中藥八味補白片的檢測方法
2023-09-21 17:16:50
中藥八味補白片的檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種治療白癜風的中藥八味補白片的檢測方法，包括以下步驟：(一)中藥八味補白片中的補骨脂、黃芪和丹參的鑑別方法：(1)中藥八味補白片中的補骨脂顯微鑑別；(2)中藥八味補白片中黃芪的薄層鑑別；(3)中藥八味補白片中丹參的薄層鑑別；(二)中藥八味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素的高效液相色譜撿測，含量以補骨脂素和異補骨脂素總量計算，不低於0.30mg。本發明方法穩定可靠，專一性和科學性強，可以有效監測中藥八味補白片的質量，有較大的應用價值。
【專利說明】中藥八味補白片的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥複方製劑，具體涉及治療白癜風的中藥八味補白片的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 白癜風是一種後天性色素減退性皮膚病，最新研究證實，由於白癜風患者紫外線 防禦能力弱，皮膚癌的發病率比正常人要高很多，同時還可誘發多種疾病，中醫認為，白癜 風主要因先天稟賦不足，驚恐傷腎，鬱怒傷肝，日久耗傷陰血，使肝腎精血虧虛，復外感風 邪，阻滯經脈，使局部氣血瘀滯，致腠理氣血失和，肌膚不得濡養所致。現代醫學有關白癜風 病因及發病機制學說眾多，有自身免疫學說、黑素細胞自身破壞學說、神經化學因子學說、 黑素細胞生長因子缺乏學說、遺傳因素等，其中，黑素細胞生成缺乏和自身破壞學說佔主導 地位。
[0003]中藥八味補白片方由黃芪、蒺藜、川芎、當歸、丹參、補骨脂、紅花、香附8味中藥材 組成。其中當歸、黃芪柔肝養血，健脾益氣，補後天之本以充氣血生化之源；補骨脂益腎填 精，"乙癸同源，肝腎同治"；川；、紅花、丹參行氣活血；白蒺藜、香附疏風祛邪以通絡，共奏 調和氣血，活血化瘀之效。諸藥合用可以調和氣血，活血化瘀，補益肝腎，祛風散邪。
[0004] 由於複方中藥八味補白片有八味中藥，成分複雜多樣，在中藥產品的檢測中常常 都會帶來相互幹擾，因此，對判斷該藥中藥物在製備成產品後，判斷產品的工藝是否合理， 產品中有效成分是否富集，最終產品的質量是否穩定等，建立一個合理的、體現產品質量和 檢測水平的質量標準是十分關鍵的技術。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題在於研究設計中藥八味補白片的檢測方法，用現代的 色譜和顯微等分析技術，選擇合理的分離、提取的方法及手段，有效控制其活性成分作為指 標，新建立控制產品質量的標準。
[0006] 本發明採用薄層色譜對此中藥製劑中的八味藥材黃芪、丹參、當歸、鹽補骨脂、炒 蒺藜、紅花等進行了全面的薄層色譜（TLC)定性研究，對君藥補骨脂進行了含量測定研究， 其中黃芪、丹參、鹽補骨脂通過本複方產品的檢測方法優選，獲得了較滿意的薄層色譜結 果和補骨脂的定量測定方法。現代醫學認為，丹參、當歸中含有有機酸類及其他多種微量 元素，因此具有活血補血的作用；黃芪中含有的主要化學成分為黃酮類、皂苷類和多糖等， 具有增強機體免疫功能和應激力的作用。鹽補骨脂含有呋喃香豆素類物質，有提高皮膚 對紫外線敏感作用，刺激黑色素細胞的形成，對酪氨酸酶的活性也有較強的激活作用。業 已證實，酪氨酸酶的活性直接與黑素含量有關，上調酪氨酸酶的活性，加速黑素生成的藥 物可提高白癜風的治療效果。呋喃香豆素（?111'〇〇〇111]1&1'；[116)為香豆素類的6,7或7,8位 與呋喃基併合而成的化合物的總稱。補骨脂素（Psoralene)分子式為CnH603、異補骨脂素 (Angelicin)，分子式為CnH603，為呋喃香豆素主要代表物質。所以本發明選定補骨脂素和 異補骨脂素二種活性成分為代表，作為指標性成分，控制產品的質量。本發明提供中藥八味 補白片中補骨脂、黃芪、丹參的鑑別方法及補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素含量測定的檢 測方法。
[0007] 本發明提供了一種中藥八味補白片的檢測方法，該方法包括以下步驟：
[0008]( -）中藥八味補白片中的補骨脂、黃芪和丹參的鑑別方法：
[0009] (1)中藥八味補白片中的補骨脂顯微鑑別，呈顯微特徵圖，見圖1
[0010] (2)中藥八味補白片中黃芪的薄層鑑別，呈特徵色譜圖，見圖2
[0011] ⑶中藥八味補白片中丹參的薄層鑑別，呈特徵色譜圖，見圖3
[0012] (二）中藥八味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素的高效液相色譜含量檢 測：每片含量以補骨脂素（CnH603)和異補骨脂素（CnH603)總量計算，不低於0. 30mg，見圖5
