一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑及其製備方法和應用的製作方法
2023-09-11 19:27:55
專利名稱：一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒活疫苗的保護劑，具體涉及一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑及其製備方法和應用，屬動物用病毒活疫苗製造領域。
背景技術：
豬瘟是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，具有流行廣泛、發病率高等特點，對養豬業危害極大。豬瘟病毒是黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬(Pestivirus)的成員，為有囊膜的正鏈RNA病毒。預防豬瘟最有效的方法就是接種豬瘟疫苗。目前市場上預防豬瘟的疫苗主要有三種乳兔苗、細胞苗和淋脾苗。然而，疫苗在運輸過程中需要冷藏保存，冷藏條件為_15°C，在我國一些經濟不發達地區，運輸條件很難要求，由此造成的疫苗失活、免疫失敗以致疫病 爆發，為我國帶來了巨大的經濟損失。凍幹保護劑及其製備方法是活疫苗生產工藝中的一項關鍵技術，對疫苗的保存、運輸和使用均產生影響。目前國內常用的保護劑主要由牛奶、蔗糖、明膠等組成，組方簡單，保護功能差，而國外對疫苗保護劑的研究技術較為保密，因此，使得我國成品疫苗的長期保存和運輸受到了較大的限制。影響凍幹保護劑保護性能的因素主要來自兩方面一是微生物因素，微生物的種類和結構差異(如病毒有無囊膜)、培養方法的選擇以及疫苗的種類等；二是保護劑的配方，選用保護劑的原料及其性質、原料配比及與該疫苗適應的凍幹曲線等。在選擇凍幹保護劑的組方時，要考慮上述幾種主要因素，選擇合適的組方與搭配，並通過反覆驗證制定凍幹曲線。豬瘟病毒對熱、酸敏感，在存放和運輸過程中容易受到環境中溫度和酸鹼度的影響，因此，需要選擇一種合適的病毒保護劑，能夠在不同保存條件下有效的防止病毒遭受破壞，保持病毒滴度，以延長病毒的存放期。耐熱凍幹保護與常規凍幹保護劑又有不同，它較多得考慮了生物活性製品在高溫、長時間保存條件下凍乾物質理化性質的改變對活疫苗存活的影響。因此，研製一種配方簡單、適於大規模生產、保護功能強的豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑顯得尤為重要。
發明內容
本發明的目的是提供一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑。本發明的另一個目的是提供一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑的製備方法。同時，本發明還提供一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑的應用。為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑，由以下重量百分含量的組分組成海藻糖5 10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2 3%，明膠I 2%，穀氨酸鈉I 3%，D-山梨醇2 5%，多聚蛋白腖4 5%，L-精氨酸0. 5 1%，維生素C 0. 5 1%，餘量為滅菌後的注射用水。
一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑的製備方法，具體步驟如下(I)按所述重量配比稱取聚乙烯吡咯烷酮、明膠、D-山梨醇、多聚蛋白腖溶於少量注射用水中，滅菌後備用；(2)按所述重量配比稱取海藻糖、穀氨酸鈉、L-精氨酸、維生素C溶於少量注射用水中，過濾除囷後備用；(3)將步驟(I)、(2)製得的溶液混合，加注射用水至全量即得。一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟活疫苗方面的應用，包括將本發明耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以I: (0. 8 I. 2)的體積比混合，加入抗生素，分裝，冷凍乾燥。 