一種用轉基因植物表達醫用蛋白的方法
2023-09-19 23:26:45 1
專利名稱：一種用轉基因植物表達醫用蛋白的方法
技術領域：
基因工程領域背景技術1，植物生物反應器是國際生物工程藥物研究的前沿領域。通過轉基因技術，以農作物為表達系統生產試劑和藥物、單克隆抗體、酶製劑和結構蛋白、抗原(疫苗)等，安全廉價，與微生物和轉基因動物相比，具有明顯的優越性。80年代提出利用轉基因植物生產人類所需要的各種藥物原料的分子農業(molecular farming)的概念，目前部分產品已經上市並贏利。1995年《Science》發表利用轉基因植物生產口服疫苗的設想。植物生物反應器打破了傳統的醫藥生產模式，開創了生物醫藥工程學和植物基因工程交叉的新領域，具有良好的產業化前景。
2，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是廣泛感染於人類消化道的微需氧菌，已確認是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，並被WHO列為與胃癌發生密切相關的病原菌，認為是人類第I類致癌原(Group I carcinogen)。由於常規藥物治療存在副作用大，耐藥菌株逐漸增多等缺點。因此，疫苗的使用將是預防Hp感染的最有效方法。幽門螺桿菌基因工程疫苗一直是國內外研究的熱點，但迄今尚無產品問世。通過轉基因技術，用植物作為生物反應器大量生產廉價、安全的口服Hp疫苗不僅具有較高的科研價值，而且具有巨大的經濟效益和社會效益。Hp存在多種保護性抗原，如尿素酶(urease)、細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin assiociated protein，CagA)、空泡毒素A(vaculoting cytotoxinA，VacA)等，其中尿素酶主要活性部位存在於細菌表面，表達量高且高度保守，尿素酶B亞單位因具有無毒性和很強的免疫原性，而成為Hp疫苗有效成份的候選者。霍亂毒素B亞單位(CTB)是霍亂毒素(CT)的免疫原部分，霍亂毒素及其B亞單位是迄今為止發現的最強的、能刺激機體黏膜反應的免疫原。據文獻報導，以CTB為免疫佐劑配合Hp相關抗原口服免疫蒙古沙鼠，能使其產生針對Hp感染的保護性免疫。
3，我國是慢性胃疾病的高發國家，胃癌位居我國惡性腫瘤死亡的前列，因此，預防和根治Hp感染對大幅度降低慢性胃病及胃癌的發生，保護人民身體健康具有極其重要的意義。病理學研究表明，細胞毒素相關蛋白A(Cag A)是Hp菌株具有高毒力的標誌。Cag A蛋白具有免疫保護作用，是Hp重要的保護性蛋白抗原。但是目前還無法人工培養Hp和製備防治Hp的免疫藥物。本發明採用植物生物反應器的原理，以農桿菌Ti質粒為載體，將外源基因Hp cagA或ureB基因和黏膜免疫佐劑CTB融合基因轉入水稻基因組中，使轉基因植物大量、穩定表達Hp的CagA或ureB蛋白抗原，在蒙古沙鼠模型中驗證其防治Hp感染的作用。
發明內容
以防治Hp感染為例，將與Hp免疫原性相關基因導入水稻，並利用特異表達啟動子使基因在水稻籽粒中表達，通過選育和蒙古沙鼠免疫試驗，獲得具有能夠表達免疫活性醫用蛋白的水稻品系。
●構建不含抗生素選擇標記的高效、特異和安全的表達載體。
●攻克植物生物反應器的關鍵技術，建立了功能性作物的技術平臺。
●研究目的基因表達產物(免疫蛋白含量)隨世代和環境變化的規律。
●選育具有較高免疫活性的株系進行生產技術的公關。
具體實施例方式
實施例1以通過農桿菌介導法將CagA和CTB融合基因導入水稻為例。本實施例不排除其它的試驗方法和措施，包括試驗材料等。
