一種藥物組合物及製備方法
2023-09-17 21:14:50 3
專利名稱：一種藥物組合物及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物，尤其是含藥物化超細粒子的藥物組合物。本發明還涉及本發明藥物組合物的製備方法。
背景技術：
本發明中所用術語「藥物分子」，是指對生物具有特定的預防和/或治療功能的藥物分子，例如疫苗、治癌藥物分子等等；術語「藥物組合物」是指含藥物分子和與藥物分子結合的、具有特定功能的非藥物分子物質(例如佐劑、輸運載體、緩釋介質等等)的組合物。以下以疫苗為例，陳述藥物組合物的現狀與尚待解決的問題。
本發明中所用術語「超細粒子」，是指在液相中以固相形式存在的、平均粒徑在1nm至10μm之間的微小粒子，包括膠體、微米粒子、或納米粒子；所用術語「藥物化超細粒子」，是指固定有藥物分子的超細粒子。
本發明中所用術語「疫苗」，是指可以誘導針對致病原的特異性抗體和細胞免疫，或其它免疫狀態，從而獲得保護或消滅這種致病原或消除這種病態的因子，如蛋白、多糖、核酸、活載體或感染因子。疫苗可以分為幾類，一類是病毒的滅活疫苗，就是獲得病毒以後經過一些方法的處理，讓它完全喪失活性。第二類是減毒疫苗，也就是降低微生物對宿主的毒力，把它做成疫苗。第三類是基因工程和化學合成疫苗，即使用基因工程和化學合成的方法，生產出與免疫源相同的特異抗原片斷蛋白質、多糖或表達特異抗原片斷蛋白質的DNA，再將其導入機體或細胞，使之產生針對這一段免疫源的蛋白的抗體，來達到獲得保護或消滅這種致病原或消除這種病態因子的目的。疫苗包括用於人和動物的DNA疫苗、蛋白質/多肽疫苗、多糖疫苗，重組疫苗、亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒活疫苗、黏膜疫苗，單價或多價、單聯或多聯疫苗。從劑型上看，包括片劑、口含劑、栓劑、水針劑、透皮劑、滴鼻劑、氣溶膠或噴霧劑型。
為了獲得疫苗更好的免疫效果，許多疫苗使用了佐劑。佐劑是一類與免疫原結合使用而能增強免疫效果的物質。隨著疫苗和佐劑技術的發展，免疫接種也不再局限於用來預防感染性疾病，癌症、自身免疫性疾病、毒品依賴和其它一些疾病以及過敏、寄生蟲也可通過運用對特異性抗原建立免疫的概念來進行治療和預防，還可以運用對特異性抗原建立免疫的概念來進行避孕。
以超細鋁鹽粒子為佐劑的疫苗組合物己大量用於臨床。儘管鋁鹽佐劑已由大量的臨床驗證證明了其安全性，但其免疫效率卻不能令人滿意，尤其是各種小分子多肽抗原和多糖疫苗免疫效率尚有待提高。因此，發展出了油性佐劑、脂肪族佐劑、聚合物表面活性劑、聚微粒載體佐劑、植物佐劑、細菌佐劑、人工合成佐劑、細胞因子佐劑、核酸佐劑、納米佐劑等等。對目前含超細粒子的疫苗組合物而言，抗原和超細粒子之間的結合形式，基本上基於物理化學吸附。這種結合形式並不穩定。然而，在以這種不穩定結合形成的含超細粒子的疫苗組合物中，這種不穩定性被賦與「緩釋」的作用。這種不穩定性，有可能在體內不同的生理、生物環境中產生不確定性。對其它藥物組合物而言，也有類似問題。因而，提高藥物組合物的確定性，有可能是提高其安全性和效率的一條重要途徑。
發明內容
本發明的主要目的在於提供一種具有穩定的、定量的化學組成的藥物組合物，從而提高藥效、或/和安全性、或/和降低藥物分子耗量、或/和增加藥物組合物選擇性。
本發明的另一個目的是提供具有確定化學組成的藥物組合物的製備方法。
本發明的目的是通過實施下述技術方案來實現的一種藥物組合物，其特徵在於至少含高穩定、高效率藥物化超細粒子，其中所述高穩定、高效率藥物化超細粒子，是指超細粒子和藥物分子之間以共價鍵結合、且每mg超細粒子上共價鍵合的藥物分子的平均值大於20ug的顆粒。此處「共價鍵合」是指在高鹽濃度(例如≥1.0M NaCl)下不分離的結合。
正如本發明實施例所述，同不具備本發明技術特徵的藥物組合物相比，本發明的藥物組合物可以有明顯較高的反應效率，或/和明顯較低的藥物分子耗量，或/和明顯較低的超細粒子耗量，從而明顯增加藥物組合物的安全性。