所述的抗生素為氨苄青黴素、硫酸鏈黴素中的一種。所述的氨節青黴素的加入量為每暈升10000 20000U。所述的硫酸鏈黴素的加入量為每暈升10 20mg。所述冷凍乾燥的具體步驟為將混合液置入0°C 4°C的凍幹箱中，以I°C 2°C /min的降溫速率降至_30°C _40°C，在此溫度下維持3 4h，開啟真空泵，至箱內真空度達0. Olmber時開始升溫，在16 24h範圍內升至_8°C _4°C，再以5°C 8°C /h的升溫速率升至20°C 25°C，在此溫度下維持3 6h。本發明的有益效果是本發明的耐熱凍幹保護劑配方簡單，製備容易，適於大規模生產，對疫苗具有良好的保護功效。製備得到的疫苗無菌安全、且性狀穩定，具有耐熱、保存時間長的特點，解決了疫苗在運輸過程中需要低溫冷凍、貯存不方便等問題。本發明的耐熱凍幹保護劑可以使豬瘟活疫苗在2°C 8°C條件下保存30個月以上。
具體實施例方式下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。實施例I豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑，由以下重量百分含量的組分組成海藻糖5%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2%，明膠1%，穀氨酸鈉1%，D-山梨醇2%，多聚蛋白腖4%，L-精氨酸0. 5%，維生素C 0. 5%，餘量為滅菌後的注射用水。耐熱凍幹保護劑的具體製備步驟為(I)按所述重量配比稱取聚乙烯吡咯烷酮、明膠、D-山梨醇、多聚蛋白腖溶於少量注射用水中，110°C滅菌30min備用；(2)按所述重量配比稱取海藻糖、穀氨酸鈉、L-精氨酸、維生素C溶於少量注射用水中，用孔徑為0. 22 的濾膜過濾除菌後備用；(3)將步驟(I)、(2)製得的溶液混合，加注射用水至全量即得。耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟活疫苗方面的應用將本發明耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以1:0. 8的體積比混合，按照ImL混合液10000U的量加入氨苄青黴素，分裝，冷凍乾燥。具體冷凍乾燥步驟為將混合液置入0°C的凍幹箱中，以1°C /min的降溫速率降至_30°C,在此溫度下維持4h,開啟真空泵,至箱內真空度達0. Olmber時開始升溫，24h升至-8°C，再以5°C /h的升溫速率升至20°C，在此溫度下維持6h。實施例2豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑，由以下重量百分含量的組分組成海藻糖8%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2. 5%，明膠I. 5%，穀氨酸鈉2%, D-山梨醇3. 5%，多聚蛋白腖4. 5%, L-精氨酸0. 75%，維生素C 0. 75%，餘量為滅菌後的注射用水。
耐熱凍幹保護劑的具體製備步驟為(I)按所述重量配比稱取聚乙烯吡咯烷酮、明膠、D-山梨醇、多聚蛋白腖溶於少量注射用水中，116°C滅菌20min備用；(2)按所述重量配比稱取海藻糖、穀氨酸鈉、L-精氨酸、維生素C溶於少量注射用水中，用孔徑為0. 22 的濾膜過濾除菌後備用；(3)將步驟(I)、(2)製得的溶液混合，加注射用水至全量即得。耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟活疫苗方面的應用將本發明耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以I: I的體積比混合，按照ImL混合液20000U的量加入氨苄青黴素，分裝，冷凍乾燥。具體冷凍乾燥步驟為將混合液置入4°C的凍幹箱中，以2°C /min的降溫速率降至-40°C,在此溫度下維持3h,開啟真空泵,至箱內真空度達0. Olmber時開始升溫，16h升至_4°C，再以8°C /h的升溫速率升至22°C，在此溫度下維持4h。