方式中，涉及權利要求1所要求保護的方法，其中給藥途徑選自口服、靜脈注射、肌肉注射和皮下給藥。
本發明的另外一個實施方式中，涉及一種用於預防和/或治療2型糖尿病的藥物組合物，所述組合物包含植物葛根提取物或提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，和添加劑。
本發明的另外一個實施方式中，所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉、明膠糊的營養素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
本發明的另外一個實施方式中，所述提取物從植物根中獲得。
本發明的另外一個實施方式中，所述餾分濃度範圍是1-40mg/kg體重。
本發明的另外一個實施方式中，其中Lupinoside的濃度範圍是1-40mg/kg體重。
本發明的另外一個實施方式中，所述組合物的劑型選自膠囊、糖漿、濃縮劑、粉末和顆粒。
本發明的另外一個實施方式中，所述提取物是水提取物。
本發明的另外一個實施方式中，涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強有需要的受試者的信號傳導途徑中胰島素信號的方法，所述方法包括給該受試者注入藥用有效量的植物葛根提取物或提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，任選的與一種或多種添加劑一起給藥。
本發明的另外一個實施方式中，所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉、明膠糊的營養素，藥物可接受的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
本發明的另外一個實施方式中，所述餾分給藥濃度是1-40mg/kg體重。
本發明的另外一個實施方式中，其中Lupinoside的給藥濃度是1-40mg/kg體重。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述方法幫助預防和/或治療2型糖尿病。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述方法顯示了細胞對葡萄糖吸收的增加。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述方法對細胞是無毒性的。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述易位是從胰島素反應細胞的細胞質轉移到細胞膜。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述Lupinoside A4(LP4)預防棕櫚酸誘導的胰島素信號傳導缺陷。
本發明的另外一個實施方式中，其中所述Lupinoside A4(LP4)使胰島素能夠刺激胰島素受體β(IRβ)和效應物激酶(Akt)的磷酸化。
本發明的另外一個實施方式中，涉及一種簡單、廉價獲取提取物及隨後選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)用於預防和/或治療2型糖尿病的方法，所述方法包括如下步驟●將植物部分切成小塊，●用甲醇和水提取切後的小塊，●將甲醇和水提取物在乙酸乙酯和水之間分層，●用正丁醇進一步萃取水層來獲得丁醇餾分，和●用水和甲醇作為洗脫液將正丁醇餾分進行層析來獲取Lupinoside PA4(LPA4)。
本發明的另外一個實施方式中，其中植物部分是根。
本發明的另外一個實施方式中，其中溶劑選自甲醇和水。
本發明的另外一個實施方式中，其中水和甲醇的比例為大約1∶1。
本發明的另外一個實施方式中，其中層析是柱層析。