[0013] 具體地，本發明中藥八味補白片中的補骨脂、黃芪和丹參的鑑別方法包括以下步 驟：
[0014] (1)本發明採用薄層層析法鑑別八味補白片中的補骨脂
[0015] 取八味補白片適量，研細，稱取2g，加乙酸乙酯或甲醇，超聲或熱回流，濾過，濾液 蒸乾，殘渣加乙酸乙酯或甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取補骨脂對照藥材，同法製成對 照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部VIB)試驗，吸取上述對照藥材溶液、 供試品溶液，分別點於同一矽膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4:1)或石油醚-乙酸乙 酯（4:1)為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈（365nm)下或噴以10%的氫氧化鈉甲醇溶 液置紫外光燈（365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液相應位置上，顯相同顏色 斑點。
[0016] (2)採用薄層層析法鑑別八味補白片中的黃芪
[0017] 因黃芪為本方中的主藥之一，其的主要活性成分為黃芪甲苷，本發明選擇黃芪甲 苷作為對照品，鑑別本產品的質量。
[0018] 取八味補白片適量，研細，稱取2g，加水或乙醇適量，置水浴上加熱回流或超聲，放 冷，取上清液，用乙醚振搖，洗滌，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇振搖提取數次，合併正 丁醇提取液，用等量的氨試液洗滌，再用等量的正丁醇飽和的水洗滌數次，正丁醇液蒸乾， 殘渣加甲醇lml使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材適量，同法制 成對照藥材溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇適量製成，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述三種溶液適量，分別點於同一矽膠G薄 層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8:2:1)或（三氯甲烷-甲醇-水（12:5:3)為展開劑，展 開，取出，晾乾，直接加熱或噴以10%的硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點清晰。供試品色譜 中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點及螢光主斑點。
[0019] (3)採用薄層層析法鑑別八味補白片中的丹參
[0020] 取八味補白片適量，研細，稱取2g，加水或乙醇適量，置水浴上加熱回流或超聲溶 解，加鹽酸溶液適量，混勻，離心，取上清液，加等量乙醚提取2次，合併提取液，離心分層， 吸取乙醚提取液，揮幹，用無水乙醇適量使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材適量， 同法製成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部VIB)試驗，吸取上述兩 種溶液適量，分別點於同一矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-苯-甲酸（6 :5 :3 :1) 或三氯甲烷-丙酮-甲酸（8:2:1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以10%的三氯化鐵乙醇溶 液，105°C加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材溶液相應位置上，顯相同的顏色斑 點。
[0021] (二）採用高效液相色譜法定量檢測八味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂 素含量。
[0022] 由於補骨脂中的主要活性成分為補骨脂素（CnH603)和異補骨脂素（CnH603)，因 此，選擇補骨脂素和異補骨脂素作為定量檢測補骨脂的標準品。
[0023]補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素含量測定：
[0024] 色譜條件與系統適用性：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水（50:50) 或（55 :45)為流動相；檢測波長為246nm。理論板數按補骨脂峰計算應不低於3000。
