黑骨藤提取物的製備方法及其產品和用途的製作方法

2023-09-17 21:33:45

專利名稱：黑骨藤提取物的製備方法及其產品和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種黑骨藤提取物的製備方法及其產品和用途，屬於中藥技術領域。
背景技術：
黑骨藤(Periploca forrestii Schltr.)是蘿摩科槓柳屬，西南槓柳的根莖,具有通經活絡、祛淤止痛、祛風除溼的功效，是民間廣泛應用於治療閉合性軟組織損傷、風溼與類風溼等疾病的民族藥。黑骨藤是千百年來苗族人用以治療風溼、類風溼疾病及頸肩臂腰腿疼痛的藥中極品，「苗藥三珍寶，黑骨藤、銀杏、結石草」在民間廣為流傳，因黑骨藤使用方便，效果十分明顯，所以又有「苗藥三珍寶，首為黑骨藤」的美譽。黑骨藤生長於山野疏林中，分布於貴州、廣西、雲南、西藏等地，植物資源比較豐富。近年來對黑骨藤已有一定的研究，其主要化學成分有萜類、黃酮類、留體類、強心苷以及揮髮油等多類化合物。黑骨藤作為貴 州苗族道地藥材，有廣泛的生物活性，近年來，已經得到省內各大藥廠的充分利用和開發，以黑骨藤為主的中藥複方製劑相繼出現，主要表現在對風溼病、類風溼病的治療，顯示出良好的發展前景，有「黑骨藤追風活絡膠囊」、「黑骨藤伸筋透骨液」、「黑骨藤傷溼帖」等。專利申請03146799. 7公開了一種黑骨藤提取物，其藥物組合物及其藥物用途，該申請涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有該提取物的藥物組合物，以及該提取物用於製備治療自身免疫性疾病或炎性疾病藥物的用途。但是該申請僅採用溶劑對黑骨藤藥材進行提取，提取液直接濃縮，所得提取物的成分以及藥理活性不夠確切。專利申請200710188099. 2公開了一種黑骨藤的多糖提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和用途。該申請中黑骨藤多糖的主要成分為由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩爾比組成的多種均一分子量多糖，其分子量分布為 4X103 2. 7父105，包括0. 41X104、1. 06X 104、0. 64X 104、0. 56X 104、I. 36 X IO4和I. 54X IO4的多糖。該發明的主要目的是提取黑骨藤中的多糖類化合物，多糖類化合物通常具有提高機體免疫能力方面的作用。雖然該申請公開了黑骨藤多糖提取物可用於製備治療類風溼性關節炎的藥物用途，但在其說明書的生物活性實驗部分並沒有明確驗證該黑骨藤多糖提取物對類風溼性關節炎的藥理活性。

發明內容
本發明的目的在於提供一種黑骨藤提取物的製備方法及其產品和用途。本發明採用醇提水沉法對黑骨藤藥材進行提取，並對提取工藝進行了優化，所得提取物主要含有黃酮類和三萜類化合物，實驗證明其對類風溼關節炎有良好的治療作用。本發明的技術方案黑骨藤提取物的製備方法為取黑骨藤藥材，加入8-12倍重量60% -80%的乙醇，在70-80°C水浴中回流提取1-3次，每次l_3h，濾過，合併濾液，濃縮至相對密度為I. 2-1. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水，冷藏並靜置12-48h，取上清液，回收乙醇，濃縮，乾燥，即得。優選的製備方法為取黑骨藤藥材，粉碎，過60目篩，加入8倍重量80%乙醇，在70°C水浴中回流提取2次，每次2h，濾過，合併濾液，濃縮至相對密度為I. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水，冷藏並靜置24h，取上清液，回收乙醇，濃縮，乾燥，即得。
