牡荊屬醫藥新用途及藥物中間體的製備方法

2023-12-05 15:43:01

專利名稱：牡荊屬醫藥新用途及藥物中間體的製備方法
技術領域：
本發明涉及中藥提取工藝及其藥物製劑，本發明還包括本發明的藥物在製備抗腫瘤和抑制骨質疏鬆藥物中的應用。
背景技術：
牡荊屬Vitex植物系馬鞭草科喬木或灌木，約250種，主要分布於熱帶和溫帶地區，我國有14種，7亞種，3種主產於長江以南。在我國有7種藥用，即灰毛牡荊V.canescens、黃荊V.negundo、蔓荊V.trifolia、單葉蔓荊V.rotundifolia、穗花牡荊V.agnus-castus、長序荊V.peduncularis和山牡荊V.quinata。
牡荊屬植物提取物所含有的主要成分是下表中的一種或數種表1.
現代藥理研究表明，該屬中一些植物或其組分具有鎮痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抑制淋巴細胞及激素調節、抗氧化、蛻皮、驅蟲等功效。分述如下①調節內分泌作用富含黃酮的黃荊提取物具有抗雄性激素作用。黃荊中分離得到的黃酮5，7，3』-三羥基-6，8，4』-三甲氧基黃酮具有弱的雌激素作用。穗花牡荊葉和果實中的黃酮提取物具有增加血清中催乳激素的作用。另有研究報導，5，7，4』-三羥(基)黃酮為選擇性ER配基。富集黃酮成分的蔓荊子乙醇和甲醇提取物可以用於治療女性經期前綜合症。並予2005年申請了專利。
②抗腫瘤作用從牡荊屬植物中得到的一些化合物顯示出了一定的細胞毒作用。Diaz等報導從黃荊中得到的黃酮類化合物如紫花牡荊素在生物活性測定中對人類癌細胞顯示了廣泛的細胞毒作用；Ko等在對從蔓荊果實中得到的黃酮木犀草素進行活性研究，發現它能夠抑制人骨髓白血病細胞HL-60的增殖並誘導其凋亡，具有作為化療藥物開發的潛力；Masateru等的研究發現，紫花牡荊素在MTT試驗中對人肺癌細胞(PC-12)和人結腸癌細胞(HCT-116)的生長抑制作用。Kobayakawa等報導紫花牡荊素對KB細胞的生長具有顯著的抑制作用，其IC50值為0.23M。紫花牡荊素阻止了KB細胞G2-M.期。應用MTT法測定黃酮類化合物的細胞毒活性，結果表明具有C-2，3-雙鍵的黃酮類有抑制T-淋巴細胞的活性。木犀草素-6-C-(4」-甲基-6」-O-反-咖啡醯基)葡萄糖苷、木犀草素-6-C-(6」-O-反-咖啡醯基)葡萄糖苷、木犀草素-6-C-(2」-O-反-咖啡醯基)葡萄糖苷具有抑制P388淋巴細胞的活性，其IC50值分別為7.60，14和70μg/mL。王海燕等首次報導vitexcarpin對A2780(人卵巢癌細胞)，HCT-15(人大腸癌細胞)，HT-1080(人纖維肉瘤細胞)及K562(人白血病細胞)有較強的抑制作用，其IG50值分別為19.1μM(48h)，0.66μM(48h)，0.44μM(48h)和0.28μM(24h)。
③解熱鎮痛、抗炎作用蔓荊果實的提取物具有血管鬆弛作用和鎮痛作用，在利用小鼠扭體實驗指導分離的過程中，發現該提取物中鎮痛成分主要為苯丁基糖苷類及木脂素類化合物。Tiwari等報導黃荊富含酚類化合物的提取部位通過捕獲自由基與金屬熬合而產生抗氧化作用，從而下調自由基水平而達到抗炎作用。vitexcarpin對胸腺依賴性淋巴細胞和胸腺不依賴性淋巴細胞均有抑制活性。其IC50為0.7μM，並且抑制作用是可逆的。對淋巴瘤EL-4andP815.9的(IC50＝0.25-0.3μM)。這些結果表明，vitexcarpin可能用於抗炎或免疫失調的治療，如類風溼性關節炎和淋巴瘤。Vitex leucoxylon的乙醇粗提物和黃酮類化合物具有抗急性炎症的活性，而對慢性炎症沒效果。
④呼吸系統活性Alam等在對蔓荊中分離得到的vitexcarpin進行生物活性測定中發現，該化合物能夠阻斷由組胺誘導的雄性豚鼠氣管的自發性收縮，vitexcarpin通過穩定細胞膜，從而抑制組胺從肥大細胞中的釋放。
⑤抗氧化作用對黃荊子提取物和抗氧化成分的抗氧化作用進行了較深入研究，發現其主要成分為具有查爾酮骨架的黃酮類化合物。從黃荊子中分離得到木脂素成分vitedoin A，vitedoamine A，6-羥基-4-(4』-羥基-3』-甲氧苯基)-3-羥甲基-7-甲氧基-3，4-二氫-2-萘甲醛，detetrahydroconidendrin，vitrofolal E，vitrofolal F均具有抗氧化活性。其中，6-羥基-4-(4』-羥基-3』-甲氧苯基)-3-羥甲基-7-甲氧基-3，4-二氫-2-萘甲醛，vitrofolalE，vitrofolal F對DPPH的清除作用於維生素E相當。
⑥抗菌作用Kazuyoshi等研究發現，一些苯基萘類木脂素如vitrofolal等具有抗菌作用。