胰島素對靶組織敏感性降低或胰島素抗性導致了2型糖尿病，該病目前正達到工業化社會中的流行性比例。目前還不清楚胰島素是如何失去其敏感性的。大量證據表明游離脂肪酸(FFA)導致胰島素抗性。我們已經證明棕櫚酸(一種游離脂肪酸)幹擾了胰島素與3T3L1脂肪細胞細胞膜的210kDa受體蛋白結合。棕櫚酸沒有改變胰島素結合的親和力，因為Ka保持不變，但是它顯著降低了胰島素對受體的佔有量，最大結合量(Bmax)從7.3pM(胰島素)到3.46pM(胰島素加棕櫚酸)。棕櫚酸對胰島素和胰島素受體(IR)之間相互作用的抑制與IRβ酪氨酸磷酸化水平的下降同時發生，這是一種主要靶細胞響應，隨後是胰島素-IR複合。隨後，我們檢查了胰島素刺激的下遊信號，它們隨著IRβ的酪氨酸磷酸化而相應的被磷酸化。用棕櫚酸培養3T3L1細胞24小時，致使胰島素增強的IRS1、PI3激酶和Akt的磷酸化水平下降了約2倍，並完全阻斷了胰島素誘導的Glut4易位。所有這些都表明了棕櫚酸引起的胰島素信號下降，這導致了胰島素無效。從植物根中分離的LupinosideA4(LPA4)防止了棕櫚酸誘導的胰島素信號傳導缺陷。LPA4與棕櫚酸的共培養使胰島素能夠刺激IRβ和AKt的磷酸化以及經胰島素誘導的Glut4易位。因此，LPA4證明了其作為治療劑在胰島素抗性和2型糖尿病中的應用。
這些報導促使我們關注引起胰島素抗性和2型糖尿病的主要化合物一游離脂肪酸。早期報導顯示在游離脂肪酸中，棕櫚酸是胰島素活性的最強抑制劑12，20-23，但是我們面對的問題是它如何導致這樣的缺陷。用棕櫚酸、十四酸、丁酸鹽、辛酸鹽、硬脂酸、月桂酸和亞油酸對3T3L1脂細胞預處理24小時，隨後用胰島素培養30分鐘，然後測定3H-2-脫氧葡萄糖(2-DOG)的吸收，結果表明棕櫚酸可被選為最強大的抑制劑(未顯示數據)。這促使我們探索抑制棕櫚酸誘導的、胰島素刺激的葡萄糖吸收的潛在機理。棕櫚酸誘導的脂肪細胞經裂解，分離細胞膜，溶解，進行不變性的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)，然後進行放射自顯影。125I-胰島素結合蛋白能夠被定位在210kDa的凝膠區域，這證實了關於非變性條件下的洗滌劑溶解的胰島素受體和3T3L1脂細胞的早期報導24-26。圖1a表明棕櫚酸有效降低了胰島素與受體的結合。正如有關β-腎上腺素受體的報導27-29，棕櫚酸的結合或IR的酯化沒有改變胰島素與受體的親和力但是卻導致受體佔有量下降兩倍，Bmax從7.3降低到3.6pM(圖1b)。由於硬脂酸和十四酸不能降低125I-胰島素與受體的結合(未公開數據)，我們假定這是棕櫚酸特有的作用。有趣的是，放射性標記的棕櫚酸與相似分子大小的蛋白質(1a)結合，表明IR的棕櫚酸醯化。在一個模型的幫助下，該假定背後的邏輯在圖1c中得到了解釋。為了識別棕櫚酸醯化的可能位點，基於近期被確定的1型胰島素樣生長因子受體的晶體結構，同源模擬了鼠胰島素受體首選3個結合域的三維結構。丙氨酸掃描突變結果有力表明了胰島素受體上的這一區域(在圖1c中的氰基環內)是胰島素結合的最可能的位點31。共有胺基酸序列27的缺乏意味著棕櫚酸醯化的優先選擇取決於三維結構，而正電和/或中性表面將有利於其醯化。模擬結構表面電勢的計算、半胱氨酸殘基可溶性及近似測定已經幫助我們從IR的L1-富含Cys-L2區域中的16個電勢對中識別出用於醯化的兩個半胱氨酸電勢對(Cys-8Cys-26 and Cys-266Cys-274)。由於僅僅是棕櫚酸與IR結合併不意味著生物學上的相關性，所以我們研究了棕櫚酸對胰島素刺激的信號的影響，來證明其結合與功能的重要關聯。我們首先觀察了胰島素受體β(IRβ)的棕櫚酸醯化，通過使用棕櫚酸或不使用棕櫚酸對3T3L1培養24小時並隨後用胰島素培養。棕櫚酸顯著降低了胰島素刺激的IRβ磷酸化，而硬脂酸沒有表現出這樣的抑制作用(圖1d)。這些結果表明棕櫚酸結合或受體的棕櫚酸醯化具有生理學上的相關性，因為IRβ的磷酸化是來自胰島素靶細胞的主要反應。