前述黑骨藤提取物的製備方法製備得到的黑骨藤提取物。該提取物中主要含有三萜類化合物(如a -香樹脂醇乙酸酯、P -香樹脂醇、熊果酸、P -香樹脂醇乙酸酯、27-羥基-a -香樹脂醇、3 @ -乙醯基-烏蘇-12-烯-11-酮、3 @ -羥基-齊墩果-11，13 (18)- 二烯-28-羧酸、3-0-乙醯基齊墩果酸、a -香樹脂醇、齊墩果酸、烏蘇-14-烯_3_醇_1_酮、蒲公英甾醇、Jacoumaric acid、2 a，3 0 - 二輕基熊果酸)、黃酮類化合物(如山柰酹、槲皮素、槲皮素-3-0- P -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酹-3-0-^ -D-半乳糖苷、槲皮素-3-0-a -L-卩比喃阿拉伯糖苷、proanthocyanidin A2)、甾類化合物(如P -谷留醇、P -胡蘿蔔甙、滇槓柳苷元A、槓柳甙元)、蒽醌類化合物(如大黃素、大黃素甲醚-8-0-3 -D-葡萄糖苷、大黃素-8-0-3 -D-葡萄糖苷)、苯丙素類化合物(如東莨菪素、反式對羥基肉桂酸、咖啡酸)和神經醯胺類化合物(如1-0-0-D-葡萄糖-(2S，3S，4R，10E) -2-[ (2R) -2-羥基二十四烷醯氨基]_10_ 十八烷-3，4- 二醇、(2S，3S，4R, 10E) -2-[ (2R) -2-輕基二十四燒醯氨基]-10-十八燒-1,3,4- 二醇)。前述黑骨藤提取物中總黃酮類化合物的含量為20% -40% ;三萜類化合物的含量為 15% -40%。前述黑骨藤提取物在製備治療類風溼關節炎的藥物中的用途。為了確保本發明的效果，申請人在研發過程中進行了一系列的試驗研究，主要相關試驗內容如下一、藥效學研究I.實驗材料I. I 藥物I. I. I受試藥物HGT1、HGT2、HGT3、HGT4、HGT5樣品，實驗時用蒸餾水製成所需濃度混懸液，置於冰
箱妥善保存，供實驗備用。其中HGTl的製備同專利申請031467997中實施例2所述黑骨藤乙醇提取物的製備。HGT2 (醇提物)的製備取黑骨藤藥材粉碎成粗粉，稱取500g，加10倍量80%的乙醇，回流提取3次，每次2h，濾過，合併濾液，減壓濃縮至無醇味，減壓乾燥，即得。HGT3 (水提物)的製備取黑骨藤藥材500g，加12倍量水煎煮3次，每次2h，濾過，合併濾液，濃縮，乾燥，即得。HGT4(醇提水沉物)的製備取黑骨藤藥材粉碎成粗粉，稱取500g，加10倍量80%的乙醇，回流提取3次，每次2h，濾過，合併濾液，減壓濃縮至無醇味；濃縮液中緩緩加入等量新鮮熱蒸餾水(70°C )，不斷攪拌，使之充分混合溶解，靜置48h以上，待沉澱完全，過濾至濾液澄明，減壓乾燥，即得。HGT5(醚提物)的製備取黑骨藤藥材500g，加12倍量石油醚回流提取3次，每次2h,濾過，合併濾液，回收石油醚，濃縮，乾燥，即得。I. I. 2 陽性藥風溼骨痛膠囊由安徽精方藥業有限公司提供，批號100902，口服膠囊劑型，每粒裝重0. 3g，每日3次，每次兩粒，成人臨床日用劑量(成人體重60kg計算)0. 03/kg ;腸溶阿司匹林片，南京第二製藥廠，批號20100402，成人劑量按每日3g計算。I. I. 3佐劑弗氏完全佐劑(美國SIGMA)。I. 2 動物Wistar大鼠，SPF級，體重180±20g，早$各半，由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所醫學實驗動物中心提供，許可證(附後)SCXK (渝)2001-0005。I. 3 儀器
電子天平HZT-B500 :美國康州HZ電子科技有限公司提供；紫外分光光度計澳大利亞照生有限公司提供。X光攝影儀日本富士 FCR. XG5000攝影機。病理切片分析儀0LYMPUS-BX50顯微鏡、HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統。軟尺(藥理教研室自製)。I. 4實驗場地貴陽中醫學院基礎醫學功能實驗室室內溫度25_27°C，相對溼度50_70%。2.實驗方法2. I動物分組及陽性藥取220隻Wistar大鼠，隨機分為22組，雌雄各半，分別為空白對照組、模型對照組、陽性藥對照組(風溼骨痛膠囊0. 21g/kg體重，即為成人日用劑量的7倍；阿司匹林組為0. 35g/kg體重，為成人劑量的7倍)。HGTl樣品高、中、低劑量組分別為0. 2190g/kg體重、0. 1095g/kg體重、0. 0547g/kg體重；HGT2樣品高、中、低劑量組分別為0. 