一、表達載體的構建1.根據genebank中公布的CagA以及CTB基因的序列分別設計引物CagA-F 5-』CGCGAGGATCCATGACTAACGAAACTATTGA-3』(BamHI)；CagA-R 5-′GCGACGGtaCCTTAAGATTTTTGGAAACCAC-3′(KpnI)；CTB-F 5-』CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3』(KpnI)；CTB-F 5-』CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3』(KpnI)；CTB-R 5-』GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3』(XhoI，BamHI)。
CTB-R 5-』GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3』(XhoI，BamHI)。
從H.pylori DS115DNA中擴增CagA和CTB基因的全序列。為下一步克隆方便，在各引物的5』端設計酶切位點。
2.BamH+KpnI雙酶切CagA基因純化片段和中間載體pbluescriptII KS(+)，回收約3.4kb的CagA基因片斷及約3kb的中間載體pbluescriptII KS(+)片斷，定量按3∶1的比例將兩個片斷混和進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌。挑取重組菌株，提取質粒酶切鑑定。得到重組中間質粒KS-CagA。
3.KpnI+XhoI雙酶切CTB基因純化片斷和質粒KS-CagA，回收約400bp的CTB基因片斷及約6.4kb的KS-CagA質粒片斷，定量按3∶1的比例將兩個片斷混和進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌。挑取重組菌株，提取質粒酶切鑑定。得到含有CagA-CTB串連基因的重組中間質粒KS-CagA-CTB。
4.BamHI單酶切中間載體KS-CagA-CTB和經改造的pCAMBIA1301雙元載體，回收約3.8kb的CagA-CTB串連基因片斷和約12kb的pCAMBIA1301雙元載體片斷，將pCAMBIA1301雙元載體片斷進行去磷酸化，定量按3∶1的比例將兩個片斷混和進行連接反應，連接產物轉化大腸桿菌。挑取重組菌株，提取質粒酶切鑑定。最終得到可用於農桿菌介導轉化植物的雙元表達載體p1301-CagA-CTB。
二、農桿菌感受態細胞的製備取-70℃保存的農桿菌EHA105於含50μg/ml利福平、卡那黴素平板上劃線，28℃培養。挑取單菌落接種於5ml YM液體培養基中，220rpm 28℃振蕩培養12-16hr。取2ml菌液轉接於100ml YM液體培養基中，28℃220rpm振蕩培養至OD600＝0.5。轉入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清液。加入10ml預冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min。4℃5000rpm離心5min，去上清。加入4ml預冷的含15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮。農桿菌懸浮液分裝於無菌Eppendorf管中，每管200μl凍存於-70℃。
三、雙元載體轉化農桿菌EHA105取1μg左右的質粒DNA加入到200ml EHA105感受態細胞中，混勻後，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴lmin，接著冰浴2min，加入800mlYM液體培養基28℃，175rpm搖培3hr後塗在含50μg/ml卡那黴素的YM平板上。28℃培養到形成單菌落。也可以將上述雙元載體質粒DNA用電激法導入EHA105感受態細胞，28℃培養到形成單菌落。挑取轉化的農桿菌單菌落接種於含50μg/ml卡那黴素的YM液體培養基中，28℃，220rpm搖培16hr，直接用菌液進行PCR鑑定。
