植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定的引物及方法

2023-09-17 18:55:30 1

植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定的引物及方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，具體是對植物土傳病害尖孢鐮刀菌的快速鑑定方法。本發明採用設計的特異性上遊引物序列、下遊引物序列、土傳病害真菌的DNA稀釋液以及Taq Mix和ddH2O配製成PCR反應體系，進行常規PCR檢測。本發明打破了傳統的鑑定方法，使得鑑定過程相當簡單，無需進行測序，只需將常規PCR反應液進行DNA電泳後，觀察是否在1000bp左右有條帶即可確定是否為尖孢鐮刀菌。
【專利說明】 植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定的引物及方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法。

【背景技術】
[0002]尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主範圍廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花丼等100多種植物枯萎病的發生。
[0003]現目前，從土傳病害中鑑定尖孢鐮刀菌需要首先將感病植株的根部組織進行消毒處理和病原菌分離，在獲得純化菌株後，再進行室內離體培養和形態鑑定；在不產孢或無法確定時，還需要將分離菌株進行測序、比對，才能夠鑑定出尖孢鐮刀菌，其操作方法複雜，準確性不高。


【發明內容】

[0004]本發明的目的主要是提供一種快速鑑定尖孢鐮刀菌的方法，解決了現有鑑定方法操作複雜，準確性不高的問題。
[0005]本發明通過下述技術方案實現:
植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定的引物，
其中，上遊引物序列:5』-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3』 ；
下遊引物序列:5』-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3』。
[0006]植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法，包括以下步驟:
(1)合成以下引物，
上遊引物序列:5』-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3』 ；
下遊引物序列:5』-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3』 ；
(2)製備土傳病害真菌的DNA稀釋液；
(3)配製PCR反應體系；
(4)常規PCR檢測。
[0007]進一步地，步驟(I)中合成的引物的濃度均為10Mmol/l，步驟(2)中製備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
[0008]再進一步地，步驟(3)中所述的配製PCR反應體系，包括以下組分:
Taq Mix10μ1
上遊引物2μ1
下遊引物2μ1
DNA稀釋液?μ?
ddH205μ1。
[0009]更進一步地，所述PCR反應條件為:94°C預變性3min，94°C變性30s，65 °C退火30s，72°C延伸 lmin，35 個循環；72°C終止 1min0
[0010]本發明具有以下優點及有益效果: (I)本發明打破了傳統的鑑定方法，使得鑑定過程相當簡單，無需進行形態鑑定和DNA測序，即可確定尖孢鐮刀菌。
[0011](2)本發明擴增效率高、特異性強、準確度高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發明尖孢鐮刀菌特異引物PCR後特異條帶圖。
[0013]圖2為本發明採用三種不同引物PCR後的對比圖。

