無蛋白製劑的製作方法
2023-09-14 20:24:50
專利名稱：無蛋白製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有粒細胞集落刺激因子的製劑，並且特別涉及通過防止因在容器壁上吸附、聚集、聚合、氧化等所致的活性組分損失和失活來穩定化的含粒細胞集落刺激因子製劑。
現有技術粒細胞集落刺激因子(此後也稱作「G-CSF」)是分子量約為20，000並作用於嗜神經(neurophil)前體細胞促進其增殖和分化至成熟的糖蛋白。
通過培養獲自口腔基底癌患者腫瘤細胞的細胞系，我們提純出高純度的人G-CSF，由此成功克隆了人G-CSF基因，而且目前可以通過遺傳工程在動物細胞中大量生產重組人G-GSF。我們還成功地將這種純化G-CSF轉化為製劑產品，在市場上它作為抗感染劑供應(日本特許公告號2116515)。
G-CSF以極小的量應用，即含有0．1-1000μg(優選5-500μg)G-CSF的製劑每周向每個成年人給藥1至7次。然而，這種G-CSF被吸附在安瓿、注射器等的側壁上。G-CSF對於外部因素如溫度、溼度、氧、紫外線等不穩定且敏感以致發生包括聚集、聚合或氧化在內的物理或化學變化，導致活性嚴重損失。
因此，已提出多種製劑設計以為市場提供穩定的G-CSF製劑。例如，已推薦一種含有選自醋酸、乳酸、檸檬酸、馬來酸、磷酸及其鹽或精氨酸及其鹽的緩衝劑的製劑(JPA號505610／96)。也有建議含有1-10，000重量份表面活性劑／重量份G-CSF的G-CSF製劑(JPA號146826／88)。後一文獻描述了表面活性劑的水平，特別是其下限極其嚴格以防止G-CSF的損失並且在含G-CSF液體製劑中實現穩定化作用。
本發明的一個目的是提供一種G-CSF製劑，該製劑能夠減小製備方法的複雜性並且該製劑對於長時間儲存更加穩定。
發明概述作為達到上述目進行的縝密研究的成果，我們發現即使當製劑只含有極少量表面活性劑作為穩定劑時也可以獲得穩定的G-CSF製劑，基於該發現我們完成了本發明。
因此，本發明提供一種穩定的含有粒細胞集落刺激因子和以每1重量份粒細胞集落刺激因子計0．0001-1重量份的至少一種藥學上可接受表面活性劑並且pH等於或小於7的含粒細胞集落刺激因子製劑。
在此所用的「穩定化」是指在25℃下保存6個月後剩餘的G-CSF為95％或更多，或在40℃下保存2周後剩餘的G-CSF等於或多於75％附圖簡述
圖1．是表示在40℃下2周的加速試驗中pH和剩餘G-CSF的百分比之間關係的曲線圖。
圖2是表示在40℃下2周的加速試驗中pH和脫唾液酸化(desialylated)G-CSF的產率之間關係的曲線圖。
圖3是表示在包裝後經過24小時以每1重量份G-CSF計的吐溫20重量份和吸附抑制率之間關係的曲線圖。
本發明的最優選實施方案任何高純人G-CSF均可以用於本發明的液體製劑。具體說，G-CSF可以衍生自天然原料或得自於遺傳重組，只要該G-CSF具有和哺乳動物的G-CSF，尤其是人G-CSF基本上相同的生物活性。遺傳重組G-CSF可以具有和天然G-CSF相同的胺基酸序列或可以在該胺基酸序列中含有缺失、取代或添加的一個或多個胺基酸，只要該遺傳重組G-CSF具有所述的生物活性。本發明中的G-CSF可以通過任何方法製備，例如它們可以通過多種技術由人腫瘤細胞系的培養物提取和純化，或可以通過在大腸桿菌、酵母、中國倉鼠卵巢(CHO)、C127等中的遺傳工程來製備且隨後通過多種技術提取和純化。首選在CHO細胞中通過遺傳工程製備的G-CSF。
適合獲得本發明的含G-CSF穩定製劑的表面活性劑的典型實例包括非離子表面活性劑，例如脫水山梨糖醇脂肪酸酯，如脫水山梨糖醇一辛酸酯、脫水山梨糖醇一月桂酸酯、脫水山梨糖醇一棕櫚酸酯；甘油脂肪酸酯，例如甘油一辛酸酯、甘油一肉豆蔻酸酯、甘油一硬脂酸酯；聚甘油脂肪酸酯，例如十甘油基一硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油基一亞油酸酯；聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇一月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇一硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇一棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯；聚氧乙烯甘油脂肪酸酯，例如聚氧乙烯甘油基一硬脂酸酯；聚乙二醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯月桂基醚；聚氧乙烯聚氧化丙烯烷基醚，例如聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟基醚；聚氧乙烯烷基苯基醚，例如聚氧乙烯壬基苯基醚；聚氧乙烯硬化蓖麻油，例如聚硬化乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)；聚氧乙烯蜂蠟衍生物，例如聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟；聚氧乙烯羊毛脂衍生物，例如聚氧乙烯羊毛脂；聚氧乙烯脂肪醯胺，例如具有6-18 