⑦抑制酪氨酸激酶作用黃荊子中分離得到的木脂素具有抑制酪氨酸激酶的活性，其中(+)-lyoniresinol的抑制活性最強，IC50值為3.21μM。通過構效關係研究表明木脂素中C-2，C-3上的取代基及-CH2OH基團在抑制活性方面起著重要的作用。(+)-lyoniresinol作為酪氨酸激酶抑制劑有望成為治療色素過度沉著的藥物。
自20世紀80年代以來，各國學者對牡荊屬植物的化學成分進行了一系列的研究，發現主要有黃酮類，揮髮油類，三萜類及木脂素類等200餘種化學成分。
總之，至今未發現牡荊屬木脂素類化合物對抗腫瘤和抑制骨質疏鬆的作用。

發明內容
本發明提供一種牡荊屬木脂素提取物。
本發明還發現本發明的牡荊屬木脂素提取物具有抗腫瘤和抑制骨質疏鬆的作用，為此，本發明提供一種牡荊屬木脂素提取物的醫藥新用途。
本發明還提供牡荊屬木脂素提取物的製備方法及含有該提取物的藥物製劑及其製備方法。
本發明的牡荊屬木脂素提取物其製備方法如下A、牡荊屬藥材，用乙醇溶液提取，得到提取液B、過聚醯胺柱色譜柱C、洗脫液濃縮後用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；或將洗脫液用聚醯胺柱吸附，裝柱後用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液D、濃縮萃取液；或洗脫液得到本發明的提取物其中所述乙醇溶液為含20～90％的乙醇水溶液。
優選的製備方法可以是A、藥材煎煮(A)將牡荊屬原料(藥材)粉碎，按原料與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶8～10向原料中加入40％乙醇溶液，然後將兩者的混合物熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。
(B)按所述牡荊屬原料與與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶6～8向A步(A)濾出的渣中加入40％乙醇溶液，並將兩者混合物加熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。
(C)按所述牡荊屬原料與與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶6～8向A步(B)濾出的渣中加入40％乙醇溶液，並將兩者混合物加熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。
B、液體濃縮將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至其中重量與所述原料重量之比為1∶1～5為止。
C、吸附、洗脫濃縮後的浸膏用70％乙醇溶解，按浸膏與聚醯胺的體積分數比為1∶0.3拌樣，回收乙醇，拌樣樹脂加水混懸，加到經活化處理後的聚醯胺柱，使液體中的總木脂素被聚醯胺吸附，並棄去流出液，在按聚醯胺柱體積的1∶1~2的蒸餾水衝洗聚醯胺柱，棄去流出液。繼用0.4％的氨水清洗聚醯胺柱，並收集洗脫液。將此洗脫液濃縮後用乙酸乙酯萃取，或將此洗脫液濃縮後用處理好的聚醯胺柱吸附，乾燥，裝柱後用1～2倍柱體積的水飽和的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。
D、成品回收、乾燥回收工序C所得的萃取液或洗脫液，餘留物質乾燥後，即可得到製備中間體的成品。
本發明所述牡荊屬藥材包括以下藥材灰毛牡荊、黃荊、蔓荊、單葉蔓荊、穗花牡荊、長序荊和山牡荊，優選的是黃荊、蔓荊或穗花牡荊的果實。
本發明的提取物，優選的是黃荊子提取物，其優選的提取方法列在本發明實施例1中。
本發明的藥物製劑，是以本發明的提取物作為藥物活性物質，提取物在製劑中所佔重量百分比可以是0.1-99.9％，其餘為藥物可接受的載體。本發明的藥物製劑，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指製劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。
本發明的藥物製劑可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、衝劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發明的製劑，優選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。
本發明的藥物製劑，其口服給藥的製劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和溼潤劑，必要時可對片劑進行包衣。