1960g/kg體重、0. 0980g/kg體重、0. 0490g/kg體重；HGT3樣品高、中、低劑量組分別為0. 3284g/kg體重、0. 1642g/kg體重、0. 0821g/kg體重；HGT4樣品高、中、低劑量組分別為0. 0168g/kg體重、0. 0084g/kg體重、0. 0042g/kg體重；HGT5樣品高、中、低劑量組分別為0. 074g/kg體重、0. 037g/kg體重、0. 018g/kg體重。給藥途徑為ig灌胃，容量均為10ml/kg體重。按性別分籠餵養。2. 2AA大鼠造模方法除空白對照組外，其餘各組大鼠均以佐劑0. Iml注射於左足蹠皮下製做AA大鼠模型。2. 3觀察指標2. 3. I觀察AA大鼠原發性(急性)炎症期反應於造膜後6h、第Id、第2d、第3d、第4d、第5d、第6d每天上午8:00用軟尺由專人測量各大鼠左足蹠周長(mm)。2. 3. 2觀察AA大鼠繼發性(免疫性)炎症期反應於造模後第8d開始採用隔日分別測量各AA大鼠右踝關節周長。2.3.3記錄各鼠體重(以此調整ig給藥劑量及觀察動物增長發育情況)及空白對照組大鼠踝關節周長，以此作為正常對照，觀察藥物對AA大鼠體重變化的影響。2. 3. 4實驗第24d，各組大鼠禁食不禁飲12h，分別稱各組大鼠體重後，股靜脈放血處死動物；剪取胸腺、脾臟、腎上腺分別稱重，計算臟器係數。2. 3. 5剪取左下肢進行X光影像攝影，觀察各鼠踝關節影像變化；剝去左踝關節皮膚後，放入盛有生理鹽水5ml試管內，靜置12h，離心，取上清液，置入波長278nm處測量踝關節炎症物質PGE2 (前列腺素E2)含量，觀察藥物對PGE2釋放影響。2. 3. 6將各鼠右踝關節分別放入10%甲醛溶液IOml內固定，經過脫鈣、蠟埋等步驟進行踝關節病理切片、觀察踝關節病理組織形態變化(專業人員進行此項檢驗，圖片參見附圖
5-圖9)。3.實驗結果3. IHGT樣品對AA大鼠原發性關節炎腫脹的影響以佐劑注射於大鼠足蹠皮下製做AA大鼠，經佐劑注射大鼠足蹠皮下後，其大鼠踝關節周長與致炎前比較明顯增加，P < 0. 05，出現紅、腫、熱、痛關節炎症狀，表明AA大鼠造模成功。造模後6h至6d的觀察結果表明樣品HGTl高劑量在第5、6天有一定抑制關節炎腫脹的作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT2低劑量在第3、5、6天有一定作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT3高、低劑量在第5、6天有一定作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT4的各劑量組在整個過程中均顯示出抑制AA大鼠關節炎腫脹的作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT5高劑量在第5、6天顯現出抑制關節腫脹的作用(與模型組比較P< 0. 05)。結合整個原發階段中AA大鼠關節腫脹的改變以及藥物作用的連續性，樣品HGT4、HGT5具有穩定的減輕AA大鼠關節腫脹的作用。其結果見表I :表IHGT對AA大鼠原發性關節炎腫脹的影響(X 土 s，n = 10)、~AA造模後踝關節周長(mm)
組別 _!_!_!_!_!_!_!_
Oh 6h 24h d2 d3 d4 d5d6
^ 25. 40士 25. 40士 25. 40士 24. 27士 24. 19士 24. 40士 24. 07士24. 15士
0. 72 0.72* 0.72* 0. 68^ 0.59* 0.52* 0.63*0.59*
爐刑細 25.46+ 34. 25+ 34. 34+ 33. 84+ 32. 65+ 32. 23+ 31.43+31. 02 +
0. 84 0. 82 0. 63 I. 03 0. 66 0.70 0. 240.42 25. 30+ 33. 73+ 33. 18+ 32. 38+ 31. 29+ 30. 65+ 30. 10 土30. 26 +
IJ 口 JUWi Q 99 0.88 0.77* 0.83* 0.77* 0.49 0.51*0. 38