[0025] 對照品溶液的製備：取在減壓乾燥（真空度_0.IMpa，溫度60°C) 12-24小時的補 骨脂素和異補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每lml各含15-20yg的溶液，即 得。
[0026] 供試品溶液的製備：取八味補白片20片，碾細，精密稱定2. 0g，置索氏提取器中或 圓底燒瓶中，加甲醇或乙醇80-120ml，加熱回流2-5小時；或浸泡過夜，再加熱回流2-5小 時，放冷，轉移至l〇〇ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得供試品。
[0027] 測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10-20yl，注入液相色譜儀， 測定。
[0028] 每片八味補白片含補骨脂，以補骨脂素（CnH603)和異補骨脂素（CnH603)總量計 算，不低於〇? 30mg。
[0029] 其優選的供試品溶液的製備方法是：取八味補白片20片，碾細，精密稱定2. 0g，置 索氏提取器中，加甲醇80ml，加熱回流4小時；放冷，轉移至100ml容量瓶中，加甲醇定容至 刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得供試品。
[0030] 在中藥進入標準化時代，產品的質量是產品的生命，擁有產品的標準則是擁有關 鍵技術。本發明提供了八味補白片產品的質量標準的檢測方法，經過科學的方法學研究，優 選出的方法穩定可靠，專一性和科學性強，可以有效檢測複方中藥八味補白片的相關成分， 為使用者提供有保證質量的產品，有較大的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1、實施例1八味補白片中補骨脂的薄層色譜圖，圖中：從左至右，斑點順序， 1-陰性空白（缺鹽補骨脂）2-鹽補骨脂陽性單味藥材3-4-5-八味補白片樣品；
[0032] 圖2、實施例1八味補白片中黃芪的薄層色譜圖，圖中：從左至右，斑點順序，1-陰 性空白（缺黃芪）2_黃芪甲苷3-黃芪對照藥材4-5-6-八味補白片樣品；左圖為日光下視 檢，右圖為紫外燈365nm下檢視；
[0033] 圖3、實施例1八味補白片中丹參的薄層色譜圖，圖中：從左至右，斑點順序，1-陰 性空白（缺丹參）2_丹參對照藥材3-4-5-八味補白片樣品；
[0034] 圖4、實施例4補骨脂素（前）、異補骨脂素（後）對照品的高效液相色譜圖；
[0035] 圖5、實施例4八味補白片樣品中補骨脂-補骨脂素、異補骨脂素的高效液相色譜 圖；
[0036] 圖6、實施例4空白樣品（缺補骨脂）中的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0037] 以下實施例使用的八味補白片產品由上海百歲行藥業有限公司生產。
[0038] 實施例1、八味補白片檢測試驗
[0039] (1)薄層層析色譜法中補骨脂鑑別：取八味補白片10片，研細，稱取2g，加乙酸乙 酯20ml，超聲處理15分鐘，濾過，濾液蒸乾，殘渣加乙酸乙酯lml使溶解，作為供試品溶液。 另取補骨脂對照藥材（中國藥品生物檢定所）〇.5g，同法製成對照藥材溶液。照薄層色譜 法（中國藥典2010年版一部VIB)試驗，吸取上述對照藥材溶液5yl，供試品10yl，分別 點於同一矽膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（4 :1V/V)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以 10%的氫氧化鈉甲醇溶液置紫外光燈（365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液 相應位置上，顯相同顏色斑點。八味補白片中的補骨脂顯微鑑別，呈顯微特徵圖，見圖1。
[0040] (2)取本品10片，研細，稱取2g，加水50ml，置水浴上加熱回流30分鐘，放冷，離 心，取上清液，用乙醚振搖提取2次，每次50ml，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇振搖提取 2次，每次50ml，合併正丁醇提取液，用等量的氨試液洗滌，再用等量的正丁醇飽和的水洗 滌2次，正丁醇液蒸乾，殘渣加甲醇lml使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取黃芪 對照藥材（中國藥品生物檢定所lg，同法製成對照藥材溶液。取黃芪甲苷對照品（中國藥 品生物檢定所），加甲醇製成每lml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中 國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述三種溶液各5yl，分別點於同一矽膠G薄 層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8 :2 :1V/V)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以10%的硫酸 乙醇溶液，l〇5°C加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同 顏色的主斑點及螢光主斑點。八味補白片中黃芪的薄層鑑別，呈特徵色譜圖，見圖2。