適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括澱粉、聚乙烯吡咯烷酮和澱粉衍生物，例如羥基乙酸澱粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的溼潤劑包括十二烷基硫酸鈉。
可通過混合，填充，壓片等常用的方法製備固體口服組合物。進行反覆混合可使活性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。
口服液體製劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的乾燥產品。這種液體製劑可含有常規的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，並且如果需要，可含有常規的香味劑或著色劑。
對於注射劑，製備的液體單位劑型含有本發明的活性物質和無菌載體。根據載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的製備通常是通過將活性物質溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然後密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩衝劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩定性，可在裝入小瓶以後將這種組合物冰凍，並在真空下將水除去。
本發明的藥物製劑，在製備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價鹼金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、胺基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、澱粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、矽衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、β-環糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。
本發明的製劑在使用時根據病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如1-20袋或粒或片。
本發明的提取物和藥物製劑具有抗腫瘤和抗骨質疏鬆作用，以下通過實驗數據證明本發明的藥物用途。實驗採用常規手段，藥物使用本發明實施例方法得到的提取物或藥物製劑。
1、牡荊屬植物提取物的抗腫瘤作用(1)黃荊子提取物對裸鼠人卵巢癌(COC1)細胞異種移植瘤的研究取Balb/c-nu裸鼠29隻，4周齡，體重約14-16g。飼養於屏障環境(100級無菌室)中，飼料，飲水，墊料，籠具均經高壓蒸汽滅菌後使用，所有操作均嚴格執行SPF級實驗動物操作規程。
用無菌PBS調整COC1細胞濃度為3×107/mL，在Balb/c-nu小鼠背部皮下接種COC1細胞0.2mL/只，接種觀察待出現肉眼可見移植瘤後，用遊標卡尺測量移植瘤最長徑(L)和最短徑(W)，按公式V＝L×W2×0.52計算瘤體積，待移植瘤體積達100mm3左右時按瘤體積和荷瘤鼠體重均衡原則分組。即荷瘤Balb/c-nu對照組(生理鹽水)；藥物組。以上各組均隔7日瘤內注射給藥1次，共計2次，給藥期間每4日測量鼠體重及移植瘤體積，繪製移植瘤生長曲線。末次給藥48小時後脫臼處死小鼠，切除移植瘤，稱取瘤重，計算瘤重抑制率。
實驗數據採用SPSS 12.0統計分析軟體，以One-way ANOVA及Student t test方法進行檢驗，所得數據以x±s表示，以P＜0.05為具有統計學顯著性差異標準。實驗結果如表1所示，黃荊子提取物對人卵巢癌(COC1)細胞異種移植瘤的抑制率為61.6％。
表2黃荊子提取物對人卵巢癌(COC1)細胞Balb/c-nu移植瘤瘤重的影響(x±s，n＝4)

F＝2.470，P＝0.072 *p＜0.05，vs Control(NS)表3黃荊子提取物給藥後對人卵巢癌(COC1)細胞Balb/c-nu移植瘤體積的影響(x±s，n＝5)