57|,)h^^h 25. 37+ 33. 80+ 33. 69+ 33. 57+ 32. 83+ 32. 07+ 31 . 123 0.94
JXIjM ^ o 35 0. 87 I. 03 I. 52 2.14 2. 34 ±1.15±0.74
古 25. 35+ 33.40+ 33. 24 土32. 94+ 31. 77 土31. 14+ 30. 20+30. 16 +
0. 86 I. 95 1.53* I. 53 I. 69 I. 20 0. 58*0.61*
由 25. 00+ 34. 3+ 33. 82+ 32. 82+ 32. 19+ 32. 27+ 30. 59+30. 37 + T 0. 68 0. 87 I .05 0.99 0.94 I. 58 1.070. 86
伸 24794+ 34. 58+ 33. 63+ 33. 64+ 32.48+ 32. 39+ 30. 67+30. 19 +
0. 75 I .07 0.99 I. 17 1.45 I. 89 I. 090. 66
古 25.41+ 3 3.67 33. 88+ 33. 33+ 32. 25+ 31. 57+ 30. 78+30. 82 +
1.14 ±2.27 1.87 2. 18 2. 15 2. 25 1.401.49
由 24795+ 33. 99+ 33. 91+ 33. 22+ 32. 79+ 32.49+ 30. 87+30. 85 +
°- 83 I- 21 I. 24 I. 29 0. 96 1.73 I. 030. 95
L0050」 併 25. 17+ 33. 92+ 33. 38+ 32. 81+ 31. 39+ 31. 6+ 30. 37+30. 15 +
0.17 I. 78 0. 88 0. 61 0.77* I. 66 I. 05*0.77*
古 24792+ 33. 02+ 33.49+ 32. 80+ 32. 14+ 31. 34+ 30.40+30. 11 +
0. 55 1.26* I. 00 I. 37 I. 82 I. 85 1.70*I. 18^
由 24. 88+ 33. 64+ 34. 03+ 33. 33+ 32.48+ 31. 22+ 30. 58+30. 20 +
T__0. 65 I. 08 I. 06 I . 11 I. 06 I. 11 0. 990. 67
併 24. 90+ 33. 94+ 33. 39+ 32. 38+ 31. 20+ 30. 23+ 29. 74+29. 96 +
0. 86 0. 72 0. 87 1.03* 0. 65^ 0.59* 0.49*0.64*
古 24794+ 33.40+ 33. 05+ 32. 80+ 32.46+ 31.4+ 30. 22+30. 03士
問__0. 35 I. 37 0.98* 0. 91 I . 64 I. 36 0.80*0.88*
由 24. 83+ 33. 58+ 33. 59+ 32. 62+ 31. 34+ 30. 82+ 30. 29+30. 02 +
T 0.42 0. 86 0. 90 1.06* 0. 53 0.67* 0. 920.72*
併 25. 25+ 33. 91+ 33. 69+ 33. 08 土31. 72+ 31. 12+ 29. 89+29. 99 +
低__0.75 I. 54 0. 99 I. 26 0. 97 I. 16 0.45*0.37*
古 25. 11+ 32. 8+ 33. 37+ 32. 82+ 32. 07+ 31 .09 30. 10+29. 97 +
0. 64 1.61* I. 03 I. 35 I. 52 ±1.50 I. 35^1.16*
由 25. 14+ 33. 14+ 33. 29+ 33. 82 土32. 69+ 31. 53+ 31. 30+30. 62 +
T 0. 72 1.00 1.40* I. 52 2. 18 2. 56 2. 31I. 86
併 25. 16+ 34. 32+ 33. 82+ 33. 39+ 32.45+ 31. 90 土30. 75+30. 50 +