為獲得進一步證據，我們檢查了胰島素增強的下遊信號，它們隨著受體酪氨酸激酶的磷酸化而得到相應的磷酸化。使用磷酸特異抗體，我們發現胰島素對IRS-1磷酸化和PI3K活化的刺激作用被棕櫚酸顯著抑制。棕櫚酸也降低了胰島素對其他下遊分子的刺激作用，即Akt活化。然而，用硬脂酸培養沒有顯示這樣的抑制作用(圖2a)。關於胰島素對IRS相關的磷酸化和IRS1相關的PI3K活化的刺激作用的下降之前已經有報導13，15，20，這裡，我們表明了棕櫚酸能夠單獨導致這種缺陷。我們在研究中的另外一個有趣發現是棕櫚酸誘導的抑制作用的範圍窄。Western雜交的光密度分析表明IRβ、PI3 K和Akt磷酸化的胰島素刺激的磷酸化水平下降了2倍(未顯示數據)。胰島素和棕櫚酸對IRβ、PI3 K和Akt的蛋白質構型都沒有任何改變(圖2a)。我們的發現給出這樣的印象棕櫚酸對胰島素信號的幹擾可能源於IR水平，隨後抑制波流經下遊的信號傳導分子。這限制了PI3激酶的募集，導致PIP3與Akt結合的抑制，這將對Glut4轉運產生負面影響。最後，Glut4易位支持了這一觀點，Glut4易位對葡萄糖進入細胞是必要的。胰島素誘導的GFP-Glut4從脂肪細胞的細胞質到細胞膜的易位完全被棕櫚酸所抑制(圖2b)。
在尋找具有抗糖尿病活性的印度藥用植物過程中，發現葛根根部的甲醇-水(1∶1)提取物改善了胰島素活性的棕櫚酸損傷，依據3T3L1細胞對3H-2DOG的吸收。使用Diaion HP-20色譜儀，我們獲得了5個餾分(A-E)，其中餾分E表現出所需要的活性。通過葡聚糖凝膠色譜儀LH20對E進行分離，得到3個餾分(F-H)，其中F表現出棕櫚酸誘導的損傷的改善。因此，餾分F經HPLC純化得單一分子，經二維核磁共振和質譜分析被確認為Lupinoside PA432(圖3a)。LPA4對棕櫚酸誘導的胰島素傳導分子損傷的保護性在3T3L1脂細胞中進行了檢驗。圖3b說明了LPA4能夠防止棕櫚酸誘導的脂細胞對胰島素刺激的3H-2DOG吸收減少。棕櫚酸對胰島素刺激的IRβ酪氨酸磷酸化和Akt磷酸化的減弱作用被LPA4解除(圖3c)。已知Akt是一種非常重要的下遊信號，它激活Glut4的過程對Gult4易位到胰島素靶細胞的細胞膜是必需的33,34。在響應胰島素時，Akt2被聚集到含有載體的Glut4上並對組成蛋白質進行磷酸化35。因此，LPA4在免除棕櫚酸誘導的對胰島素刺激的Akt磷酸化的抑制作用是非常有意義的，因為這個途徑的損傷導致了胰島素抗性。這一點通過我們對Glut4易位中棕櫚酸抑制的胰島素刺激的觀察而得到進一步支持。LPA4與棕櫚酸的共培養允許胰島素刺激GFP-Glut4從細胞質易位到細胞膜(圖3d)。Glut4是胰島素響應細胞中至關重要的葡萄糖轉運體，它構成性的通過細胞表面循環。胰島素積極將Glut4隔離在細胞內部，增加了Glut4轉運到細胞膜的速度32。儘管Glut4轉運的細胞機制還有很大疑團，但是Glut4易位缺陷牽涉到胰島素抗性34。我們對GFP-Glut4易位的測定結果說明，棕櫚酸引起胰島素刺激的Glut4易位的完全阻斷，而LPA4則全部抵消了這種阻斷作用。這些結果在胰島素抗性或2型糖尿病中顯得特別有趣，因為(i)大量研究表明游離脂肪酸，特別是棕櫚酸，在胰島素抗性的形成中的作用20-23；(ii)棕櫚酸是循環系統和骨骼肌細胞中發現最多的游離脂肪酸10，12；(iii)液體提取物的甘油二酯餾分中最普遍的醯基鏈是棕櫚酸36；(iv)棕櫚酸的消耗降低了胰島素的敏感性37，38；和(v)胰島素抗性肌肉表現出對棕櫚酸更高速率的吸收39。所有這些報導都關注棕櫚酸是導致胰島素抗性的主要游離脂肪酸。然而，有幾項研究表明棕櫚酸誘導的胰島素作用缺陷是由神經醯胺介導的12。可能存在多種有效的胰島素失效途徑，神經醯胺可能是其中一種，而我們所觀察到的是另外一種，其中棕櫚酸直接導致胰島素無作用。LPA4免除了棕櫚酸引起的胰島素失效。由於LPA4在所有重要階段防止了緣於棕櫚酸的胰島素信號傳導缺陷，包括Glut4從細胞質易位到細胞膜的階段，這樣的Luponoside極具作為胰島素抗性和2型糖尿病治療劑的可能性。