四、根癌農桿菌介導的水稻轉化準備開花後12-15天左右的脆莖水稻未成熟種子，經表面滅菌後擠出水稻幼胚置於固體誘導培養基(NB)上，暗培養誘導愈傷組織。約5-7天後剝下愈傷組織，轉入新鮮配製的繼代培養基(NB)上，在相同條件下繼代培養5天左右；或者準備水稻成熟胚，同樣條件下誘導愈傷組織，挑選繼代培養5-7天、色澤淡黃的愈傷組織在適量農桿菌懸浮液(OD 0.3-0.5)中浸泡15-20min，轉入固體共培養基上，26℃黑暗培養2-3天。將共培養後的愈傷組織放在含有50mg/l潮黴素的選擇培養基上，26℃暗培養14天，轉到新鮮配製的選擇培養基上繼續篩選14天至長出抗性愈傷組織。從經兩輪篩選後長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色緻密的抗性愈傷組織轉至含有50mg/L潮黴素的分化培養基上，先暗培養3天，然後轉至12-15hrs/日的光照條件下培養，經過15-25天左右，長出綠點。30-40天後進一步分化出小苗。當抗性愈傷組織分化的苗或芽長至約2cm時，將小苗移到生根培養基上，培養兩周左右，在溫室內移栽入土。
其中YM(液體)培養基KH2PO40.5g/l+甘露醇10g/l+穀氨醯胺2g/l+NaCl0.2g/l+MgSO40.2g/l+酵母浸膏0.3g/l，pH 7.0。
誘導培養基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+2，4-D 1.5-4.5mg/l+脯氨酸300-1000mg/l+穀氨醯胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH5.8。
繼代培養基同誘導培養基，但是2，4-D改為2.0-3.0mg/l。
共培養(固體)培養基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+2，4-D 2.0-3.0mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+肌醇500-2000mg/l+乙醯丁香酮100μM+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH5.5。
(液體共培養培養基無Gelrite)。
選擇培養基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+2，4-D 2.0-3.0mg/l+脯氨酸300-500mg/l+穀氨醯胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000m/l+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+頭孢黴素250mg/l+潮黴素50mg/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH 5.8。
分化培養基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+NAA 0.1-0.5mg/l+KT 4-8mg/l+脯氨酸300-500mg/l+穀氨醯胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+頭孢黴素250mg/l+潮黴素50mg/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH 5.8。
生根培養基1/2 MS/N6大量+MS-Fe鹽+B5微量+蔗糖10-20g/l+瓊脂0.8％，pH 5.8。
五、轉基因植株的檢測和選育在轉基因植株(T0)成活後，取樣進行PCR檢測，保留PCR陽性的植株，常規管理。PCR檢測是任何分子生物學實驗室都能進行的基本檢測技術。轉基因株系的提純和選育同時進行。
方案1、取轉基因陽性植株(T0)的穗子進行花葯培養，花葯培養的技術已經得到廣泛應用，一般實驗室和技術人員都可操作，具體方法見中國水稻科學，1993，7227-231；1996，1037-42或者Plant Breeding，1996，115295-300。花葯培養再生植株按單株採收種子。每株系取50-100粒種子按株系在含50mg/l的潮黴素水溶液中發芽，考查發芽率。選發芽率和對照相仿的株系的發芽種子播種。單本或者多本插，常規管理，以原始親本為對照。分子檢測和蒙古沙鼠免疫試驗。