*p＜0.05，**p＜0.01 vs Control(NS)(2)黃荊子提取物對裸鼠人乳腺癌(MCF-7)細胞異種移植瘤的研究突變系Balb/c-nu雌性裸小鼠24隻，6-7周齡，體重18-20g，背部皮下接種MCF-7細胞2×106cells/只，待移植瘤體積達100mm3以上時，按瘤體積和體重均衡原則，分為6組，每組4隻。A組，荷瘤Balb/c-nu對照組(NS 0.1ml/10g，i.p)；B組，內分泌治療劑他莫昔芬陽性藥對照組(TAM 10mg/kg，i.g)；C組，化療劑紫杉醇陽性藥對照組(TAX 10mg/kg，i.p)；D組，低劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物5mg/kg，i.p)；E組，中劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物10mg/kg，i.p)；F組，高劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物20mg/kg，i.p)，以上各組隔日給藥1次，共計7次，給藥期間每4日用遊標卡尺測量移植瘤最長徑和最短徑，按標準公式計算瘤體積V＝L×W2×0.52。末次給藥48小時後測定移植瘤體積，脫頸臼處死裸小鼠，切除移植瘤，用皿式電子分析天平稱量瘤重。腫瘤生長抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤體積均值/對照組瘤體積均值)×100％；瘤重抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤重均值/對照組瘤重均值)×100％。
各組瘤體積和瘤重均用x±s表示，採用Spss windows 10.0軟體One WayANOVA方式行方差分析及兩兩比較採用Student’t檢驗，P＜0.05為統計學意義顯著標準。實驗結果如表3所示，黃荊子提取物對人乳腺癌(MCF-7)細胞Balb/c-nu異種移植瘤生長具有抑制作用，呈劑量依賴性。
表4黃荊子提取物對人乳腺癌(MCF-7)細胞Balb/c-nu移植瘤瘤重的影響(x±s，n＝4)

F＝9.356，P＝0.000，***P＜0.001 vs Control(NS)表5黃荊子提取物給藥後對人乳腺癌(MCF-7)細胞Balb/c-nu移植瘤體積的影響(x±s，n＝5)

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)(3)黃荊子提取物對裸鼠人宮頸癌(Hela)細胞異種移植瘤的研究突變系Balb/c-nu雌性裸小鼠28隻，6-7周齡，體重18-22g，背部皮下接種Hela細胞2×106cells/只，待移植瘤體積達350mm3以上時，按瘤體積和體重均衡原則，分為7組，每組4隻。A組，荷瘤Balb/c-nu對照組(NS 0.1ml/10g，i.p)；B組，順鉑(DDP)陽性藥對照組(4mg/kg，i.p)；C組，化療劑紫杉醇陽性藥對照組(20mg/kg，i.p)；D組，低劑量黃荊子提取物實驗組(5mg/kg，i.p)；E組，中劑量黃荊子提取物實驗組(10mg/kg，i.p)；F組，高劑量黃荊子提取物實驗組(20mg/kg，i.p)，高劑量黃荊子提取物灌胃組(20mg/kg，i.g)以上各組隔日給藥1次，共計7次，每4日用遊標卡尺測量移植瘤最長徑和最短徑，按標準公式計算瘤體積V＝L×W2×0.52。末次給藥48小時後測定移植瘤體積，脫頸臼處死裸小鼠，切除移植瘤，用皿式電子分析天平稱量瘤重。腫瘤生長抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤體積均值/對照組瘤體積均值)×100％；瘤重抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤重均值/對照組瘤重均值)×100％。實驗結果如表5所示，黃荊子提取物對人宮頸癌(Hela)細胞Balb/c-nu異種移植瘤生長具有抑制作用，呈劑量依賴性。
表6黃荊子提取物對人宮頸癌(Hela)細胞Balb/c-nu移植瘤瘤重的影響(x±s，n＝4)

F＝10.006，P＝0.000*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)表7黃荊子提取物給藥後對人宮頸癌(Hela)細胞Balb/c-nu移植瘤體積的影響(x±s，n＝5)