圖1.(a)棕櫚酸誘導的對胰島素與受體結合和受體酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用。放射性標記胰島素和棕櫚酸結合溶解的胰島素受體製劑的放射自顯影。3T3 L1脂細胞在不存在或存在棕櫚酸條件下培養24小時，受體製劑用0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)溶解。25μg蛋白與2ng125I-胰島素(特異活性30.55μCi/μg蛋白)4℃培養過夜。培養結束後，105g下高速離心1小時進行壓片，125I-胰島素必然成為溶解的受體製劑。胰島素受體製劑和125I-胰島素在冷的棕櫚酸(PA)或硬脂酸(SA)存在下以相同方式培養。溶解的受體製劑中的25μg蛋白與[1-14C]-棕櫚酸於4℃培養過夜後進行放射自顯影(14C-PA)。
(b)通過Scatchard分析來確定結合親和力和受體佔據量。計算胰島素結合溶解受體的最大結合量(Bmax)和Ka分別為7.3pM和0.16×1010M-1。但是，當存在棕櫚酸時，胰島素結合的Ka幾乎保持不變，即為0.158×1010M-1，而Bmax降低為3.46pM。
(c)(i)展示了胰島素受體三個結構域(L1-富含半胱氨酸-L2)的同源模擬。由氰基標記的L1結構域是最可能的胰島素結合位點。結合常數降低300倍的丙氨酸突變殘基用紅色標記；結合常數降低10-100倍的突變用粉色標記，其餘結合降低3-9倍的用黃色標記。半胱氨酸殘基用綠色標記，其Cys-8Cys-26(在紅圈內標記為ii)和Cys-266Cys-274(在紅圈內標記為iii)是最可能的棕櫚酸醯化位點。(ii)和(iii)顯示了兩個可能的半胱氨酸對Cys-8Cys-26和Cys-266Cys-274的周圍靜電勢，由於具有優勢的正向靜電勢(藍色)和中性靜電勢(白色)環境，Cys-8Cys-26和Cys-266Cys-274被選為棕櫚酸醯化位點。(iv)顯示了Cys-192Cys-201的靜電勢環境，儘管具有正確的(正向或中性)環境，但因其完全包埋在表面之下而沒有被選為潛在的醯化位點。(v)顯示了Cys-126Cys-155周圍的靜電勢，代表了那些主要是負電的放棄位點(紅色)。
(d)對照和游離脂肪酸處理的3T3L1脂肪細胞在裂解緩衝液中超聲裂解，10000g離心10分鐘，從對照和被處理細胞中取200μg上清蛋白，加入2μgIRβ抗體，4℃培養過夜。抗原抗體複合物與蛋白A-瓊脂糖一起沉澱，充分洗滌沉澱，懸浮於SDS-PAGE樣品緩衝液中並煮沸，電泳。將凝膠中的蛋白轉到PVDF膜，與抗p-Tyr抗體免疫印跡。I-胰島素；P-棕櫚酸；S-硬脂酸。
圖2.(a)3T3L1與棕櫚酸和硬脂酸共培養，如圖1描述。培養結束時，在裂解緩衝液中超聲裂解細胞，10000g離心10分鐘。上清液蛋白(各50μg)於SDS-PAGE樣品緩衝液中煮沸5分鐘，12％膠濃度的SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜，使用鹼性磷酸酶偶聯的二抗與p-IRS-1(1∶1000)、p-PI3激酶p 85α(1∶1000)和p-Akt 1/2(1∶1000)抗體進行免疫測定。抗IRS 1、PI-3K和Akt 1/2的抗體被用來檢測緣於處理的蛋白結構。
(b)棕櫚酸對胰島素的作用誘導了Glut4在3T3L1脂肪細胞中的易位。塗布於蓋玻片上的3T3L1細胞經GFP-Glut4質粒(2μg)轉染48小時，使用lipofectamine試劑。穩定，細胞在存在或缺乏棕櫚酸條件下培養24小時，然後用胰島素培養30分鐘。在缺乏脂肪酸條件下培養經GFP-Glut4轉染的細胞，胰島素作為對照(Con)。培養結束後，使用雷射掃描聚焦顯微鏡檢查GFP-Glut4的位置。
圖3.(a)LPA4的結構和純化。使用Diaion HP-20色譜儀，獲得五個餾分(A-E)，其中餾分E表現出所需要的活性。通過葡聚糖凝膠Sephadex LH 20色譜儀對E進行分級分離，生成3個餾分(F-H)，其中F顯示了對棕櫚酸誘導的受損胰島素活性的改善。餾分F隨後經HPLC純化成單一分子，通過2D NMR和質譜確定為Lupinoside PA432。