一般而言，含藥物化超細粒子的藥物組合物，是含藥物化超細粒子的混合物，因其可能還含有或多或少未結合成藥物化超細粒子的藥物分子、和或多或少基本上未結合成藥物化超細粒子的超細粒子。即使純化，也只是使某一組分比例儘可能大或小。於是，本發明藥物組合物還包括有另一項方案一種藥物組合物，其特徵在於在該藥物組合物中，未結合在超細粒子上的藥物分子的含量小於藥物分子總量的5％，且非穩定、高效藥物化超細粒子的含量，小於穩定、高效藥物化超細粒子的含量。在本發明實施例的一項方案中，非穩定、高效藥物化超細粒子的含量小於穩定、高效藥物化超細粒子含量的50％、優選小於藥物化超細粒子的含量的30％。
本發明中所述「非穩定、高效藥物化超細粒子」是指穩定、高效藥物化超細粒子之外的超細粒子，包括未結合成藥物化超細粒子的超細粒子，和雖結合成藥物化超細粒子，但其組成不是穩定、高效藥物化超細粒子組成的超細粒子。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述組成穩定高效的藥物化超細粒子，其藥物分子與超細粒子間的共價鍵合，是活化超細粒子與藥物分子之間的共價鍵合。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述活化超細粒子，是指超細粒子與偶聯基團之間的共價鍵合，以及偶聯基團與活化基團之間的共價鍵合所生成的粒子衍生物。
於是，高穩定、高效率藥物化超細粒子，是將藥物分子定量地共價鍵合在活化超細粒子上形成的。本發明中「活化超細粒子」是指經在其表面定量地共價鍵合有活性基團的超細粒子。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述超細粒子與活化基團之間的共價鍵合，包括超細粒子與偶聯基團之間的共價鍵合，及偶聯基團與活化基團之間的共價鍵合。偶聯基團的引入，往往有利於提高活化基團的反應性。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述活化基團包括不含氨基的有機基團。在本發明實施例的一項方案中，所述不含氨基的有機基團，包括醛基和環氧基。其它基團，例如巰基，也可應用在本方案中。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述活化基團包括氨基。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述超細粒子與活化基團之間的共價鍵合包括超細粒子與偶聯基團之間的共價鍵合，和偶聯基團與活化基團之間的共價鍵合；這裡所用偶聯基團的平均分布密度，大於1.85μmol/m2超細粒子表面，或/和當所述活化基團為氨基或不含氨基的有機基團時，活化基團的平均分布密度，大於1.85μmol/m2超細粒子表面。
在本發明藥物組合物的一項方案中，上述偶聯基團包括有機矽偶聯基團。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述活化基團包括通式為-RNH2的基團，其中R為有機基團。
在本發明實施例的一項方案中，所述通式為-RNH2的基團包括氨基肼基團。
在本發明實施例的一項方案中，所述通式為-RNH2的基團包括胺基酸基團。
在本發明實施例的一項方案中，所述胺基酸基團包括精氨酸基團、天冬醯氨基團、甘氨酸基團。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述通式為-RNH2的基團的平均分布密度，大於0.5μmol/m2超細粒子表面。
在本發明藥物組合物的一項方案中，所述通式為-RNH2的基團的平均分布密度，大於1.0μmol/m2超細粒子表面。
在本發明藥物組合物的一項方案，為疫苗組合物，該組合物中的藥物分子包括抗原。
在本發明藥物組合物的一項方案中，作為藥物組合物組份的超細粒子，包括無機超細粒子。
在本發明實施例的一項方案中，所述無機超細粒子，包括金屬鹽超細粒子。
在本發明實施例的一項方案中，所述金屬鹽超細粒子，包括鋁鹽超細粒子、矽鹽超細粒子、鈦鹽超細粒子、金超細粒子。
在本發明藥物組合物的一項方案中，作為藥物組合物組份的超細粒子，包括膠體。