方案2、轉基因陽性植株(T0)按單株採收種子。每株系取50-100粒種子(T1)在含50mg/l的潮黴素水溶液中發芽，考查發芽率，以原始親本為對照。選發芽率約為對照3/4的株系的發芽種子播種。單本或者多本插，常規管理。T2代試驗，對發芽率和對照無異的株系進行檢測和蒙古沙鼠免疫試驗。種子在含50mg/l的潮黴素水溶液中發芽，發芽率正常的株系進入新品種的選育程序。
六、Western Blot檢測方案1.將目的基因與原核表達載體pSBETSH相連接，連接產物轉入大腸桿菌TG1，分別用PCR和酶切的方法篩選陽性克隆。
2.將構建好的原核表達載體轉入表達菌株BL21(DE3)pLysS，經PCR驗證後用於誘導表達。挑取單個陽性菌落到5ml含Kan的LB液體培養基中，37℃，250rpm振蕩培養過夜。次日以1∶100稀釋到5ml新鮮的含Kan的LB液體培養基中，繼續培養約2hrs，取1ml作為對照。再在剩餘培養液中加IPTG至終濃度達到1mmol/l，誘導表達培養2hrs後取菌液1.5ml，離心收集菌體沉澱，用於SDS-PAGE檢測。
3.將鑑定正確的重組質粒轉化E.coli BL21(DE3)plysS，IPTG誘導，進行表達檢測。經IPTG誘導後的菌株會出現一條非常明顯的蛋白條帶，與預期融合蛋白的分子量大小一致，而在空載菌誘導中沒有此蛋白條帶出現。不誘導的重組質粒菌中雖有此蛋白帶出現，但條帶比經過誘導的重組質粒菌條帶要淡。誘導的表達菌株經超聲波裂解後的上清中有很濃的表達帶，沉澱中雖有相應的條帶，但比上清要弱得多，表明所表達的融合蛋白大部分是可溶的。
4.採用SDS-PAGE，層析等方法對目的蛋白進行純化。取一份蛋白放入研缽，加一定量的生理鹽水充分研磨，用注射器注射小鼠，每隻小鼠每次注射0.5ml。每隔7天免疫一次，第三次免疫後3天斷頭取血。血液4℃放置8hrs，14000rpm離心5min，收集上層血清。採用吸附的方法去除非目的蛋白的抗體。
5.提取轉基因植物的蛋白質，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，再分別用原核表達的蛋白質和標準蛋白作為對照。SDS-PAGE分離後的凝膠(不染色)置於轉移緩衝液中(含20％甲醇和0.037％SDS的Tris-Gly緩衝液)浸泡30min，然後將已浸泡過的凝膠，硝酸纖維濾膜，濾紙及海綿依次疊放在支架上。轉移2---5hrs，轉移完成後，用蒸餾水衝洗硝酸纖維素膜。把硝酸纖維素膜放入培養皿中，加入封閉液，在搖床上平臺上於室溫封閉1hr，棄去封閉液，按0.1ml/cm2的量加入用封閉液稀釋的第一抗體(鼠抗血清)。在室溫下反應2hrs。放射自顯影曝光3min至10min。顯影后清水漂洗，再定影。
實施例2以通過基因槍轟擊法將UreB+CTB融合基因和CagA+CTB融合基因同時導入水稻中花11為例。本實施例不排除其它的試驗方法和措施，包括試驗材料等。
一、表達載體的構建本試驗採用分別構建UreB+CTB融合基因表達載體和CagA+CTB融合基因表達載體(一)UreB+CTB融合基因表達載體的構建1.合成有關引物，序列為CTB 5』primer 5』-GGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3』CTB 3』primer 5』-ACCGCCGGATCCACCGCCACCATTTGCCATACTAATTGCGG-3』ureB 5』primer5』-GGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3』ureB 3』primer5』-TGCACTGCAGCTAGAAAATGCTAAAGAGTTG-3』Linker5』-AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC-3，