*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)(4)黃荊子提取物對裸鼠人肝癌(Hep G2)細胞異種移植瘤的研究突變系Balb/c-nu雌性裸小鼠24隻，6-7周齡，體重17-20g，背部皮下接種人肝癌(Hep G2)細胞2×106cells/只，待移植瘤體積達150mm3以上時，按瘤體積和體重均衡原則，分為6組，每組4隻。H1組，荷瘤Balb/c-nu對照組(NS0.1ml/10g，i.p)；H2組，5-氟尿嘧啶陽性藥對照組(5-FU 20mg/kg，i.p)；H3組，低劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物5mg/kg，i.p)；H4組，中劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物10mg/kg，i.p)；H5組，高劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物20mg/kg，I.p)；H6組，高劑量黃荊子提取物(灌胃)實驗組(黃荊子提取物20mg/kg，i.g)。以上各組隔日給藥1次，共計7次，給藥期間每4日用遊標卡尺測量移植瘤最長徑和最短徑，按標標準公式計算瘤體積V＝L×W2×0.52。末次給藥48小時後測定移植瘤體積，脫頸臼處死裸小鼠，切除移植瘤，用皿式電子分析天平稱量瘤重。腫瘤生長抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤體積均值/對照組瘤體積均值)×100％；瘤重抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤重均值/對照組瘤重均值)×100％。
各組瘤體積和瘤重均用x±s表示，採用Spss windows 10.0軟體One WayANOVA方式行方差分析及兩兩比較採用Student’t檢驗，P＜0.05為統計學意義顯著標準。實驗結果如表7所示，黃荊子提取物對人肝癌(Hep G2)細胞Balb/c-nu異種移植瘤生長具有抑制作用，呈劑量依賴性。
表8黃荊子提取物對人肝癌(Hep G2)細胞Balb/c-nu移植瘤瘤重的影響(x±s，n＝4)

F＝36.561，P＝0.000*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)表9黃荊子提取物給藥後對人肝癌(Hep G2)細胞Balb/c-nu移植瘤體積的影響(x±s，n＝5)


*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)(5)黃荊子提取物對裸鼠人胃癌(SGC-7901)細胞異種移植瘤的研究突變系Balb/c-nu雄性裸小鼠30隻，6-7周齡，體重18-23g，背部皮下接種SGC-7901細胞2×106cells/只，待移植瘤體積達300mm3以上時，按瘤體積和體重均衡原則，分為6組，每組5隻。I組，荷瘤Balb/c-nu對照組(NS 0.1ml/10g，i.p)；II組，化療劑絲裂黴素化療陽性藥物對照組(MMC 1mg/kg，i.p)；III組，低劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物5mg/kg，i.p)；IV組，中劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物10mg/kg，i.p)；V組，高劑量黃荊子提取物實驗組(黃荊子提取物20mg/kg，i.p)；VI組，高劑量黃荊子提取物灌胃實驗組(黃荊子提取物20mg/kg，i.g)，以上各組隔日給藥1次，共計7次，給藥期間每4日用遊標卡尺測量移植瘤最長徑和最短徑，按標準公式計算瘤體積V＝L×W2×0.52。末次給藥48小時後測定移植瘤體積，脫頸臼處死裸小鼠，切除移植瘤，用皿式電子分析天平稱量瘤重。腫瘤生長抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤體積均值/對照組瘤體積均值)×100％；瘤重抑制劑率(％)＝(1-實驗組瘤重均值/對照組瘤重均值)×100％。
各組瘤體積和瘤重均用x±s表示，採用Spss windows 10.0軟體One WayANOVA方式行方差分析及兩兩比較採用Student’t檢驗，P＜0.05為統計學意義顯著標準。實驗結果如表9所示，黃荊子提取物對人胃癌(SGC-7901)細胞Balb/c-nu異種移植瘤生長具有抑制作用，呈劑量依賴性。
表10黃荊子提取物對人胃癌(SGC-7901)細胞Balb/c-nu移植瘤瘤重的影響(x±s，n＝4)

F＝8.135，P＝0.000
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)表11黃荊子提取物給藥後對人胃癌(SGC-7901)細胞Balb/c-nu移植瘤體積的影響(x±s，n＝5)