(b)在棕櫚酸或棕櫚酸加LPA4或LPA4存在下對脂肪細胞處理24小時，隨後用胰島素培養30分鐘。培養結束前5分鐘加入3H-脫氧葡萄糖。用冰預冷的含有0.3mM 2-對羥苯丙醯基-1，3，5-苯三酚(phloretin)的KRP(克-林二氏磷酸鹽)緩衝液洗滌細胞三次，目的是校正從單純擴散和非特異性的放射性捕獲中得來的葡萄糖吸收數據。用1％NP-40溶解細胞，並在液體閃爍計數器中計算放射活性。
(c)在不含棕櫚酸或棕櫚酸加LPA4或LPA4條件下培養3T3L1脂細胞24小時，隨後用胰島素培養30分鐘。每種條件下都取50μg細胞裂解液進行變性凝膠電泳，轉PVDF膜，與抗P-Akt抗體免疫印跡。50μg細胞裂解液與抗IR3抗體免疫沉澱並與抗p-Tyr抗體免疫印跡。
(d)以圖2b描述的相同方式來確定被處理細胞的Glut4易位。
方法細胞培養和處理3T3L1細胞系從國家細胞科學中心(Pune，印度)獲得，並在37℃、95％O2/5％CO2條件下培養於含有25mM葡萄糖和10％胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)中。本文任何地方提到的融合細胞都經過0.75mM游離脂肪酸(FFAs，棕櫚酸和硬脂酸)處理24小時。
放射性標記胰島素結合溶解的受體製劑對照和游離脂肪酸處理的3T3L1脂細胞首先用0.02M含有0.14MNaCl的磷酸鹽緩衝液(pH-7.4)洗滌三次，然後懸浮於裂解緩衝液(20mMTris-HCl，40mM NaCl，5mM EDTA，5mM碘乙醯胺，pH-8.4)，裂解緩衝液中添加了蛋白酶抑制劑(1μg/ml抑肽酶，1μg/ml抑肽素，1μg/ml亮肽素，2mM苯甲基硫醯氟化物和1μg/ml胰島素抑制劑)。然後，這些細胞於-70℃冷凍-溶解三次，4℃下10000rpm離心15分鐘。收集的沉澱懸浮於裂解緩衝液，超聲處理，再次於4℃下10000rpm離心15-20分鐘。上清液於10mM Tris-HCl(pH-7.4)緩衝液中透析過夜，冷凍乾燥減小溶液體積。然後，將膜製劑與0.1M二碘水楊酸鋰混合至膜蛋白濃度約為5mg/ml，混合物經電動玻璃-聚四氟乙烯樹脂組織勻漿器勻漿處理，35000g離心20分鐘，上清液於20mM、pH-9.4的碳酸氫鈉溶液中透析12小時。在勻速攪拌下在該溶液中加入0.1％TritonX-100(v/v)和25％甘油。經冷凍乾燥來減小溶液體積，於10mM Tris-HCl緩衝液(pH-8.4)中透析。重組人胰島素經125I放射性標記，使用葡聚糖凝膠柱Sephadex-G15分離游離碘中的125I-胰島素，凝膠柱經含有0.14M NaCl和1％(w/v)BSA的0.01M磷酸鹽緩衝液(pH-7.2)平衡處理。125I-胰島素的放射比活性是30.55μCi/μg蛋白。
對照和游離脂肪酸處理的3T3L1脂肪細胞(每次培養25μg)的溶解的胰島素受體製劑，用終體積為500μl的含有125I標記的重組人胰島素2ng的0.02M磷酸緩衝液(含有0.15M NaCl和0.25％BSA(PBS))於4℃下培養過夜。培養結束後，經105g高速離心(Sorvall Ultra-80)沉澱1小時。每個離心管中的沉澱溶解於1X樣品緩衝液(63mMTris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，and 0.025％溴酚藍)，進行非變性SDS-PAGE(4％濃縮膠鋪於6.5％分離膠上)。制幹膠，Kodak X-OMATAR放射自顯影(參見圖1a)。
Scatchard分析為確定125I-胰島素與受體蛋白的最佳結合條件，結合培養以不同的溫度和時間周期進行，同時改變溶解的受體製劑量。結果發現，在pH8.4和4℃下過夜培養產生最大量的放射性標記胰島素結合。受體製劑(15μg蛋白)4℃下於終體積為500μl的緩衝液(0.02M磷酸鹽緩衝液，pH8.4，含有0.15M NaCl和0.25％BSA(PBS))中培養過夜，在不含未標記胰島素(總結合)或含有10000倍過量的未標記胰島素(非特異結合)條件下，具有變化的125I-胰島素濃度(0.18-0.72nmoles/L)。另一組實驗中，受體製劑同時與125I-胰島素和未標記的胰島素(而不含0.08mM未標記的棕櫚酸)進行培養。培養結束後，加入500μl預冷的0.5％聚乙二醇(PEG，分子量6000)來分離游離的和結合的放射活性。樣品經渦旋振蕩充分混合，冰浴10分鐘，冷凍離心機20000g離心15分鐘。吸出上清液，洗滌緩衝液(0.02M磷酸鹽緩衝液，含有0.15M NaCl和0.25％BSA)洗滌沉澱三次。125I-γ計數器檢測最終沉澱的放射活性。通過從總結合中減去非特異性結合來計算特異性結合。然後用Scatchard分析數據，來確定在含有或不含棕櫚酸條件下胰島素受體結合的親和力和結合量(參見圖1b)。