【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式並不限於此。實施例
[0015]轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測方法，在檢測pin II終止子與zm-hra gene相連位置核酸片段時，步驟如下:
植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法，包括以下步驟:
(I)合成以下引物，
上遊引物序列:5』-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3』 ；
下遊引物序列:5』-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3』。
[0016]本實施例引物的合成濃度均為10Mmol/l。
[0017]以上引物的核苷酸序列是針對尖孢鐮刀菌設計；通過該設計就可以精準鑑定出尖孢鐮刀菌。
[0018](2)製備土傳病害真菌的DNA稀釋液；即採用常規的DNA提取手段，從土傳病害真菌中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。
[0019](3)配製PCR反應體系；即將製備好的DNA稀釋液加入20μ1反應體系中即可。
[0020]以上20μ1反應體系包括以下組分:
Taq Mix10μ1
上遊引物2μ1
下遊引物2μ1
DNA稀釋液?μ?
ddH205μ1。
[0021](4)常規 PCR 檢測。
[0022]根據上述PCR反應體系，在以下PCR反應條件下對產物進行擴增並檢測，所述PCR反應條件為:94°C預變性3min，94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35個循環；72°C終止lOmin。本實施例中採用的是常規的B1-RAD PCR儀。
[0023]擴增後電泳條帶為1080bp，序列如下: CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGGTCGATCTGGAGGTCGATTCTCCGGCTGGCGGATCTGACACTGTCGAAA
CGAGATGCGGGCGGTGTAGGGTAGGCTAGTTTCGTCCTCGCCAGGTTGCGATTTGGACGAGATATGTGGTCTAGGG
TATGCTCTAGGGTAAGTAGAATTCGAGTTCCGTCGCCGACAGTTTTCTGTGGGTGTATGGTAGGTACAGGGTAGGCA
GATCTCTCTCCGGCCAGTACTTGTCTGGTGGTCGTGAGTCGATTTTTTTGTTTTGCCATACTATTGAATTTTGCGGAAATTCAAAAGTGGCTCGGGAGTCCCGCCTGGCGTGCGTCCGACTCGAACATCGTCGGTGTACATATGAGAGGGAGTAATCCGGCCCGGTCGGGGCCCATCGCGAGCTGCCGGGTAGGTAAAAGTAAAAAAGTTGTTAAGAGGCGCGGTGTCGGCGTGCTTGTATTTGCGGGAGAGAATTATCTGGGGGTGCTGGGTAGCCGGGAAGACTTGGACGGATCTGGCCCGGGAATGGGTCTGGGCCTGGATTCTGGTGTGGTGTAGGGTAGGCGTAGATAGATGAGTGGTCTAGGGTAGATACAGGGTAGCCAGACGTCTGGTATATAGTATGGGGGT.GTAGGGTAGGTCTGGACACCGTTTTCCACTTCGCCCTTCCCTTTAGTCGAGGGAGGACGATCTTGGCTGGGACGGAGGTGTAGGGTAGGCTTAACTTACGATTACATGATCTGTGTCACTCTAGGGTAGGTGAAAATCCCATATATGTATGATCACATTTGGTGAAGAGGTGGTTTGGCTGGTGAGATGGACAAAAGTGCAATATAGAATTATATGTGATTTTGCAAAAGTGGGTGTGAAATTGGGAAATCGGTTTTCCCGCACAGATGAGAGCACGTTTGAGGTTCCATGAGATGCACCTCTCCGAGACGACCTCAACGGTACCACCCATGTGTTGGTCGGGCTCCTGTGCGGCCGTCCAGGGCGGGATAAGTAGAGAATGTGGTGGTGTAGGGTAGGTGACCAGGTCCAGGGTAGGTTCGCCAAATCCGTCAATCCGGCTTGA 。
[0024]如圖1 所示，從左至右依次為 Marker、2、3、4、5、l、plus2、plus4、9、Marker、19、23、24、25、26、27、28、31、Marker、33、GDC3、GS1、YB3、YB 1、GG2、GS2、GS3，Marker 條帶之上而下為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp。其中 5、plus2、plus4、19、28、GS1、GG2 為陽性，即為尖孢鐮刀菌。
[0025]對本發明的序列進行試驗對比:
發明人採用本發明的引物、FO-EFla引物、FO-RBPl引物對菌株中的尖孢鐮刀菌進行鑑定，結果如圖2所示，圖2中左邊是採用本發明的引物PCR六個菌株，其中前三個和最後一個是尖孢，第4、5泳道是木賊、赤黴；圖2中間是採用FO-EFI a引物PCR八個菌株，其中前四個和最後一個是尖孢，第5、6、7道分別是腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌、赤黴鐮刀菌；圖2右邊採用FO-RBPl引物PCR八個菌株，其中前四個和最後一個是尖孢，第5、6、7分別是腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌、赤黴鐮刀菌。值得說明的是每組中間均留有一個泳道。
[0026]從圖中可以看出，用本發明的引物能特異性的從菌株中鑑定出尖孢鐮刀菌，特異性條帶在IlOObp左右；而FO-EFla引物PCR雖也能得到特異性條帶，但是該引物不能區分赤黴鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，FO-RBPl則特異性更差。
[0027]由以上檢測結果可得知，本發明的擴增效率高、準確度高、特異性強。
【權利要求】
1.植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定的引物，其特徵在於， 上遊引物序列:5』-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3』 ； 下遊引物序列:5』 -GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3』。
2.植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)合成以下引物， 上遊引物序列:5』-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3』 ； 下遊引物序列:5』-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3』 ； (2)製備土傳病害真菌的DNA稀釋液； (3)配製PCR反應體系； (4)常規PCR檢測。
3.根據權利要求2所述的植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法，其特徵在於，步驟(1)中合成的引物的濃度均為10Mmol/l，步驟(2)中製備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4.根據權利要求3所述的植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的配製PCR反應體系，包括以下組分: Taq MixΙΟμΙ上遊引物2μ1下遊引物2μ1DNA稀釋液?μ?ddH205μ1。
5.根據權利要求2或4所述的植物土傳病害尖孢鐮刀菌快速鑑定方法，其特徵在於，所述PCR反應條件為:94°C預變性3min，94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸lmin，35個循環；72°C終止 lOmin。
【文檔編號】C12N15/11GK104450951SQ201510017831
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2015年1月14日 優先權日:2015年1月14日
【發明者】伍文憲, 劉勇, 張蕾, 黃小琴, 尹全, 劉紅雨, 宋君, 王東, 周西全 申請人:四川省農業科學院植物保護研究所, 劉勇