實施例3豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑，由以下重量百分含量的組分組成海藻糖10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 3%，明膠2%，穀氨酸鈉3%，D-山梨醇5%，多聚蛋白腖5%，L-精氨酸1%，維生素Cl%,餘量為滅菌後的注射用水。耐熱凍幹保護劑的具體製備步驟為(I)按所述重量配比稱取聚乙烯吡咯烷酮、明膠、D-山梨醇、多聚蛋白腖溶於少量注射用水中，120°C滅菌15min備用；(2)按所述重量配比稱取海藻糖、穀氨酸鈉、L-精氨酸、維生素C溶於少量注射用水中，用孔徑為0. 22 的濾膜過濾除菌後備用；(3)將步驟(I)、(2)製得的溶液混合，加注射用水至全量即得。耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟活疫苗方面的應用將本發明耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以1:1.2的體積比混合，按照ImL混合液IOmg的量加入硫酸鏈黴素，分裝，冷凍乾燥。具體冷凍乾燥步驟為將混合液置入2°C的凍幹箱中，以1°C /min的降溫速率降至-35°C,在此溫度下維持3. 5h,開啟真空泵,至箱內真空度達0. Olmber時開始升溫,20h升至-6°C，再以6°C /h的升溫速率升至25°C，在此溫度下維持3h。實施例4豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑，由以下重量百分含量的組分組成海藻糖5%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2. 5%，明膠I. 5%，穀氨酸鈉3%，D-山梨醇5%，多聚蛋白腖5%，L-精氨酸1%，維生素C 1%，餘量為滅菌後的注射用水。耐熱凍幹保護劑的具體製備步驟為(I)按所述重量配比稱取聚乙烯吡咯烷酮、明膠、D-山梨醇、多聚蛋白腖溶於少量注射用水中，120°C滅菌20min備用；(2)按所述重量配比稱取海藻糖、穀氨酸鈉、L-精氨酸、維生素C溶於少量注射用水中，用孔徑為0. 22 的濾膜過濾除菌後備用；(3)將步驟(I)、(2)製得的溶液混合，加注射用水至全量即得。耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟活疫苗方面的應用將本發明耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以1:1的體積比混合，按照ImL混合液20mg的量加入硫酸鏈黴素，分裝，冷凍乾燥。具體冷凍乾燥步驟為將混合液置入0°C的凍幹箱中，以2°C /min的降溫速率降
至-40°C,在此溫度下維持3h,開啟真空泵,至箱內真空度達0. Olmber時開始升溫，16h升至_8°C，再以7V /h的升溫速率升至20°C，在此溫度下維持5h。成品檢驗試驗材料試驗組試驗組I :按照實施例I製備的豬瘟活疫苗；試驗組2 :按照實施例2製備的豬瘟活疫苗；試驗組3 :按照實施例3製備的豬瘟活疫苗；試驗組4 :按照實施例4製備的豬瘟活疫苗。對照組對照組I :常規的由5%的蔗糖脫脂乳配製的普通凍幹保護劑配製的豬瘟活疫苗；對照組2 :進口豬瘟活疫苗。空白對照組為滅菌後的注射用水。試驗動物21 30日齡的仔豬若干頭。豬瘟病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒購自南京奧多福尼生物科技有限公司。I.無菌檢驗無菌檢驗方法將試驗組2、3、4的疫苗和空白對照組分別接種於常規培養基中，每個組平行接種10個，將上述培養基置於37°C恆溫箱中培養過夜，培養24 72h後鏡檢觀察。檢驗結果接種試驗組2、3、4和空白對照的培養基表面經鏡檢均無菌落產生，無菌檢驗為陰性，表明本發明製備得到的疫苗無菌、安全。2.性狀檢驗性狀檢驗方法將試驗組1、3、4的疫苗保存在2°C 8°C條件下，於保存期的第6個月、第12個月、第18個月、第24個月、第30個月定期取出觀察其性狀。檢驗結果上述條件下保存的疫苗在30個月內性狀均沒有發生變化，表明本發明製備得到的疫苗性狀穩定、質量可靠。3.疫苗保存期試驗試驗方法將試驗組1、2、3的疫苗和對照組1、2的疫苗保存在2°C 8°C條件下於保存期的第6個月、第12個月、第18個月、第24個月、第30個月，以及37°C條件下，與保存期的第7天、第15天將試驗組和對照組的疫苗分別取出，用注射用水稀釋至I頭份/mL，肌肉接種仔豬，間隔7 14天同劑量再免疫一次，分別於免疫後的第21天進行耳靜脈採用，用豬瘟病毒IgG抗體ELISA試劑盒測定血清抗體效價。血清抗體效價判定標準如下陰性對照正常情況下，陰性對照孔OD45tl值彡0. 15 ;陽性對照正常情況下，陽性對照孔OD45tl值彡0. 5。結果判定樣品OD45tl值大於0. 38，判為陽性；樣品OD45tl值在0. 2到