分子模擬通過使用InsightII 98.0(Accelrys Inc.，San Diego，CA，USA)，在IGF-1R的X射線衍射結構之上(PDBlIGR.ENT，具有59％的胺基酸一致性)建立了胰島素受體的同源模擬。在Silicon Graphics OCTANE工作站上，通過InsightII的DISCOVER模型，使用cff91力場進行能量最小化和分子動力。通過最陡下降法(steepest descent)和共軛梯度法(conjugate gradient)(每次100步)的結合運用，以0.001kcal/mol的收斂標準完成了能量最小化；重複這些步驟，直至得到滿意的結構參數。通過用於100步平衡(100 steps of equilibration)和1000步動力(1000steps of dynamics)的千萬億分之一秒的時間步長(time step)來進行分子動力模擬。在運行最小化和動力對選擇部分進行調整時，對分子的其他部分進行距離限制(參見圖1c)。
免疫沉澱200μg對照和游離脂肪酸處理的細胞裂解物(於裂解緩衝液[1％NP-40，20mM HEPES(pH 7.4)，2mM EDTA，100mM NaF，10mM焦磷酸鈉，1mM原釩酸鈉，1μg/ml亮肽素，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml抑肽素和1mM PMSF]冰浴超聲處理10分鐘)與2μg胰島素受體β抗體於4℃下培養過夜。每管加入50μl蛋白A-瓊脂糖，4℃下培養2小時。4℃下10000g離心2分鐘，沉澱加入500μl含0.1％CHAPS的PBS溶液，懸浮後於4℃下10000g離心2分鐘。沉澱經充分洗滌後進行SDS-PAGE，然後用抗磷酸酪氨酸抗體進行Western雜交(抗鼠；1∶1000)(參見圖1d)。
電泳和免疫雜交對照和處理的細胞裂解物(60g)在10％SDS-PAGE上分離，4℃、90V條件下於轉移緩衝液(25mM Tris，193mm甘氨酸，20％甲醇，pH8.5)中轉PVDF膜(Millipore，Bedford，MA 01730)1.5小時。用含有5％脫脂奶粉的TBST緩衝液(20mM Tris鹼，137mM NaCl，1mM HCl，0.1％吐溫20)封閉膜，與抗p-IRS(抗羊；1∶1000)、p-PI3K(抗羊；1∶1000)和p-Akt(抗兔；1∶2000)培養過夜。用聯有二抗的鹼性磷酸酶檢測免疫反應條帶(參見圖2a)。
轉染和Glut4易位將3T3L1細胞塗布於含有coverslips的60mm平皿中，在添加了10％(v/v)FBS和100μg/ml青黴素/鏈黴素的DMEM中通氣(空氣/CO2(19∶1))培養。24小時後，用不含FBS和抗生素的DMEM洗滌細胞。依照生產商(Life Technologies)的說明書，通過Lipofectamine試劑，用GFP-Glut4(2μg)的質粒DNA轉染2×105個細胞。轉染48小時後，細胞經含有0.75mM棕櫚酸處理或不含棕櫚酸的處理24小時，然後在不含或含有100nM的胰島素條件下培養30分鐘。Coverslips上的細胞被固定於多聚甲醛(3.5％)中並塗布於載玻片。Coverslips於雷射掃描聚焦顯微鏡下檢查GFP-Glut4的易位(Leica Corp.，Rockleigh，NJ)(參見圖2b)。