HLB的聚氧乙烯硬脂醯胺；陽離子表面活性劑，例如具有C10-18烷基的烷基硫酸鹽，如鯨蠟基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉；E0的平均摩爾數為2-4且具有C10-18烷基的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，如聚氧乙烯月桂基硫酸鈉；具有C8-18烷基的磺基琥珀酸烷基酯鹽，例如磺基琥珀酸月桂基酯鈉；天然表面活性劑，例如卵磷脂；甘油磷脂類；神經磷脂類，例如鞘磷脂；其中脂肪酸含有12至18個碳原子的蔗糖脂肪酸酯。可以在本發明的液體製劑中加入一種或兩種或多種的上述表面活性劑。
優選的表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，更優選吐溫(polysorbates)20、21、40、60、65、80、81、85，首選吐溫20和80。
表面活性劑在本發明含G-CSF製劑中的加入量以每1重量份G-CSF計一般為0．0001-1重量份，優選以每1重量份G-CSF計為0．1-1重量份，特別優選以每1重量份G-CSF計為0．2-0．8重量份，首選以每1重量份G-CSF計為0．4-0．8重量份。尤其當每1ml製劑中含有125μg或250μg的G-CSF時，適宜加入100μg的表面活性劑。因此，以每1重量份G-CSF計，尤其優選0．4重量份或0．8重量份的表面活性劑。當未加入任何蛋白質如白蛋白作為穩定劑時，在超過1重量份(以每1重量份G-CSF計)的表面活性劑的存在下長時間保存後，剩餘G-CSF的百分比趨於降低。實際上1重量份或更少的表面活性劑(以每1重量份G-CSF計)就足以抑制G-CSF吸附在容器上。
本發明優選的含G-CSF製劑基本上不含有蛋白質作為穩定劑。一些上市產品含有蛋白質如人血清白蛋白或純化明膠作為穩定劑來抑制G-CSF的化學或物理變化。但是，蛋白質作為穩定劑的加入包括一個極其複雜的用於消除病毒汙染或其它問題的過程。
本發明的含G-CSF製劑的pH等於或小於7，優選5-7，更優選6-6．8，首選6．2-6．8。如下文的進一步說明，經過在40℃下2周的加速試驗後，剩餘G-CSF的百分比在等於或小於7的pH下保持穩定。從這一點看，優選pH約是7．0或更低。經過在40℃下2周的加速試驗後測定的脫唾液酸化G-CSF的產率顯示出在4或更小的pH下脫唾液酸化產物的含量急劇增加。從這一點看，優選pH約等於或大於5。進一步考慮到中性條件適宜在作為注射製劑對人體給藥時刺激性更小，首選pH為6．2-6．8。
本發明的含G-CSF製劑含有稀釋劑、增溶劑、等滲劑、賦形劑、pH調節劑、柔化劑、含硫還原劑、抗氧劑等。例如，等滲劑包括聚乙二醇；和糖類如葡聚糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖。含硫還原劑包括N-乙醯基半胱氨酸、N-乙醯基高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、穀胱甘肽和含巰基化合物如含有1-7個碳原子的巰基鏈烷酸。抗氧劑包括異抗壞血酸、二丁基羥甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、酸式亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或螯合劑如乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉。可以作為賦形劑加入的是胺基酸，例如甘氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、組氨酸、精氨酸。也可以含有其它常加入液體製劑中的成分，例如無機鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鈉；和有機鹽，如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、醋酸鈉。
G-CSF在本發明液體製劑中的含量取決於被治療疾病的性質、疾病的嚴重程度、患者的年齡或其它因素，但通常是在1至1000μg／ml，優選10至800μg／ml，更優選50至500μg／ml。