在本發明藥物組合物的一項方案中，作為藥物組合物組份的超細粒子，包括納米粒子，這種納米粒子是指在三維空間中至少有一維限度小於500nm的固相載體粒子。優選為小於100nm、更優選為小於50nm的固相載體粒子。表32.葛仙丹顆粒對大鼠體外血栓形成的影響(X±SD)
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表32可見，與對照組比較，葛仙丹顆粒10g生藥/kg劑量組的血栓長度顯著縮短(P＜0.001)，血栓溼重和乾重顯著減輕(P＜0.001)；葛仙丹顆粒5g生藥/kg劑量組的血栓長度明顯縮短(P＜0.05)，血栓溼重和乾重明顯減輕(P＜0.05)，葛仙丹顆粒2.5g生藥/kg劑量組的血栓長度、溼重及乾重均無明顯變化；阿司匹林組的血栓長度顯著縮短(P＜0.001)，血栓溼重和乾重顯著減輕(P＜0.05～0.01)。
2)對血液粘度的影響，見表33。
表33.葛仙丹顆粒對大鼠血液粘度的影響(n＝10，X±SD)
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表33可見，與對照組比較，葛仙丹顆粒10g生藥/kg劑量組大鼠的全血粘度在切變率5S-1、30S-1及100S-1下均明顯降低(P＜0.05～0.01)，在切變率200S-1下顯著降低(P＜0.001)；葛仙丹顆粒5g生藥/kg、2.5g生藥/kg劑量組大鼠的全血粘度在切變率100S-1和200S-1下均明顯降低
本實施例中，所用偶聯劑如表2所示。本發明中，偶聯劑為含偶聯基團的試劑。
表2
2).進行超細粒子、偶聯基團和活化基團間的其價鍵合反應本實施例中，超細粒子、偶聯基團和活化基團間的共價鍵合反應一般包括(1).去離子處理本實施例中，先製備超細粒子懸浮液，其中超細粒子濃度(w/v)在5-30％之間。如有必要，可進行去離子處理，例如選用已知的離子交換層析方法，將超細粒子懸浮液中的陰、陽離子分別去除，然後對懸浮液進行離心(2-8℃，20000g)並獲得超細粒子沉積物。本實施例中，新製備的超細粒子(氧化鋁超細粒子或金超細粒子)未經此步驟處理，而直接進行化學改性。
(2).在超細粒子表面共價鍵合偶聯劑將上述超細粒子沉積物製成超細粒子懸浮液，並與偶聯劑溶液混合、反應。通過調節公知的反應控制條件(例如反應物濃度，反應介質，反應溫度，反應時間等等)可以控制反應。本實施例中共價鍵合反應時，超細粒子的濃度(w/v)在5％至5‰之間調節；偶聯劑濃度(v/v)在1％至5％之間調節；反應介質為含水的甲醇；反應溫度在室溫至反應介質沸點以下5℃之間調節；反應時間在0.5至2小時之間調節。本專業的技術人員通過調節這些參數可獲得所需的優化條件。要強調的是，偶聯劑與超細粒子間的鍵合反應，是能否獲得本發明的藥物組合物的關鍵步驟之一。
反應完成後，對懸浮液進行多次離心(2-8℃，20000g)以去除未結合在超細粒子上的反應物和反應介質，然後獲得以DMF為分散介質的超細粒子懸浮液。
本實施例中，通過調節偶聯反應參數獲得不同的結合有偶聯基團的超細粒子。一些超細粒子在元素分析中的氮含量在0.25-0.65N％之間變動，理論上相當於1g超細粒子上固定的偶聯基團在179-464μmol之間變動，或1m2超細粒子表面上固定的偶聯基團在1.3-3.4μmol之間變動。本實施例中，只有當偶聯基團含量超過一個最低含量時，超細粒子才能滿足本發明的方法的要求，被用以進一步製備本發明的活化超細粒子。具體而言，這個最低含量是指元素分析中的氮含量大於0.35N％、優選大於0.5N％(或1g超細粒子上固定的偶聯基團大於250μmol、優選大於357μmol，或1m2超細粒子表面上固定的偶聯基團大於1.85μmol、優選大於2.64μmol)。此外，偶聯基團的含量也用其它方法(例如元素分析中的碳含量)測定、計算，但本質上是一樣的。
(3).將活化基團共價鍵合至偶聯基團上本實施例中，當偶聯劑中不含活化基團時，活化超細粒子的製備還包括將活化基團共價鍵合至偶聯基團上。方法為將超細粒子懸浮液與活化劑溶液(例如以DMF為溶劑)混合、反應。通過調節公知的反應控制條件(例如反應物濃度，反應介質，反應溫度，反應時間等等)可以控制反應。本專業的技術人員通過調節這些參數可獲得所需的優化條件。此一共價鍵合反應，也是能否獲得本發明藥物組合物的關鍵步驟之一。