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs Control(NS)2、牡荊屬植物提取物抑制骨質疏鬆的作用(1)、黃荊子提取物抑制骨質疏鬆的作用骨髓腔是兩種幹細胞的貯存庫，包括造血幹細胞和骨髓間質幹細胞(BoneMesenchymal Stem Cells，BMSCs)。BMSCs來源於中胚層，是一類具有很強的自我增殖能力和多向分化潛能的幹細胞，可在不同誘導劑的誘導下分化成多種細胞的前體細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞等。BMSC雖然在骨髓中含量極少，約只佔骨髓有核細胞的十萬分之一，但BMSCs是出生後骨改建過程中成骨細胞最主要的來源，對骨總量的維持具有重要意義；因此，體外培養BMSCs為我們提供了一個很好的研究成骨細胞分化調控的體外模型。
本實驗中，我們假設原代HBMSCs能對黃荊子提取物刺激發生反應，並且NO信號途徑是黃荊子提取物效應發揮過程中的重要信號傳導通路。為證實這一假設，我們在體外培養相對均質的原代人骨髓間質幹細胞(HBMSCs)，誘導其向成骨細胞分化；在此基礎上，觀察NO對HBMSCs的細胞增殖和向成骨細胞分化的影響，考察該效應是否與黃荊子提取物的雌激素樣活性有關，並進一步探討NO信號傳導通路在黃荊子提取物效應中的介導作用。
經孕婦自願捐獻，取4～5月左右水囊引產胎兒，用酒精消毒胎兒四肢，取出四肢長骨(遵循湖南省倫理委員會的倫理學標準，並經湖南省衛生廳同意)。在超淨操作臺中剝盡肌肉和骨膜，剪去兩端骨骺，用5ml一次性注射器衝洗骨髓腔。衝洗液以1000轉/秒的速度，4℃離心10分鐘；棄掉上清，加入15ml含10％FBS的α-MEM培養液重懸細胞。將細胞的濃度調整至每毫升107個，將重懸液以1∶1比例緩慢加入裝有3ml Ficoll淋巴分離液的的離心管中，以1800轉/分速度離心30分鐘，可見淋巴細胞分離液分層。小心吸出培基和分離液之間的間質幹細胞層，放入塑料離心管中，用α-MEM培養基洗滌3次(1000轉/分，5-10分鐘)。加入含有15％FBS的α-MEM重懸。將濃度調整至每毫升106個細胞，種入25cm2的塑料培養瓶中，置於37℃，5％CO2培養箱中孵育。3天後換一半培基，5天後更換全部培基，除去未貼壁的細胞。細胞長滿培養瓶底部90％左右後，用0.25％胰蛋白酶消化，傳代培養，到第四代細胞生長已基本穩定。取第四～六代細胞以5×104cells·mL-1的密度種板，細胞貼壁後，培基換為含10％FBS(經葡聚糖包被的炭末吸附，DCS)的無酚紅α-MEM，加入促進HBMSCs向成骨細胞分化的促分化劑(10nmol·L-1地塞米松，50mg·L-1維生素C及10mmol·L-1β-甘油磷酸，OS)。同時給予不同的處理。以後每三天更換培基，並加藥。
實驗結果見表12，黃荊子提取物可通過雌激素受體介導的NO信號傳導通路促進原代HBMSCs的增殖及其向成骨細胞的分化；黃荊子提取物具有潛在的抗骨質疏鬆的作用。
表12.黃荊子提取物通過NO通路促進HBMSCs向成骨細胞分化的指標

每組數據重複3次，兩個復孔取均值。所有參數用均數±標準差(mean±SD)表示，採用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計分析。各組間概率P＜0.05表示在統計學上差異具有顯著性。
本發明與已有技術相比具有以下優點1.成本低2.雜質含量低3.工藝穩定，易於操作，易於實現4.生產過程對環境無汙染
具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。
實施例1(原料為黃荊子)A、藥材煎煮(A)將黃荊子10kg粉碎加入容器中，再向容器中加入40％乙醇溶液80升，然後加將兩者的混合物熱至85℃，保溫1.5小時之後，濾渣取液。
(B)向A步(A)濾出的渣中加入40％乙醇溶液60升，並將兩者混合物加熱至85℃，保溫1小時之後，濾渣取液。
(C)向A步(B)濾出的渣中加入40％乙醇溶液60升，並將兩者混合物加熱至85℃，保溫1小時之後，濾渣取液。
B、液體濃縮將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至濃縮至10升為止。
C、吸附、洗脫濃縮後的浸膏加75％乙醇溶解，按浸膏與聚醯胺的重量分數比為1∶0.3拌樣，回收乙醇，拌樣樹脂加水混懸，加到經活化處理後的聚醯胺柱(10升)，使液體中的總木脂素被聚醯胺吸附，並棄去流出液，20升蒸餾水衝洗聚醯胺柱，棄去流出液。繼用0.4％的氨水40升清洗聚醯胺柱，並收集洗脫液。將此洗脫液濃縮後用處理好的聚醯胺柱吸附(2升)，乾燥，裝柱(8升)後用20升水飽和的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。