從葛根中提取和分離lupinoside PA4葛根的根部(1kg，切碎並用甲醇(3x1.5L)提取)。提取液經真空乾燥，得到90g殘渣，估測其生物活性。甲醇提取液被分入乙酸乙酯和水層。水層經正丁醇進一步萃取。真空去除乙酸乙酯、正丁醇和水溶解部分的溶劑，分別生成2.5g、12g和64g餾分。檢測每一餾分的生物活性，發現正丁醇餾分中存在活性。將正丁醇餾分上Diaion HP-20色譜儀，以水和甲醇為洗脫劑。甲醇洗脫劑經蒸發至幹品(2.4g)，進一步上Sephadex LH-20色譜儀，使用甲醇-水(1∶1)和甲醇為洗脫劑。甲醇-水餾分經減壓蒸發生成表現出生物活性的固體(1.4g)。該固體經製備型HPLC(μ-Bondapak C-18反向柱，甲醇-1％含水(1％)乙酸(7∶3)，流速12mm/min，紫外檢測器，檢測波長210nm)，得到單一化合物，確認為lupinoside PA4(L PA4)32(0.28g)，經1D，2D NMR和Q-TOF-MS以及其他化學反應確定了其化學結構(參見圖3a)。
LPA4對棕櫚酸誘導的葡萄糖吸收抑制的治療效果3T3L1脂細胞在不含和含有LPA4(2011g/ml)和棕櫚酸(0.75mM)的條件下被處理24小時，接著用含有100nM胰島素並添加了0.2％牛血清蛋白的Kreb′s Ringer Phosphate(KRP)緩衝液(12.5mM HEPES，pH7.4，120mM NaCl，6mM KCl，1.2mM MgSO4，1mM CaCl2，0.4mMNaH2PO4，0.6mM Na2HPO4)培養30分鐘，在培養結束前5分鐘於各培養液中加入3H-2-DOG(0.4nmoles)。3T3L1細胞經冰預冷的含有0.3mM根皮素的KRP緩衝液洗滌三次，來校正從簡單擴散和非特異性放射性捕獲而獲得的葡萄糖吸收數據。細胞溶解於1％NP-40，用液體閃爍計數器檢測(Packard，Tricarb 2100 TR)[3H]-脫氧葡萄糖(參見圖3b)。
在不含或含有LPA4和棕櫚酸條件下，採用同樣方法培養的3T3L1細胞經超聲裂解，如上述方法檢測裂解液中p-IR和p-Akt(參見圖3c)。
在另一組實驗中，細胞被上述GFP-Glut4轉染後，經不含或含有LPA4和棕櫚酸條件下培養24小時。然後，細胞經100nM胰島素培養，聚焦顯微鏡下監測Glut4易位(參見圖3d)。
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權利要求
1.一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，所述方法包括對受試者給入藥用有效量的植物葛根提取物或所述提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，任選的與添加劑一起給藥。
2.權利要求1所述方法，其中所述受試者是動物。
3.權利要求1所述方法，其中所述受試者是人。
4.權利要求1所述方法，其中所述提取物是從所述植物根中獲得的。
5.權利要求1所述方法，其中所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉、明膠糊的營養素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
6.權利要求1所述方法，其中所述餾分的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
7.權利要求1所述方法，其中所述Lupinoside的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
8.權利要求1所述方法，其中給藥途徑選自口服、靜脈注射、肌肉注射和皮下給藥。
9.用於預防和/或治療2型糖尿病的藥物組合物，所述組合物包括植物葛根提取物或所述提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，和一種或多種添加劑。