[0041] (3)取本品10片，研細，稱取2g，用20ml水，超聲處理30分鐘溶解，加0?lmol/1 鹽酸溶液l〇ml，混勻，離心10分鐘，取上清液，加等量乙醚提取2次，合併提取液，離心分層， 吸取乙醚提取液，揮幹，用無水乙醇lml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材（中 國藥品生物檢定所）0.5g，同法製成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一 部VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各5yl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三 氯甲烷-苯-甲酸（6 :5 :3 :1V/V)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以10%的三氯化鐵乙醇溶 液，105°C加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材溶液相應位置上，顯相同的顏色斑 點。八味補白片中丹參的薄層鑑別，呈特徵色譜圖，見圖3。
[0042] (4)補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素含量檢測：
[0043] 色譜條件與系統適用性：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水（50:50) 為流動相；檢測波長為246nm。理論板數按補骨脂峰計算應不低於3000。
[0044] 對照品溶液的製備：取在減壓乾燥12小時的補骨脂素（中國藥品生物檢定所）和 異補骨脂素（中國藥品生物檢定所）對照品，精密稱定，加甲醇製成每lml各含15yg的溶 液，即得。
[0045] 供試品溶液的製備：取八味止白片20粒，碾細，稱2. 5g，精密稱定，置索氏提取器 中，加甲醇80ml，浸泡過夜，加熱回流3小時，放冷，轉移至100ml容量瓶中，用少量甲醇清洗 索氏提取器併入容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。
[0046] 測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10U1，注入液相色譜儀，測 定，即得。
[0047] 八味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素的高效液相色譜測定含量以補骨 脂素（CnH603)和異補骨脂素（CnH603)總量計算，不低於0. 30mg。
[0048] 八味止白片每片含補骨脂，以補骨脂素（CnH603)和異補骨脂素（CnH603)總量計算 取八味止白片樣品產品（批號：xll0401、xll0402、xll0403)按照補骨脂質量標準草案對八 味止白片含量測定，結果見表8。
[0049] 表1.三批樣品含量測定結果
[0050]
【權利要求】
1. 中藥八味補白片的檢測方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟： (一） 中藥八味補白片中的補骨脂、黃芪和丹參的鑑別方法： (1) 中藥八味補白片中的補骨脂顯微鑑別； (2) 中藥八味補白片中黃芪的薄層鑑別； (3) 中藥八味補白片中丹參的薄層鑑別； (二） 中藥八味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素的高效液相色譜撿測，含量 以補骨脂素和異補骨脂素總量計算，不低於〇. 30mg。