本發明的液體製劑可以通過將這些組分溶解在液體製劑領域中已知的緩衝水溶液如磷酸鹽和／或檸檬酸鹽緩衝液中來製備。優選的磷酸鹽緩衝液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉鹽系列，並且優選的檸檬酸鹽緩衝液是檸檬酸鈉緩衝液。
本發明穩定的含G-CSF製劑一般經非腸道途徑如注射(皮下、靜脈內或肌肉內注射)給藥或經皮、經黏膜、經鼻或經肺給藥，但也可以口服給藥。
本發明的含G-CSF製劑一般包裝在密封和滅菌的塑料或玻璃容器中。所述容器可以作為規定劑型提供，例如安瓿、小瓶或一次性注射器，或可以作為大劑型提供，如注射用袋或瓶。優選含G-CSF製劑作為包裝在小瓶、安瓿或預裝注射器的劑型提供。
如下列實施例所示，本發明的含G-CSF製劑經過在40℃下2周的加速試驗後或經過在25℃下保存6個月後表現出極佳的剩餘G-CSF百分比。G-CSF的糖鏈具有一個或兩個末端唾液酸，它們可在長時間保存的過程中斷裂。發現本發明的含G-CSF製劑實際上經過在40℃下2周的加速試驗後脫唾液酸化產物保持在低比率。此外，不論容器是何種形狀如小瓶或注射器，本發明的含G-CSF製劑可以充分抑制吸附在容器上，並且經過在40℃下2周的加速試驗後和在25℃下6個月的保存後表現出極佳的剩餘G-CSF百分比。
下列實施例進一步舉例說明本發明，但不對本發明構成限制。實施例試驗方法將250mg G-CSF，0．1g吐溫20和30g D-甘露糖醇的混合物稱重並且用調至如下表所示的不同pH，和隨後調節至1L的總量。 將各個配製溶液在滅菌條件下製備和過濾，此後將1ml各溶液滅菌包裝在1個小瓶中並密封，製成G-CSF液體製劑。
將由此滅菌製備的含250μg／ml G-CSF的製劑在40℃的恆溫箱中放置2周。
按照下列方法1測定各瓶中G-CSF的含量。按照下列方法2測定各瓶中脫唾液酸化G-CSF的含量。方法1
在C4反相色譜柱(4．6mm×250mm，300埃)上用純水、乙腈和三氟乙酸作為流動相。通過反相高效液體色譜測定G-CSF的含量。注射等價於5μg G-CSF的量並且用乙腈梯度劑洗脫G-CSF，用分光光度計在215nm的波長下檢測。
利用通過這種方法測定的G-CSF含量按照下列公式計算出經過在40℃下2周的加速試驗後的剩餘G-CSF百分比(％)。
剩餘百分比(％)=[(40℃下加速2周後的G-CSF含量)／(未經加速的G-CSF)]×100方法2通過陽離子交換高效液體色譜檢測脫唾液酸化G-CSF(糖鏈上的唾液酸全部斷裂)和G-CSF(完整)。換言之，用氯化鈉梯度(0-500mM)在陽離子交換色譜柱(TSK凝膠DEAE)上用20mM Tris-HCl緩衝液(pH7．4)作為流動相來洗脫上述兩種物質，用分光光度計在215nm的波長下檢測。
利用通過這種方法測定的脫唾液酸化G-CSF和完整G-CSF的數值按照下列公式計算出經過在40℃下加速2周後的脫唾液酸化G-CSF產率。
脫唾液酸化G-CSF的產率(％)={(脫唾液酸化G-CSF)／[(脫唾液酸化G-CSF)+(完整G-CSF)]}×100實施例1不同pH對剩餘G-CSG百分比的影響對在如表1所示的多種pH下製備的液體製劑進行40℃下2周的加速試驗，此後按照方法1的公式計算出剩餘G-CSF的百分比。結果如圖1所示。
當pH等於或小於7時，剩餘G-CSF的百分比等於75％或更高。實施例2不同pH對脫唾液酸化G-CSF的生成的影響對在如表1所示的多種pH下製備的液體製劑進行40℃下2周的加速試驗，此後按照方法2的公式計算出脫唾液酸化G-CSF的產率。結果如圖2所示。
當pH在5-7的範圍內時，脫唾液酸化G-CSF的產率極低。實施例3表面活性劑的濃度對G-CSG在容器上的吸附作用的影響向250mg G-CSF和5．844g氯化鈉的混合物中加入吐溫20達到如表2所示的濃度，並且用磷酸鈉緩衝液將混合物的pH調至6．5和總量為1L。表2 如表2所示的各種G-CSF配製溶液在滅菌條件下製備和過濾，此後將1ml的各個溶液滅菌包裝在小瓶(未經處理的白色玻璃小瓶(5ml)，Murase Glass生產)中，並且通過方法1所示的反相高效液體色譜在包裝後立刻和包裝後經過24小時後測定G-CSF的含量。
利用通過這種方法測定的G-CSF含量按照下列公式計算出包裝後經過24小時的吸附抑制率(％)。
吸附抑制率(％)=[(包裝後經過24小時的G-CSF含量)／(包裝後即刻的G-CSG含量)]×100結果如表3和附圖3所示。
表3重量份*)吸附抑制率0 94．5％0．08 95．0％0．2 97．5％0．4 97．0％0．8100％2 99．5％*)重量份以每1重量份G-CSF計的吐溫20的重量份當吐溫濃度是1重量份(以每1重量份G-CSF計)或更少時也具有足夠的吸附抑制率。實施例4包裝在小瓶或注射器中的製劑的穩定性滅菌條件下製備含有250mg G-CSF、0．1g吐溫20和7g氯化鈉的總量為1L和pH調至6．5的配製溶液，過濾，此後將1ml各個溶液滅菌包裝在小瓶(參見上文)或注射器(Hypac SFC，長1ml，NipponBecton Dickinson Co，．Ltd．生產)中並密封，製成如表4所示的G-CSF液體製劑。表4