反應完成後，對懸浮液進行多次離心(2-8℃，20000g)以去除未結合在超細粒子上的反應物和反應介質，然後獲得超細粒子的懸浮液。若活化劑含保護基團(例如Fmoc)，還要脫去這些保護基團。脫保護方法選自己知的肽合成中的脫保護方法。
本發明的方法的另一方案，是先將活化劑(例如氨基肼)與偶聯劑(例如3-異氰酸酯丙基三乙氧基矽烷)反應，使活化基團共價鍵合至偶聯基團上，再將此一鍵合有活化基團的偶聯基團共價鍵合至無機物超細粒子表面上。製備鍵合有活化基團的偶聯基團的方法是公知方法。
更具體的製備方法由以下實施例補充。
實施例1.1活化超細粒子(活化基團為-RNH2)的製備方法表10
(*1)輪胎的內體積21升，尺寸175/70R13，輪輞5J-13(*2)在輪胎中填充中空粒子之後通過將氮氣填充入輪胎而調節內部壓力。
(*3)不小於1分鐘的時間是成功的。
(*4)評價結果A連續駕駛是可能的，沒有故障或小心持續駕駛B在處理駕駛中要求仔細和集中C要求減速運行或運行不可能(無控制)(*5)不小於30秒的時間是成功的。
表4
*偶聯後元素分析中的N百分比**與活化基團有關的元素分析氮含量(N％)＝活化超細粒子元素分析中的N百分比-未活化前含偶聯基團的超細粒子的元素分析中的N百分比實施例1.2活化超細粒子(活化基團為氨基)的製備方法本實施例中，對於以氨基(-NH2)為活化基團的活化超細粒子，在使用3-氨丙基三甲氧基矽烷或氨丙基三乙氧基矽烷時，偶聯基團與活化基團同時固定在超細粒子上，偶聯基團與活化基團在超細粒子上的分布密度相同。本實施例中，只有當氨基密度超過一個最低含量時，超細粒子才能滿足本發明的方法的要求，被選作活化超細粒子。具體而言，這個最低含量是指元素分析中的氮含量大於0.38N％、優選大於0.5N％(或1g超細粒子上固定的偶聯基團大於270μmol、優選大於357μmol，或1m2超細粒子表面上固定的偶聯基團大於2.0μmol、優選大於2.6μmol)。
實施例1.3活化超細粒子(活化基團為不含-NH2的有機基團)的製備方法本實施例中，所用活化劑分別為戍二醛和1，4-丁二醇二縮水甘油醚。本實施例的方法，也適於其它含有不含-NH2的活化基團(例如羰基、-SH基等等)的活化劑。
超細粒子上固定的偶聯劑中含氨基時，超細粒子與1，4-丁二醇二縮水甘油醚反應，在偶聯基團上共價鍵合帶有碳原子鏈的環氧基；超細粒子與戍二醛反應，在偶聯基團上共價鍵合醛基。
本實施例中，只有用所固定的偶聯劑大於1.85μmol/1m2粒子表面的超細粒子，結合活化基團製成的製備物，才被選作活化超細粒子。
需要說明的是，元素分析(Microanalysis)也許不一定是最佳方法，但在其誤差範圍內並不影響本發明的成立，既只有當活化超細粒子表面固定的功能基團、尤其是活化基團數目達到一定值時，用其與抗原一起製備的藥物組合物才具有特定的性質，從而達到本發明的目的。專業人員應當知道，儘管利用其它分析方法可能得出不同的數值，但其原則仍在本發明的權利要求之內。
實施例2藥物分子/活化超細粒子混合物的製備本發明中，藥物分子/活化超細粒子混合物，是指含藥物化超細粒子的製備物。其製備方法一般包括1).提供藥物分子和本發明的活化超細粒子本實施例中，所用活化超細粒子選自實施例1製備的合乎要求的活化超細粒子；所用藥物分子如表5所示。
表5
*製作方法參考Tranchand-Bunel，D.，Auriault，C.，Diesis，E.，Gras-Masse，H.(1998)Detection of human antibodies using「convergent」combinatorial peptide libraries or「mixotopes」designed form a nonvariable antigenApplication to the EBV viralcapsid antigen p18，J.Peptide Res.52，1998，495-508。
本實施例的方法也適於其它藥物分子，例如抗原、多糖、維生素、抗生素、功能有機物、單鏈或多鏈DNA、RNA、以及病毒、細胞或它們的組成。