D、成品回收、乾燥回收工序C所得的洗脫液，餘留物質乾燥後，即得提取物。
實施例2(原料為穗花牡荊果實)(A)將穗花牡荊子10kg粉碎加入容器中，再向容器中加入20％乙醇溶液80升，然後加將兩者的混合物熱至85℃，保溫1.5小時之後，濾渣取液。
(B)向A步(A)濾出的渣中加入20％乙醇溶液60升，並將兩者混合物加熱至85℃，保溫1小時之後，濾渣取液。
(C)向A步(B)濾出的渣中加入20％乙醇溶液60升，並將兩者混合物加熱至85℃，保溫1小時之後，濾渣取液。
B、液體濃縮將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至濃縮至10升為止。
C、吸附、洗脫濃縮後的浸膏加75％乙醇溶解，按浸膏與聚醯胺的重量分數比為1∶0.3拌樣，回收乙醇，拌樣樹脂加水混懸，加到經活化處理後的聚醯胺柱(10升)，使液體中的總木脂素被聚醯胺吸附，並棄去流出液，20升蒸餾水衝洗聚醯胺柱，棄去流出液。繼用0.4％的氨水40升清洗聚醯胺柱，並收集洗脫液。將此洗脫液濃縮至無氨水味(約5升)用20升水飽和的乙酸乙酯分五次萃取，收集乙酸乙酯萃取液。
D、成品回收、乾燥回收工序C所得萃取的液，餘留物質乾燥後，即得提取物實施例3(原料為蔓荊子)A、藥材煎煮(A)將蔓荊子10kg粉碎加入容器中，再向容器中加入90％乙醇溶液80升，然後加將兩者的混合物熱至70℃，保溫1.5小時之後，濾渣取液。
(B)向A步(A)濾出的渣中加入90％乙醇溶液60升，並將兩者混合物加熱至70℃，保溫1小時之後，濾渣取液。
(C)向A步(B)濾出的渣中加入90％乙醇溶液60升，並將兩者混合物加熱至70℃，保溫1小時之後，濾渣取液。
B、液體濃縮將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至濃縮至10升為止。
C、吸附、洗脫濃縮後的浸膏加75％乙醇溶解，按浸膏與聚醯胺的重量分數比為1∶0.3拌樣，回收乙醇，拌樣樹脂加水混懸，加到經活化處理後的聚醯胺柱(10升)，使液體中的總木脂素被聚醯胺吸附，並棄去流出液，20升蒸餾水衝洗聚醯胺柱，棄去流出液。繼用0.4％的氨水40升清洗聚醯胺柱，並收集洗脫液。將此洗脫液濃縮後用處理好的聚醯胺柱吸附(2升)，乾燥，裝柱(8升)後用20升水飽和的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。
D、成品回收、乾燥回收工序C所得的洗脫液，餘留物質乾燥後，即得提取物實施例4本發明藥物的劑型1.注射用黃荊子提取物(凍幹)黃荊子提取物20～100g(相當總木脂素總含量標示量90～110％)甘露醇 適量作支持劑製成凍乾粉針劑1000支製法在無菌條件下(或超淨化工作檯內操作)將處方量提取物和支持劑，加注射用水，加熱溶解，加注射用活性炭，加熱過濾，分裝1000支，-40℃冷凍後，升溫，凍幹為止。
性狀本品為淡黃色無定性粉末或疏鬆固體狀物，為苦澀。
2.片劑黃荊子提取物的80～400g(含木脂素含量50％以上)賦形劑適量(乳糖、澱粉)製成1000片製法將處方量中間體(提取物)與賦形劑混勻，溼法或一步制粒，若溼法制粒在60℃～80℃乾燥，將顆粒整粒後加適量潤滑劑壓製成1000片，色衣或薄膜色衣即得。
性狀剝去糖衣或薄膜後為棕黃色粉末，味苦、澀。
3.膠囊劑黃荊子提取物的中間體80～400g(含木脂素含量50％以上)賦形劑適量(乳糖、澱粉)製成1000粒製法將處方量中間體混勻獲製成顆粒，裝入膠囊中即得。
性狀本品內容物為黃褐色無定性或疏鬆固體顆粒狀物，味苦澀。
權利要求
1.含有木脂素的牡荊屬植物提取物在製備抗腫瘤，抗骨質疏鬆的藥物中的應用，所述提取物含有結構如下的4種木脂素
2.一種含有木脂素的牡荊屬植物提取物，其製備方法如下A、牡荊屬藥材，用乙醇溶液提取，得到提取液B、過聚醯胺柱色譜柱C、洗脫液濃縮後用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；或將洗脫液用聚醯胺柱吸附，裝柱後用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液D、濃縮萃取液；或洗脫液得到本發明的提取物其中所述乙醇溶液為含20～90％的乙醇水溶液。
3.權利要求2的提取物，所述牡荊屬藥材包括以下藥材灰毛牡荊、黃荊、蔓荊、單葉蔓荊、穗花牡荊、長序荊和山牡荊。
4.權利要求2的提取物，所述牡荊屬藥材選自灰毛牡荊、黃荊、蔓荊、單葉蔓荊、穗花牡荊、長序荊和山牡荊的果實。