將由此滅菌製備的含有250μg／ml G-CSF的製劑在40℃的恆溫箱中放置2周或在25℃的恆溫箱中放置6個月。
按照方法1所述方法測定G-CSF的含量，按照方法1中的公式分別計算出經過40℃下2周的加速試驗後或在25℃下保存6個月後的剩餘G-CSF的百分比。
結果如表5所示。表5
在小瓶和注射器中，經40℃下2周的加速試驗後的剩餘百分比為75％或更高，經25℃下保存6個月後的剩餘百分比為95％或更高，由此證明本發明的G-CSF製劑極其穩定。
工業實用性本發明的含G-CSF製劑，其中含有極少量表面活性劑，例如以每1重量份G-CSF計等於或小於1重量份的表面活性劑，可以有效解決有關因聚集、聚合、氧化或在容器壁上吸附所致的活性組分損失或活性降低的問題，這些問題是由外部因素，如製劑中存在的少量G-CSF的溫度、溼度、氧、紫外線等造成。因此，本發明提供了降低生產過程中的複雜性和成本並且在長時間保存中保持穩定的液體製劑。
權利要求
1．一種穩定的含粒細胞集落刺激因子製劑，該製劑含有粒細胞集落刺激因子和至少一種藥學上可接受的表面活性劑並且具有等於或小於7的pH，所述表面活性劑的含量是以每1重量份粒細胞集落刺激因子計等於或小於1重量份。
2．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，其中所述表面活性劑的含量是0．2至1重量份，以每1重量份粒細胞集落刺激因子計。
3．權利要求2所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，其中所述表面活性劑的含量是0．2至0．8重量份，以每1重量份粒細胞集落刺激因子計。
4．權利要求2所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，其中所述表面活性劑的含量是0．4至0．8重量份，以每1重量份粒細胞集落刺激因子計。
5．權利要求2所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，其中所述表面活性劑的含量是0．4至0．8重量份，以每1重量份粒細胞集落刺激因子計。
6．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，該製劑基本上不含有蛋白質作為穩定劑。
7．權利要求1所述的粒細胞集落刺激因子製劑，其中所述表面活性劑是至少一種選自下列的表面活性劑非離子表面活性劑，如脫水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧化丙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯蜂蠟衍生物、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯脂肪醯胺；陽離子表面活性劑，例如烷基硫酸鹽、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、磺基琥珀酸烷基酯鹽；和天然表面活性劑，例如卵磷脂、甘油磷脂、神經磷脂、蔗糖脂肪酸酯。
8．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，其中所述表面活性劑是選自吐溫20和吐溫80的聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
9．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，該製劑的pH為5-7。
10．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，該製劑的pH為6-6．8。
11．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，該製劑的pH為6．2-6．8。
12．權利要求1所述的含粒細胞集落刺激因子製劑，該製劑包裝在小瓶、安瓿或預裝注射器中。
全文摘要
本發明涉及一種穩定的含粒細胞集落刺激因子製劑,該製劑含有粒細胞集落刺激因子和至少一種藥學上可接受的表面活性劑並且具有等於或小於7的pH,所述表面活性劑的含量是以每1重量份粒細胞集落刺激因子計等於或小於1重量份的表面活性劑。
文檔編號A61K38/19GK1292705SQ9980373
公開日2001年4月25日 申請日期1999年3月5日 優先權日1998年3月6日
發明者住田秀司, 佐藤泰 申請人:中外製藥株式會社