Wx pro 5』primer5』-CCCGAGCTCCACGTCAGATCGAGACCAAG-3』Wx pro 3』primer5』-GTAATTGTTGTAAAAATAGGTTGTCTAGCTGTTGCTGT-3』ΩK 5』primer5』-TATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTAC-3』ΩK 3』primer5』-CCCGGTACCCGCCATGGTTTATTGTAAATAGTAATTGTAATGTTGTTTGTTG-3』NOS ter 5』primer5』-CGCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAAT-3』NOS ter 3』primer5』-CGCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGAT-3』2.PCR法構建CTB-ureB融合基因從H.pylori DS115中抽提H.pylori DNA，吸取少量抽提產物和少量含CTB基因的質粒pGEM-CTB，反應體系中加入CTB 5』primer、Linker和ureB 3』primer三條引物，擴增獲得CTB-ureB融合基因。
3.PCR法改造Wx pro序列，構建Wx pro-ΩK融合序列ΩK5』和3』引物直接退火延伸獲得產物ΩK。以質粒p13W4為模板，Wxpro5』primer和Wxpro 3』primer為引物，進行PCR反應，獲得Wxpro-ΩK融合序列。
4.PCR法合成NOS終止子序列在50μl體系中，加入p13W4和其它各組分，進行PCR反應，5.CTB-ureB融合基因的克隆純化後的CTB-ureB PCR產物用Pst I和Kpn I雙酶切，然後與用同樣酶切的pUCl9連接，獲得CTB-ureB融合基因重組子pUCU。
6.CTB-ureB融合基因植物表達載體的構建用Hind III和Pst I雙酶切p13W4中擴增得到的NOS終止子序列，與用相同酶切的pCAMBIA1300連接，得到質粒pCN。從質粒pUCU上用Pst I和Kpn I切下CTB-ureB片段，然後與用相同酶切的pCN連接，獲得質粒pCUN。再用Sac I和Kpn I雙酶切pCUN和Wx pro-ΩK，最後進行連接，得到質粒pWCUN，完成CTB-ureB融合基因植物表達載體的構建。
(二)UreB+CTB融合基因表達載體的構建同實施例1。
二、表達載體轉化大腸桿菌和質粒的提取1.感受態細胞的製備電擊轉化用感受態細胞的製備從LB培養基(Tryptone 10g/l，Yeast extract5g/l，NaCl 5g/l，瓊脂20g/l，pH 7.0)平板上挑取新活化的大腸桿菌單菌落，接種於裝有50ml LB液體培養基的250ml的三角瓶中，37℃振蕩培養12-16hr，直至對數生長後期。從該菌懸液中取出2.0ml，轉入裝有200ml LB液體培養基的500ml的細菌培養瓶中(按1∶100的體積比例加入)，37℃再振蕩培養大約3hr至OD600達到0.5左右。將培養液轉入離心管(250ml平底離心管)，冰上放置10min，然後4℃，4,000g離心15min(水平轉頭最好)，儘量去淨上清液。加入200ml(同原菌液等體積)滅菌預冷的10％的甘油，輕輕顛倒混勻後，4℃，4,000g離心15min。倒掉上清，將沉澱用100ml(原菌液體積的1/2)滅菌預冷的10％的甘油洗一遍。4℃，4,000g離心15min，將沉澱用50ml(原菌液體積的1/4)滅菌預冷的10％的甘油再洗一遍，倒掉上清，加入10ml左右預冷的10％甘油，混勻後迅速分裝到EP管中，每管40μl，迅速放入液氮中速凍，最後放於-80℃備用。
也可以製備用於熱擊轉化的感受態細胞菌的活化和菌液培養同前，200ml培養好的菌液冰上放置10min，然後於4℃，4,000g離心5min，加入40ml冰冷的CaCl2溶液(0.1M CaCl2，0.01M Tris，pH 7.0，10mM DTT)輕輕懸浮沉澱，混勻後冰浴20min。4℃，4,000g離心5min，加入4ml冰冷的0.1M CaCl2溶液輕輕懸浮沉澱，混勻後冰浴2-5hr。加滅菌甘油至總體積的15％(v/v)，混勻後冰浴12-18hr。第二天取出混勻後迅速分裝到EP管中，每管100μl，放入液氮中速凍，最後放於-80℃備用。