10.權利要求9所述藥物組合物，其中所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉、明膠糊的營養素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
11.權利要求9所述藥物組合物，其中所述提取物是從所述植物的根中獲得的。
12.權利要求9所述藥物組合物，其中所述餾分的濃度範圍為1-40mg/kg體重。
13.權利要求9所述藥物組合物，其中所述Lupinoside的濃度範圍為1-40mg/kg體重。
14.權利要求9所述藥物組合物，其中所述組合物的劑型選自膠囊、糖漿、濃縮劑、粉末和顆粒。
15.權利要求9所述藥物組合物，其中所述提取物是水提取物。
16.一種增強Glut4磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強受試者體內信號傳導途徑中胰島素信號的方法，所述方法包括為受試者給入藥用有效量的植物葛根提取物或所述提取物的正丁醇餾分或Lupinoside A4(LPA4)，任選的與添加劑一起給藥。
17.權利要求16所述方法，其中受試者是動物。
18.權利要求16所述方法，其中所述受試者是人。
19.權利要求16所述方法，其中所述提取物是從所述植物根中獲得的。
20.權利要求16所述方法，其中所述添加劑選自諸如蛋白質、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、澱粉、明膠糊的營養素，可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑和溶劑。
21.權利要求16所述方法，其中所述餾分的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
22.權利要求16所述方法，其中所述Lupinoside的給藥濃度為1-40mg/kg體重。
23.權利要求16所述方法，該方法幫助預防/治療2型糖尿病。
24.權利要求16所述方法，該方法顯示細胞對葡萄糖吸收的提高。
25.權利要求16所述方法，該方法對細胞是非毒性的。
26.權利要求16所述方法，其中所述易位是從胰島素響應細胞的細胞質到細胞膜。
27.權利要求16所述方法，其中所述Lupinoside A4(LP4)預防棕櫚酸誘導的胰島素信號傳導缺陷。
28.權利要求16所述方法，其中所述Lupinoside A4(LP4)使胰島素能夠刺激IRβ和Akt磷酸化。
29.一種簡單、廉價的獲得植物葛根提取物和隨後選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA4)用於預防和/或治療2型糖尿病的方法，所述方法包括如下步驟a)將植物部分切成小塊，b)用甲醇和水提取切後的小塊，c)將甲醇和水提取物在乙酸乙酯和水之間分層，d)用正丁醇進一步萃取水層來獲得丁醇餾分，和e)用水和甲醇作為洗脫液將正丁醇餾分進行層析來獲取Lupinoside PA4(LPA4)。
30.權利要求29所述方法，其中所述植物部分是根。
31.權利要求29所述方法，其中所述溶劑選自甲醇和水。
32.權利要求29所述方法，其中水和甲醇的比例是1∶1。
33.權利要求29所述方法，其中所述色譜分離是柱層析。
全文摘要
本發明涉及一種預防和/或治療2型糖尿病的方法，同時，本發明涉及一種增強葡萄糖轉運蛋白Glut4的磷酸化和Glut4易位到靶細胞膜來增強信號傳導途徑中胰島素信號的方法；另外，本發明涉及一種簡單、廉價的方法來獲得提取物並選擇性獲取其活性正丁醇餾分和活性分子Lupinoside PA(LPA
文檔編號A61K36/488GK1997379SQ200480042340
公開日2007年7月11日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年1月9日
發明者S·巴哈塔查亞, D·戴伊, S·K·曼達爾, M·慕克吉, B·C·帕爾, T·比斯瓦, M·達塔, S·S·羅伊, A·班底奧帕迪亞伊, S·班多帕迪亞伊, A·庫納爾, B·B·吉芮 申請人:科學與工業研究委員會