5.權利要求2的提取物，其製備方法如下A、藥材煎煮(A)將牡荊屬原料(藥材)粉碎，按原料與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶8～10向原料中加入40％乙醇溶液，然後加將兩者的混合物熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。(B)按所述牡荊屬原料與與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶6～8向A步(A)濾出的渣中加入40％乙醇溶液，並將兩者混合物加熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。(C)按所述牡荊屬原料與與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶6～8向A步(B)濾出的渣中加入40％乙醇溶液，並將兩者混合物加熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。B、液體濃縮將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至其中重量與所述原料重量之比為1∶1～5為止。C、吸附、洗脫濃縮後的浸膏加75％乙醇溶解，按浸膏與聚醯胺的重量分數比為1∶0.3拌樣，回收乙醇，拌樣樹脂加水混懸，加到經活化處理後的聚醯胺柱，使液體中的總木脂素被聚醯胺吸附，並棄去流出液，用蒸餾水衝洗聚醯胺柱，棄去流出液。繼用0.1～2.0％的氨水洗脫聚醯胺柱，將此洗脫液濃縮後用乙酸乙酯萃取，或將此洗脫液濃縮後用處理好的聚醯胺柱吸附，乾燥，裝柱後用1～2倍柱體積的水飽和的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。D、成品回收、乾燥回收工序C所得的萃取液或洗脫液，餘留物質乾燥後，即得。
6.含有權利要求2的提取物的藥物製劑。
7.權利要求6的藥物製劑在製備抗腫瘤，抗骨質疏鬆的藥物中的應用。
8.權利要求2的提取物的製備方法，包括如下步驟A、牡荊屬藥材，用乙醇溶液提取，得到提取液B、過聚醯胺柱色譜柱C、洗脫液濃縮後用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；或將洗脫液用聚醯胺柱吸附，裝柱後用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液D、濃縮萃取液；或洗脫液得到本發明的提取物其中所述乙醇溶液為含20～90％的乙醇水溶液。
9.權利要求8的製備方法，步驟如下A、藥材煎煮(A)將牡荊屬原料(藥材)粉碎，按原料與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶8～10向原料中加入40％乙醇溶液，然後加將兩者的混合物熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。(B)按所述牡荊屬原料與與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶6～8向A步(A)濾出的渣中加入40％乙醇溶液，並將兩者混合物加熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。(C)按所述牡荊屬原料與與40％乙醇溶液的體積分數比為1∶6～8向A步(B)濾出的渣中加入40％乙醇溶液，並將兩者混合物加熱至70℃～100℃，保溫1～3小時之後，濾渣取液。B、液體濃縮將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至其中重量與所述原料重量之比為1∶1～5為止。C、吸附、洗脫濃縮後的浸膏加75％乙醇溶解，按浸膏與聚醯胺的重量分數比為1∶0.3拌樣，回收乙醇，拌樣樹脂加水混懸，加到經活化處理後的聚醯胺柱，使液體中的總木脂素被聚醯胺吸附，並棄去流出液，用蒸餾水衝洗聚醯胺柱，棄去流出液。繼用0.1～2.0％的氨水洗脫聚醯胺柱，將此洗脫液濃縮後用乙酸乙酯萃取，或將此洗脫液濃縮後用處理好的聚醯胺柱吸附，乾燥，裝柱後用1～2倍柱體積的水飽和的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。D、成品回收、乾燥回收工序C所得的萃取液或洗脫液，餘留物質乾燥後，即得。
10.權利要求9的製備方法，其中牡荊屬原料為黃荊子。
全文摘要
本發明涉及牡荊屬醫藥新用途及藥物中間體的製備方法，本發明還包括本發明的藥物在製備抗腫瘤和抑制骨質疏鬆藥物中的應用。
文檔編號A61P19/10GK101057913SQ20071011055
公開日2007年10月24日 申請日期2007年6月6日 優先權日2007年6月6日
發明者周應軍, 申璀, 曾光堯, 譚健兵, 譚桂山, 徐康平, 李福雙 申請人:周應軍