2. 根據權利要求1所述的中藥八味補白片的檢測方法，其特徵在於，步驟（一）（1)中 藥八味補白片中的補骨脂顯微鑑別方法為： 取八味補白片，研細，取2g加乙酸乙酯或甲醇，超聲或熱回流，濾過，濾液蒸乾，殘渣加 乙酸乙酯或甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取補骨脂對照藥材，同法製成對照藥材溶液； 照薄層色譜法試驗，吸取上述對照藥材溶液，供試品，分別點於同一矽膠G薄層板上，以正 己烷-乙酸乙酯4 :1V/V或石油醚-乙酸乙酯4:1V/V為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光 燈365nm下或噴以10%的氫氧化鈉甲醇溶液置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與 對照藥材溶液相應位置上，顯相同顏色斑點。
3. 根據權利要求1所述的中藥八味補白片的檢測方法，其特徵在於，步驟（一）（2)中 藥八味補白片中黃芪的薄層鑑別方法為： 取八味補白片，研細，取2g加水或乙醇適量，置水浴上加熱回流或超聲，放冷，取上清 液，用乙醚振搖，洗滌，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇振搖提數次，合併正丁醇提取液， 用等量的氨試液洗滌，再用等量的正丁醇飽和的水洗滌數次，正丁醇液蒸乾，殘渣加甲醇 lml使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液；另取黃芪對照藥材適量，同法製成對照藥材 溶液；取黃芪甲苷對照品，加甲醇適量製成，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上 述三種溶液適量，分別點於同一矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水8 :2 :1V/V或三氯 甲烷-甲醇-水12:5: 3V/V為展開劑，展開，取出，晾乾，直接加熱或噴以10 %的硫酸乙醇溶 液，105°C加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的 主斑點及螢光主斑點。
4. 根據權利要求1所述的中藥八味補白片的檢測方法，其特徵在於，步驟（一）（3)中 藥八味補白片中丹參的薄層鑑別方法為： 取八味補白片研細，2g用水或乙醇醇適量，置水浴上加熱回流或超聲超聲，溶解，力口 鹽酸溶液適量，混勻，離心，取上清液，加等量乙醚提取2次，合併提取液，離心分層，吸取乙 醚提取液，揮幹，用無水乙醇適量使溶解，作為供試品溶液；另取丹參對照藥材適量，同法制 成對照藥材溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液適量，分別點於同一矽膠G薄層板 上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-苯-甲酸6 :5 :3 :1V/V或三氯甲烷-丙酮-甲酸8:2:1V/V為 展開劑，展開，取出，晾乾，噴以10%的三氯化鐵乙醇溶液，l〇5°C加熱至斑點清晰，供試品色 譜中，在與對照藥材溶液相應位置上，顯相同的顏色斑點。
5. 根據權利要求1所述的中藥八味補白片的檢測方法，其特徵在於，步驟（二）中藥八 味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素的高效液相色譜測定方法包括下列步驟： 色譜條件與系統適用性：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水50:50V/V或 55 :45V/V為流動相；檢測波長為246nm，理論塔板數按補骨脂峰計算應不低於3000 ; 對照品溶液的製備：取在減壓乾燥（真空度-o. IMpa，溫度60°C ) 12-24小時的補骨脂 素和異補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每lml各含15-20 y g的溶液，即得； 供試品溶液的製備：取八味補白片20片，碾細，精密稱定2. 0g，置索氏提取器中或圓 底燒瓶，加甲醇或乙醇80-120ml，加熱回流2-5小時；或浸泡過夜，再加熱回流2-4小時，放 冷，轉移至l〇〇ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得供試品； 測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10-20 Ul，注入液相色譜儀，撿測測 定。
6.根據權利要求5所述的中藥八味補白片的檢測方法，其特徵在於，步驟（二）中藥八 味補白片中補骨脂的補骨脂素和異補骨脂素的高效液相色譜撿測，含量以補骨脂素和異補 骨脂素總量計算，不低於〇. 30mg。
【文檔編號】G01N30/02GK104459011SQ201410821965
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】朱建民, 楊莉婭, 毛士龍, 王拂塵, 張蓉蓉, 汪碩聞, 邵寶平, 李倩 申請人:上海市徐匯區中心醫院