0.38之間，判為可疑；樣品OD450值小於0. 2，判為陰性。實驗結果在2°C 8°C和37°C保存條件下，血清抗體效價的測定結果見表1、2。表12 V 8 °C保存條件下的血清抗體效價
權利要求
1.一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑，其特徵在於，由以下重量百分含量的組分組成海藻糖5 10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2 3%，明膠I 2%，穀氨酸鈉I 3%，D-山梨醇.2 5%，多聚蛋白腖4 5%，L-精氨酸0. 5 1%，維生素C 0. 5 1%，餘量為注射用水。
2.一種如權利要求I所述的耐熱凍幹保護劑的製備方法，其特徵在於，具體步驟如下 (1)按所述重量配比稱取聚乙烯吡咯烷酮、明膠、D-山梨醇、多聚蛋白腖溶於少量注射用水中，滅囷後備用； (2)按所述重量配比稱取海藻糖、穀氨酸鈉、L-精氨酸、維生素C溶於少量注射用水中，過濾除囷後備用； (3)將步驟(I)、(2)製得的溶液混合，加注射用水至全量即得。
3.—種如權利要求I所述的耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟疫苗方面的應用，其特徵在於，包括將本發明耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以I: (0. 8 I. 2)的體積比混合，力口入抗生素，分裝，冷凍乾燥。
4.根據權利要求3所述的耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟疫苗方面的應用，其特徵在於，所述的抗生素為氨苄青黴素、硫酸鏈黴素中的一種。
5.根據權利要求4所述的耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟疫苗方面的應用，其特徵在於，所述的氨節青黴素的加入量為每暈升10000 20000U。
6.根據權利要求4所述的耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟疫苗方面的應用，其特徵在於，所述的硫酸鏈黴素的加入量為每暈升10 20mg。
7.根據權利要求3所述的耐熱凍幹保護劑在製備豬瘟疫苗方面的應用，其特徵在於，所述的冷凍乾燥的具體步驟為將混合液置入0°C 4°C的凍幹箱中，以TC 2°C /min的降溫速率降至_30°C -40°C，在此溫度下維持3 4h，開啟真空泵，至箱內真空度達.0.Olmber時開始升溫，在16 24h範圍內升至_8°C _4°C，再以5°C 8°C /h的升溫速率升至20°C 25°C，在此溫度下維持3 6h。
全文摘要
本發明公開了一種豬瘟活疫苗耐熱凍幹保護劑及其製備方法和應用。該耐熱凍幹保護劑由海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明膠、穀氨酸鈉、D-山梨醇、多聚蛋白腖、L-精氨酸、維生素C和注射用水組成，經溶解、除菌製得。將該耐熱凍幹保護劑與豬瘟病毒抗原液以1:(0.8～1.2)的體積比混合，分裝後冷凍乾燥即得豬瘟活疫苗。本發明製備的耐熱凍幹保護劑配方簡單，製備容易，適於大規模生產，對疫苗具有良好的保護功效。製備得到的疫苗安全無菌、質量穩定，具有耐熱、保存時間長的特點，解決了疫苗在運輸過程中需要低溫冷凍、貯存不方便等問題。本發明的耐熱凍幹保護劑可以使豬瘟活疫苗在2℃～8℃條件下保存30個月以上。
文檔編號A61K47/42GK102793927SQ20121031218
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月29日 優先權日2012年8月29日
發明者吳紅雲, 徐進, 範金紅 申請人:鄭州后羿製藥有限公司