一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
2023-09-10 02:45:05 1
一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因及其編碼蛋白與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種萊茵衣藻三醯甘油代謝調控基因及其編碼蛋白與應用，所述調控基因為下列核苷酸序列中的任意一種：1）序列表中SEQIDNO:1DNA序列；2）序列表中SEQIDNO:2蛋白質序列的多核苷酸；3）與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。該編碼蛋白為具有序列表中SEQIDNO:2胺基酸殘基序列的蛋白質。用該調控基因來調控萊茵衣藻的中性脂含量，或者用該調控基因來培育高油脂含量藻株。對其研究發現該基因過量表達可以提高萊茵衣藻中性油脂含量，而通過RNAi幹涉將該基因敲除可顯著減低萊茵衣藻中性脂含量。
【專利說明】一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因及其編碼蛋白與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種能改變微藻中性脂含量的基因，具體是一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因及其編碼蛋白與應用。
【背景技術】
[0002]生物柴油屬於可再生能源，是優質的石油柴油代用品。許多微藻具備大量生產中性脂(三醯甘油)的能力，是很好的生物柴油來源，但目前人類對於多數微藻的生長方式、代謝途徑等相關的研究並不多。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在於提供一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因及其編碼蛋白與應用。
[0004]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因，該調控基因為下列核苷酸序列中的任意一
種:
1)序列表中SEQID NO:1 DNA序列；
2)序列表中SEQID NO:2蛋白質序列的多核苷酸；` 3)與序列表中SEQID NO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
[0005]該調控基因來源於萊茵衣藻，命名為CrUBC2。
[0006]所述的萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因的編碼蛋白，該編碼蛋白為具有序列表中SEQ ID N0:2胺基酸殘基序列的蛋白質。
[0007]該編碼蛋白在phytozome萊茵衣藻資料庫名稱為Cre05.g247600,是由139個胺基酸殘基組成的蛋白質。
[0008]所述的編碼蛋白的衍生蛋白質，其特徵在於，將序列表中SEQ ID NO: 2的胺基酸殘基序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO: 2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白質。
[0009]所述的萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因的應用，用該調控基因來調控萊茵衣藻的中性脂含量，或者用該調控基因來培育高油脂含量藻株。
[0010]採用植物表達的載體，將該調控基因轉入萊茵衣藻，萊茵衣藻內的中性脂含量升高；採用RNAi幹涉的方法，將調控基因片段轉入萊茵衣藻，萊茵衣藻內的中性脂含量降低。所述中性脂包括三醯甘油。
[0011]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明所提供的能提高藻類三醯甘油含量的基因名稱為 CrUBC2 (Chlamydomonas reinhardtii ubi quit in-conjugatingenzyme E2),該基因在phytozome萊茵衣藻資料庫的名稱為Cre05.g247600,位於chromosome_5:876169-878182 區域，含 5 個外顯子。編碼 ubiquitin-conjugating enzymeE2，是根據phytozome萊茵衣藻資料庫上公布的CrUBC2基因為模板設計特異性引物，擴增cDNA獲得全長序列，根據該鹼基序列分析，推測編碼CrUBC2蛋白的序列。對其研究發現該基因過量表達可以提高萊茵衣藻中性油脂含量，而通過RNAi幹涉將該基因敲除可顯著減低萊茵衣藻中性脂含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為CrUBC2的RT-PCR擴增結果(I:DL2000 DNA分子量標準；M:CrUBC2擴增
結果);
圖2為CrUBC2過量表達轉基因藻株生物量的變化情況；
圖3為CrUBC2過量表達轉基因藻株中性脂含量的變化情況；
圖4a為pAMBIA1302空載體轉化子第六天時尼羅紅染色前螢光觀察圖；
圖4b為pAMBIA1302空載體轉化子第六天時尼羅紅染色後螢光觀察圖；
圖4c為pCAMBIA-CrUBC2基因藻株第六天時尼羅紅染色前螢光觀察圖；
圖4d為pCAMBIA-CrUBC2基因藻株第六天時尼羅紅染色後螢光觀察圖；
圖5為pAMBIA1302空載體轉化子、CC425和pCAMBIA_CrUBC2基因藻株RNA表達分析
圖；
圖6為CrUBC2 RNAi幹涉轉基因藻株的生物量含量變化圖；
圖7為CrUBC2 RNAi幹涉轉基因藻株的油脂含量變化圖；
圖8a為Maa7/XIR空載體轉化子尼羅紅染色前螢光觀察圖；
圖8b為Maa7/XIR空載體轉化子尼羅紅染色後螢光觀察圖；
圖8c為CrUBC2 RNAi幹涉轉基因藻株尼羅紅染色前螢光觀察圖；
圖8d為CrUBC2 RNAi幹涉轉基因藻株尼羅紅染色後螢光觀察圖；
圖9為Maa7/XIR空載體轉化子、CC425及CrUBC2 RNAi幹涉轉基因藻株RNA表達分析圖。
【具體實施方式】
[0013]以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。Marker均購自大連寶生物公司。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。
[0014]實施例1
CrUBC2的克隆，包括以下步驟:
1)萊茵衣藻總RNA的提取
萊茵衣藻(Ghlamydomorms reinhardtii )藻株CC425,培養於24°C光照培養箱，IOOMmol IrT2SecT1白光,全光照條件下,待生長至對數生長期,取藻液50mL, 10000 r/min離心Imin收集藻體，液氮速凍後碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取總RNA ；
2)引物設計根據phytozome萊茵衣藻資料庫中公布的CrUBC2基因為模板設計特異性引物,設計如下特異性引物:
【權利要求】
1.一種萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因，其特徵在於，該調控基因為下列核苷酸序列中的任意一種: 序列表中SEQ ID NO:1 DNA序列； 序列表中SEQ ID NO:2蛋白質序列的多核苷酸； 與序列表中SEQ ID NO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因，其特徵在於，該調控基因來源於萊茵衣藻，命名為CrUBC2。
3.—種如權利要求1或2所述的萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因的編碼蛋白，其特徵在於，該編碼蛋白為具有序列表中SEQ ID NO: 2氣基酸殘基序列的蛋白質。
4.根據權利要求3所述的編碼蛋白，其特徵在於,該編碼蛋白在phytozome萊茵衣藻資料庫名稱為Cre05.g247600，是由139個胺基酸殘基組成的蛋白質。
5.根據權利要求3所述的編碼蛋白的衍生蛋白質，其特徵在於，將序列表中SEQIDNO:2的胺基酸殘基序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ IDN0:2的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白質。
6.一種如權利要求1-2任一所述的萊茵衣藻中改變油脂含量的調控基因的應用，其特徵在於，用該調控基因來調控萊茵衣藻的中性脂含量，或者用該調控基因來培育高油脂含量藻株。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，採用植物表達的載體，將該調控基因轉入萊茵衣藻，萊茵 衣藻內的中性脂含量升高；採用RNAi幹涉的方法，將調控基因片段轉入萊茵衣藻，萊茵衣藻內的中性脂含量降低。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述中性脂包括三醯甘油。
【文檔編號】C12N15/52GK103849633SQ201410112849
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】鄧曉東, 費小雯, 李興涵 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所