本實施例的方法也適於其它藥物分子，例如藥物、多糖、維生素、抗生素、功能有機物、單鏈或多鏈DNA、RNA、以及病毒、細胞或它們的組成。
2).製備藥物化超細粒子製備方法為通過離心分離獲得活化超細粒子沉積物，再將其均勻分布在緩衝液中製成活化超細粒子懸浮液，並與藥物分子溶液混合、反應。通過調節公知的反應控制條件(例如反應物濃度，反應介質，反應溫度，反應時間等等)可以調節反應產物的組成。本實施例中反應時超細粒子的濃度(w/v)在0.1‰至1‰之間調節，藥物分子濃度在1μg/ml至1mg/ml之間調節。反應介質為緩衝液(例如PBS)；反應溫度在室溫至40℃之間調節；反應時間在0.5至24小時之間調節。本專業的技術人員通過調節這些參數可獲得滿足本發明的藥物組合物的優選條件。要強調的是，活化超細粒子和藥物分子之間的反應，也是能否獲得本發明藥物組合物的關鍵步驟之一。
反應完成後，對懸浮液進行離心(2-8℃，20000g)，取上清液測定藥物分子濃度，以測定未結合在超細粒子上的藥物分子量。其中，上清液蛋白質濃度的測定使用常規測定方法。如有必要，也可再離心(2-8℃，20000g)，以減少藥物分子/活化超細粒子混合物中未結合藥物分子。
藥物分子/活化超細粒子混合物中，也可能含非高穩定、高效率藥物化超細粒子。本實施例中，藥物分子/活化超細粒子混合物中非高穩定、高效率藥物化超細粒子的比例，可以通過公知的親和層析法來測定。例如，在B肝疫苗/活化納米粒子混合物的情況下，用特異性B肝抗體(成都生物製品研究所)作配基固定至活化層析膠上，再將混合物加入親和層析柱中，收集流過液，將流過液和藥物分子/活化超細粒子混合物懸浮液分別離心(20000g，60分鐘)，比較離心沉澱量，可得此比例。親和層析膠的製備方法及親和層析的進行方法為常規方法。如有必要，親和層析法也是獲得高穩定、高效率藥物化超細粒子的一種方法。
如有必要，還可對混合物中活化超細粒子表面進行鈍化處理。
如有必要，還加入其它添加劑。其它添加劑的例子包括糖類物質(例如葡萄糖、蔗糖、山梨醇等等)、鹽(例如氯化鈉)、胺基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸等等)。
這樣，就製備出了本實施例的藥物組合物。
本實施例中，通過調節反應參數獲得不同的藥物分子/活化超細粒子混合物。利用實施例1製備的活化超細粒子，在優化條件下製備的藥物分子/活化超細粒子混合物中1).用1.0M NaCl不能將藥物分子從超細粒子分離；2).每mg超細粒子共價鍵合的藥物分子的平均值大於20μg、甚至大於35μg、個別達到50μg。更進一步(如有必要，通過離心分離)，未結合藥物分子的含量小於5％。更進一步(如有必要，通過例如親和層析分離的分離)，非高穩定、高效率藥物化超細粒子的含量小於50％、甚至接近於0。
然而，利用弱活化超細粒子或非活化超細粒子，在相同條件下的製備中，藥物分子/活化超細粒子混合物則有與上述組成非常不同的組成。
使用表1中未經化學改性的超細粒子，與相應藥物分子製備的藥物分子/超細粒子混合物中，藥物分子也可固定在超細粒子上(本實施中稱為第一類非高穩定、高效率藥物化超細粒子)。這是一種基於物理化學吸附(例如離子吸附)的固定，並不穩定，在1.0M NaCl中大多解吸。
使用弱活化超細粒子(參考實施例1)，與相應藥物分子製備的藥物分子/超細粒子混合物中，藥物分子也可固定在超細粒子上(本實施中稱為第二類非高穩定、高效率藥物化超細粒子)。這是一種主要基於物理化學吸附(例如離子吸附)、包括部份共價鍵合的固定，穩定也不算高，在1.0M NaCl中解吸後，每mg超細粒子上固定的藥物分子的平均值小於20μg、甚至小於10μg。
更進一步，對含上述第一類或第二類非高穩定、高效率藥物化超細粒子的藥物組合物而言，未結合藥物分子的含量可以大於5％、甚至大於10％；而非高穩定、高效率藥物化超細粒子的含量可以大於50％。
從而，本發明的藥物組合物具有特別的組成，使其具有高的穩定性。下面我們將看到，它還具有高的效率。
本實施例中，更具體的製備方法由以下實施例補充。