2.轉化連接產物用於電擊轉化前要經過乙醇沉澱，70％乙醇清洗，真空乾燥後溶於4μl無菌ddH2O。電擊轉化具體步驟如下打開電擊轉化儀，將參數設置為電壓2.5KV，電容25μF，電阻200Ω。從-80℃冰箱中取出感受態細胞，放置冰上，待其融化後，加入2μl連接產物，快速輕輕吸吐混勻，冰浴1min。將上混合物轉入-20℃預冷的電擊轉化杯中(加後輕甩，使菌液鋪滿杯底)，用吸水紙將杯壁外的水擦淨，電擊。取出轉化杯，立即加入1ml SOC培養基(LB+10mM MgCl2+10mM MgSO4+20mM過濾除菌的葡萄糖)並混勻，將上述混合物轉入一滅菌的離心管中，37℃，200rpm振蕩培養1hr，取200μl塗板。
連接產物可直接用於熱擊轉化，從-80℃取出感受態細胞，放置冰上，待其融化後，將連接產物全部加入其中，快速輕輕吸吐混勻，冰浴30min。於42℃水浴中放置1min，取出冰浴2min左右。加入500μl SOC培養基，37℃，200rpm振蕩培養1hr。取200μl塗板。
3.重組克隆的篩選與鑑定用無菌牙籤挑取轉化後生長的單菌落接種於含有相應抗生素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養16hr，用於質粒提取。然後通過酶切質粒、電泳檢測，對重組轉化子進行鑑定。
4.質粒的提取將過夜培養的細菌轉入1.5ml EP管，13,000rpm離心30s收集菌體；倒掉大部分上清，留約50-100μl(包括沉澱的菌體)；加300μl TENS(含有0.1M NaOH和0.5％SDS的TE緩衝液)，渦旋混和直至混合物發粘；加入150μl 3M醋酸鈉(pH5.2)，混勻；13,000rpm離心10min，取上清，加入900μl無水乙醇，混勻；放置-20℃ 30min；13,000rpm離心5min，用70％的乙醇將沉澱洗兩遍，真空乾燥後溶於適量的TE緩衝液。
三、基因槍轟擊導入外源基因取開花後12-15天左右的水稻未成熟種子，經表面消毒後擠出水稻幼胚置於固體誘導培養基(NB)上，暗培養誘導愈傷組織。約5-7天後剝下愈傷組織，轉入新鮮配製的繼代培養基(NB)上，在相同條件下繼代培養5天左右。將愈傷組織轉移到高滲培養基上，愈傷組織緊密地排在培養皿的中央，培養過夜。
稱取60mg直徑1μm的金粉於1.5ml的離心管內，加1ml無水酒精，振蕩1min，10000rpm離心10sec，棄上清，重複一次，將金粉懸浮於1ml無菌水中，-20℃保存。吸取50μl金粉懸浮液，加20μl 0.1M亞精胺，50μl 2.5M CaCl2，2.5μg UreB+CTB融合基因表達載體DNA和2.5μg CagA+CTB融合基因表達載體DNA。振蕩3min，10000rpm離心20sec，棄上清，無水酒精漂洗2次，加60μl無水酒精定容。取20μl金粉懸液置於1100psi型的可裂膜上，晾乾後用BiolisticTM PDS-1000基因槍，真空度28，壓力1100psi轟擊愈傷組織。每皿愈傷組織轟擊2次。
轟擊後的材料轉入新鮮配製的繼代培養基(NB)上黑暗恢復培養。2-7天後轉入含有50mg/l潮黴素的選擇培養基上培養抗性愈傷，26℃暗培養14天，轉到新鮮配製的選擇培養基上繼續篩選14天至長出抗性愈傷組織。從經兩輪篩選後長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色緻密的抗性愈傷組織轉至含有50mg/L潮黴素的分化培養基上，先暗培養3天，然後轉至12-15hrs/日的光照條件下培養，經過15-25天左右，長出綠點。30-40天後進一步分化出小苗。當抗性愈傷組織分化的苗或芽長至約2cm時，將小苗移到生根培養基上，培養兩周左右，在溫室內移栽入土。
其中誘導培養基、繼代培養基、選擇培養基、分化培養基和生根培養劑與例1的相同，高滲培養基為誘導培養基+2，4-D 1.5-4.5mg/l+0.5mol/l甘露醇，pH 5.8。