1fe I 0. 61 I 1.44 I 0. 86 I 0. 86 | I. 64 | 2. 22 | 1.53*| I. 32
注*與模型組比較P〈0.05。_3. 2HGT樣品對AA大鼠繼發性反應影響3. 2. I造模後第8d-24d為AA大鼠繼發性反應的階段，會出現大鼠注射佐劑對側關節的腫脹。自第8天開始，每2天測量大鼠右側關節，觀察樣品對繼發性關節炎關節腫脹的影響。結果表明樣品HGT2低劑量在一段時間內(8-20天)有一定作用(與模型組比較P 0. 05)，樣品HGT4的各劑量組在整個過程中均顯示出抑制AA大鼠關節炎腫脹的作用(與模型組比較P <0.05)。結合整個繼發性關節炎腫脹階段中AA大鼠關節腫脹的改變以及藥物作用的連續性，樣品HGT4具有穩定的減輕AA大鼠繼發性關節腫脹的作用，結果見表2 表2HGT對AA大鼠繼發性右踝關節腫脹的影響(I土s，n = 10)
權利要求
1.一種黑骨藤提取物的製備方法，其特徵在於取黑骨藤藥材，加入8-12倍重量60% -80%乙醇，在70-80°C水浴中回流提取1-3次，每次l_3h，濾過，合併濾液，濃縮至相對密度為I. 2-1. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水，冷藏並靜置12-48h，取上清液，回收乙醇，濃縮，乾燥，即得。
2.根據權利要求I所述黑骨藤提取物的製備方法，其特徵在於取黑骨藤藥材，粉碎，過60目篩，加入8倍重量80%乙醇，在70°C水浴中回流提取2次，每次2h，濾過，合併濾液，濃縮至相對密度為I. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水,冷藏並靜置24h，取上清液，回收乙醇，濃縮，乾燥，即得。
3.如權利要求I或2所述黑骨藤提取物的製備方法製備得到的黑骨藤提取物。
4.根據權利要求3所述的黑骨藤提取物，其特徵在於提取物中含有三萜類化合物、黃酮類化合物、留類化合物、蒽醌類化合物、苯丙素類化合物和神經醯胺類化合物。
5.根據權利要求4所述的黑骨藤提取物，其特徵在於所述三萜類化合物包括a-香樹脂醇乙酸酯、3 -香樹脂醇、熊果酸、3 -香樹脂醇乙酸酯；所述黃酮類化合物包括山柰酚、槲皮素、槲皮素-3-0-0 -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-0-a -L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酚-3-0- ^ -D-半乳糖苷、槲皮素-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖苷。
6.根據權利要求4或5所述的黑骨藤提取物，其特徵在於提取物中總黃酮類化合物的含量為20% -40%。
7.根據權利要求4或5所述的黑骨藤提取物，其特徵在於提取物中三萜類化合物的含量為15% -40%。
8.如權利要求3-7中任一項所述黑骨藤提取物在製備治療類風溼關節炎的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種黑骨藤提取物的製備方法及其產品和用途；該製備方法為取黑骨藤藥材，加入8-12倍重量60％-80％乙醇，在70-80℃水浴中回流提取1-3次，每次1-3h，濾過，合併濾液，濃縮至相對密度為1.2-1.5，再加入1倍體積量的水，冷藏並靜置12-48h，取上清液，回收乙醇，濃縮，乾燥，即得。本發明採用醇提水沉工藝對黑骨藤藥材進行提取，並對醇提、水沉工藝參數分別進行了優化；所得提取物主要含有黃酮類和三萜類化合物，實驗證明其對AA大鼠原發性及繼發性炎症反應具有明顯的治療作用，在抗炎、消腫以及延緩AA大鼠關節炎損傷方面有較好作用；因而可將該提取物應用於類風溼關節炎藥物的製備中。
文檔編號A61K36/27GK102631390SQ20121010572
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者周欣, 趙楊, 趙超, 陳華國, 龔小見 申請人:貴州師範大學