實施例2.1藥物分子/活化超細粒子混合物的製備方法(活化超細粒子含-RNH2活化基團)本實施例中，所用活化超細粒子含-RNH2活化基團，其選自實施例1.1製備的活化超細粒子。
本實施例中每mg超細粒子共價鍵合的藥物分子的平均值大於20μg、甚至大於35μg、個別達到50μg。更進一步(如有必要，通過離心分離)，未結合藥物分子的含量小於5％。更進一步(如有必要，通過例如親和層析分離的分離)，非高穩定、高效率藥物化超細粒子的含量小於50％、甚至接近於0。
表6列出了實施例2.1中製備的部份藥物分子/活化超細粒子混合物的組成。
表6
*參考表4**(離心上清液中藥物分子含量/藥物分子總加入量)×100％***(親和層析透過液的離心沉澱量/藥物分子/活化超細粒子混合物的等體積液的離心沉澱量)×100％實施例2.2藥物分子/活化超細粒子混合物的製備方法(活化超細粒子含-NH2活化基團)本實施例中，所用活化超細粒子含-NH2活化基團，其選自實施例1.2製備的活化超細粒子。
實施例2.3藥物分子/活化超細粒子混合物的製備方法(活化超細粒子含有不含NH2的活化基團)本實施例中，所用活化超細粒子中的活化基團不含NH2，其選自實施例1.3製備的活化超細粒子。
實施例3本發明的藥物組合物的比較研究本實施例中，用作比較研究的藥物組合物包括(1).不含超細粒子的藥物(I類對照物)選自表5。
(2).基於未活化超細粒子製備的藥物組合物(II類對照物)其為實施例2中所述的含第一類非高穩定、高效率藥物化超細粒子的藥物組合物。
(3)基於弱活化超細粒子製備的藥物組合物(III類對照物)
其為實施例2中所述的含第二類非高穩定、高效率藥物化超細粒子的藥物組合物。
(4)實施例2.1製備的藥物組合物(IV類對照物)(5)實施例2.2和2.3製備的藥物組合物(V類對照物)本實施例中，未見實驗動物的死亡。
實施例3.1B肝疫苗組合物的免疫效果比較研究本實施例中，藥物組合物(上述I-V類對照物)含基因工程重組B肝疫苗(天壇生物製品股份有限公司)。上述I類對照藥物組合物中，重組B肝疫苗抗原濃度為20μg/ml。上述II-V類對照物中，重組B肝疫苗抗原濃度為1-10μg/ml，超細粒子濃度為20-200μg/ml。
本實施例中，實驗小鼠為5周齡、重18-20g的balb/c小鼠。每實驗組各8隻小鼠。在0周和3周進行免疫，每隻小鼠腹腔內注射0.1ml藥物組合物。第1針後7天第一次抽血、第21天第二次抽血、第42天第三次抽血、第63天第四次抽血。檢測免疫血樣中的HBsAb滴度。抗體檢測使用公知的ELISA方法(廈門科創生物技術有限公司)。
第一次抽血檢測結果為(1).當藥物組合物中抗原濃度、超細粒子濃度較低時(例如，重組B肝疫苗抗原濃度為4μg/ml、超細粒子濃度為80μg/ml)，免疫血樣中的HBsAb滴度，以使用本發明的藥物組合物(IV或V類對照物)者為最高，以使用基於弱活化超細粒子製備的藥物組合物(III類對照物)者次之(比前者平均低300％以上)，又以使用未活化超細粒子製備的藥物組合物(II類對照物)者更次之(比前者平均低180％以上)；(2).即使使用重組B肝疫苗抗原濃度為4μg/ml、超細粒子濃度為80μg/ml的II類對照物，與使用重組B肝疫苗抗原濃度為20μg/ml的I類對照物相比，其免疫血樣中的HBsAb滴度也更高(平均高380％以上)；(3)當藥物組合物中抗原濃度、超細粒子濃度較低時(例如，重組B肝疫苗抗原濃度為4μg/ml、超細粒子濃度為80μg/ml)，免疫血樣中的HBsAb滴度，使用本發明的藥物組合物(IV類對照物)者，比使用本發明的藥物組合物(V類對照物)者高(平均高150％以上)。
免疫血樣中的HBsAb滴度的第二次抽血檢測結果為以組成含4μg重組B肝疫苗抗原/ml和80μg超細粒子/ml的本發明藥物組合物免疫者，比以組成含10μg重組B肝疫苗抗原/ml和200μg超細粒子/ml的基於弱活化超細粒子製備的藥物組合物免疫者高，後者又比以組成含20μg重組B肝疫苗抗原/ml和400μg超細粒子/ml的基於未活化超細粒子製備的藥物組合物免疫者高，後者又比以組成僅含20μg重組B肝疫苗抗原/ml免疫者高450％以上。