轉基因植株的檢測和選育可以與例1的相同，分子檢測後挑選同時檢出UreB和CagA的單株或者株系供品種選育。
實施例3以通過花粉管導入法將含UreB+CTB融合基因和CagA+CTB融合基因的雙價基因導入為例。本實施例不排除其它的試驗方法和措施，包括試驗材料等。
一、雙價基因表達載體的構建構建方法如例1和例2，區別是將兩個融合基因構建到同一個表達載體中。
二、表達載體轉化大腸桿菌和質粒的提取1.感受態細胞的製備與例2的相同。
2.轉化與例2的相同。
3.重組克隆的篩選與鑑定與例2的相同。
4.質粒的提取與例2的相同。
三、花粉管導入外源基因本操作在水稻(中花11號)抽穗開花時進行，事先需要觀察中花11號在當地的始花時間和揚花尖峰時間。在清晨水稻始花前挑選當天將有大約20個小穗開花的穗子，剪去已經開花的所有小穗。在水稻揚花的高峰期，剪去全部沒有開花的小穗。1hrs後，每個小穗剪去大約2/3的內穎，柱頭和約1/3的花柱，保留外穎。用移液槍將10μl質粒DNA滴在花柱的切口上，質粒DNA的濃度為50-300μg/ml。1hrs後用同樣體積和濃度的質粒DNA再滴一次，然後套袋並掛牌。25-30天後採收穗子脫粒，種子(T0)乾燥後保存。由T0種子長出的水稻植株稱為T1代植株。
轉基因植株的檢測和選育可以與例1的相同。分子檢測後挑選同時檢出UreB和CagA的單株或者株系供品種選育。
本發明的預期效果1.應用含有與Hp免疫原性相關基因的Ti載體已經成功地轉化了水稻，，說明該Ti載體具有很好的實用性。
2.轉基因水稻可以穩定表達與Hp免疫原性相關基因，蒙古沙鼠口服後可產生相關的抗體。
權利要求
1.一種用轉基因植物表達醫用蛋白的方法，其特徵是以防治Hp感染為例，將與Hp免疫原性相關基因導入水稻，並利用特異表達啟動子使基因在水稻籽粒中表達，通過品種選育和蒙古沙鼠免疫試驗，獲得具有能夠表達免疫活性醫用蛋白的水稻。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵是所述的醫用蛋白可以是CagA(細胞毒素相關蛋白A)、ureB(尿素酶B亞單位)、CagA與免疫佐劑CTB(霍亂毒素B亞單位)的融合蛋白、ureB與CTB的融合蛋白。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述的導入採用農桿菌轉化、基因槍轟擊、原生質體培養或花粉管導入的方法。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵是所導入的基因為單價基因、雙價基因或多價基因。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵是所述的選育是對轉基因植物直接進行選育或以轉基因植物為親本進行的雜交轉育。
6.如權利要求4或5所述的方法，其基因表達的檢測方法為Westernblotting檢測。
7.如權利要求4或5或6所述的方法，其特徵是所述的免疫活性試驗是採用蒙古沙鼠的免疫試驗。
全文摘要
技術領域基因工程領域本發明要解決如何在植物體特定組織中表達醫用蛋白，提高醫用蛋白表達量，並保證醫用蛋白免疫活性的問題。本發明以防治Hp感染為例，採用植物生物反應器原理，將與Hp免疫原性相關Hp cagA或ureB和黏膜免疫佐劑CTB融合基因轉入水稻基因組中，並利用特異表達啟動子使在轉基因水稻籽粒中大量、穩定表達，通過品種選育和蒙古沙鼠免疫試驗，獲得含有高免疫活性醫用蛋白的轉基因水稻，作為防治Hp感染的疫苗來源。今後，人們尤其是高危人群，在醫生指導下，食用一定量的功能性大米或其製品，以達到根治和預防Hp感染、降低Hp相關性疾病的發病率、增強預防胃癌能力的目的。
文檔編號C12P21/02GK1800406SQ20051006046
公開日2006年7月12日 申請日期2005年8月24日 優先權日2005年8月24日
發明者胡國成, 付亞萍, 孫宗修, 劉文真, 斯華敏 申請人:胡國成, 付亞萍, 孫宗修, 劉文真, 斯華敏