免疫血樣中的HBsAb滴度的第三次抽血檢測結果為以組成含4μg重組B肝疫苗抗原/ml和80μg超細粒子/ml的本發明藥物組合物免疫者，與以組成含10μg重組B肝疫苗抗原/ml和200μg超細粒子/ml的基於弱活化超細粒子製備的藥物組合物免疫者近似，後者又與以組成含20μg重組B肝疫苗抗原/ml和400μg超細粒子/ml的基於未活化超細粒子製備的藥物組合物免疫者近似，而後者又比以組成僅含20μg重組B肝疫苗抗原/ml免疫者高450％以上。
第四次抽血檢測結果與第三次抽血檢測結果相似。
實施例3.2狂犬病純化疫苗組合物的免疫效果比較研究本實施例中，藥物組合物(上述I-V類對照物)含狂犬病純化抗原(武漢生物製品研究所)。上述I類對照藥物組合物中，疫苗抗原濃度為5IU/ml。上述II-V類對照物中，疫苗抗原濃度為2.5IU/ml，超細粒子濃度為20-200μg/ml。
本實施例中，實驗小鼠與實施例3.1相同，實驗方法與實施例3.1相同。檢測免疫血樣中的抗狂犬病毒抗體滴度。抗體檢測使用公知的ELISA方法，所用ELISA試劑盒選自北京蘭伯瑞生物技術有限公司。
抽血檢測結果與實施例3.1中抽血檢測結果一致使用較低抗原濃度、超細粒子濃度的本發明的藥物組合物(IV或V類對照物)，與使用較高抗原濃度、超細粒子濃度的III類對照物和II類對照物比較，可獲得至少相似(甚至更快)的免疫效果。
實施例3.3破傷風類毒素組合物的免疫效果比較研究本實施例中，藥物組合物(上述I-V類對照物)含破傷風類毒素(成都生物製品研究所)。上述I類對照藥物組合物中，破傷風類毒素濃度為80IU/ml。上述II-V類對照物中，破傷風類毒素濃度為10-80IU/ml，超細粒子濃度為25-200μg/ml。
本實施例中，實驗小鼠與實施例3.1相同，實驗方法與實施例3.1相同。
血樣中的抗破傷風類毒素的抗體滴度抗體檢測使用公知的ELISA方法，所用ELISA試劑盒選自商業試劑盒(上海貝西公司)。
抽血檢測結果與實施例3.1中抽血檢測結果一致使用較低破傷風類毒素濃度、超細粒子濃度(例如破傷風類毒素濃度為20IU/ml和超細粒子濃度為50μg/ml)的本發明的藥物組合物(IV或V類對照物)，與使用較高抗原濃度、超細粒子濃度(例如破傷風類毒素濃度為40IU/ml和超細粒子濃度為100μg/ml)的III類對照物和II類對照物比較，可獲得至少相似(甚至更快)的免疫效果。而後者又比僅使用破傷風類毒素80IU/ml者的免疫效率高。
實施例3.4C肝抗原組合物的免疫效果比較研究本實施例中，藥物組合物(上述I-V類對照物)含HCV抗原(北京大學人民醫院肝病研究所)。上述I類對照藥物組合物中，HCV抗原濃度為20μg/ml。上述II-V類對照物中，HCV抗原濃度為1-20IU/ml，超細粒子濃度為20-400μg/ml。
本實施例中，實驗小鼠與實施例3.1相同，實驗方法與實施例3.1相同。
血樣中的抗HCV抗原的抗體滴度抗體檢測使用公知的ELISA方法，所用ELISA試劑盒選自商業試劑盒(廈門科創生物技術有限公司)。
抽血檢測結果與實施例3.1中抽血檢測結果一致使用較低HCV抗原濃度、超細粒子濃度(例如HCV抗原濃度為5μg/ml和超細粒子濃度為100μg/ml)的本發明的藥物組合物(IV或V類對照物)，與使用較高抗原濃度、超細粒子濃度(例如HCV抗原濃度為10μg/ml和超細粒子濃度為200μg/ml)的III類對照物和II類對照物比較，可獲得至少相似(甚至更快)的免疫效果。而後者又比僅使用HCV抗原(濃度20μg/ml)者的免疫效率高。
實施例3.5EBV-VCA-P18抗原組合物的免疫效果比較研究本實施例中，藥物組合物(上述I-V類對照物)含EBV-VCA-P18抗原(自製)。上述I類對照藥物組合物中，EBV-VCA-P18抗原濃度為60μg/ml。上述II-V類對照物中，EBV-VCA-P18抗原濃度為10-60μg/ml，超細粒子濃度為100-600μg/ml。
本實施例中，實驗小鼠與實施例3.1相同，實驗方法與實施例3.1相同。
血樣中的抗EBV-VCA-P18抗原的抗體滴度抗體檢測使用公知的ELISA方法，所用ELISA試劑盒按公知方法自制。其中，ELISA 96孔板的孔中包被有EBV-VCA-P18抗原(自製)，標記物為羅丹明標記的羊抗人二抗，選自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司。
抽血檢測結果與實施例3.1中抽血檢測結果一致使用較低EBV-VCA-P18抗原濃度、超細粒子濃度(例如EBV-VCA-P18抗原濃度為10μg/ml和超細粒子濃度為100μg/ml)的本發明的藥物組合物(IV或V類對照物)，與使用較高抗原濃度、超細粒子濃度(例如EBV-VCA-P18抗原濃度為30μg/ml和超細粒子濃度為300μg/ml)的III類對照物和II類對照物比較，可獲得至少相似(甚至更快)的免疫效果。而後者又比僅使用EBV-VCA-P18抗原60μg/ml者的免疫效率高。
權利要求
1.一種藥物組合物，特徵在於其至少含高穩定、高效率藥物化超細粒子，其中所述高穩定、高效率藥物化超細粒子，是指超細粒子和藥物分子之間以共價鍵結合、且每mg超細粒子上共價鍵合的藥物分子的平均值大於20ug的顆粒。
2.按照權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於在該藥物組合物中，未結合在超細粒子上的藥物分子的含量，小於藥物分子總量的5％；且非穩定、高效藥物化超細粒子的含量，小於穩定、高效藥物化超細粒子的含量。
3.按照權利要求1或2所述的藥物組合物，其特徵在於所述藥物分子與超細粒子間的共價鍵合，是活化超細粒子與藥物分子之間的共價鍵合，其中所述活化超細粒子是指含活化基團的粒子衍生物。
4.按照權利要求3所述的藥物組合物，其特徵在於所述活化超細粒子中，所述活化基團共價鍵合在偶聯基團上，偶聯基團共價鍵合在超細粒子上。
5.按照權利要求3或4所述的藥物組合物，其特徵在於所述活化基團包括氨基和不含氨基的有機基團。
6.按照權利要求5所述的藥物組合物，其特徵在於所述偶聯基團的平均分布密度，大於1.85μmol/m2超細粒子表面；或/和活化基團的平均分布密度，大於1.85μmol/m2超細粒子表面。
7.按照權利要求3或4所述的藥物組合物，其特徵在於所述活化基團包括通式為-RNH2的基團，其中所述R為有機基團。
8.按照權利要求7所述的藥物組合物，其特徵在於所述活化基團的平均分布密度，大於0.5μmol/m2超細粒子表面。
9.按照權利要求4-8之一所述的藥物組合物，其特徵在於所述偶聯基團包括有機矽偶聯基團。
10.按照權利要求1-9之一所述的藥物組合物，其特徵在於該藥物組合物為疫苗組合物，該組合物中的藥物分子包括抗原。
11.按照權利要求1-10之一所述的藥物組合物，其特徵在於所述超細粒子包括無機超細粒子。
12.按照權利要求1-11之一所述的藥物組合物，其特徵在於所述超細粒子包括納米粒子。
13.一種製備權利要求1-12之一藥物組合物的方法，包括a.提供所述超細粒子和藥物分子，並使藥物分子與超細粒子進行所述共價鍵合；b.使每mg超細粒子共價鍵合的藥物分子的平均值大於20μg。
14.按照權利要求13所述的藥物組合物的製備方法，其特徵在於該方法中至少含有所述活化超細粒子的製備。
15.按照權利要求14所述的藥物組合物的製備方法，其特徵在於該方法中必須使用所述的活化超細粒子。
全文摘要
本發明公開的藥物組合物，組份中有超細粒子與藥物分子，特徵是藥物分子共價鍵合在超細粒子上，組成穩定高效的藥物化超細粒子，且在每mg超細粒子上共價鍵合的藥物分子的平均值大於20μg；組合物中未結合成藥物化超細粒子的藥物分子含量，小於藥物分子總量的5％，非穩定高效藥物化超細粒子含量，小於穩定高效藥物化超細粒子含量；藥物分子與超細粒子間的共價鍵合，是活化超細粒子與藥物分子間的共價鍵合；活化超細粒子，是指超細粒子與偶聯基團間的共價鍵合，以及偶聯基團與活化基團間的共價鍵合所生成的粒子衍生物；本發明優點是提供一種能提高藥效、或/和安全性、或/和降低藥物分子耗量、或/和增加藥物組合物選擇性，具有確定化學組成的藥物組合物。
文檔編號A61K9/14GK1864749SQ20061002069
公開日2006年11月22日 申請日期2006年4月12日 優先權日2006年4月12日
發明者鄒方霖, 陳春生, 王建霞 申請人:成都誇常醫學工業有限公司