含有結合雌激素的提取物及其提取純化方法
2023-05-27 03:34:11 1
專利名稱：含有結合雌激素的提取物及其提取純化方法
技術領域：
本發明涉及一種含有結合雌激素的提取物及其提取純化方法，特別是涉及一種從孕驢尿中提取的含有結合雌激素的提取物及提取純化方法。
背景技術：
結合雌激素類藥物主要用於激素替代療法(Hormone Replacement Therapy,HRT)，用於緩解任何雌激素不足的臨床症狀，治療和預防女性生理或人工絕經後出現的更年期綜合症，能夠預防和治療骨質疏鬆症和冠心病。許多婦女把結合雌激素看作是一種能延緩衰老，留住青春的「靈丹妙藥」，美國惠氏公司也因此開始了在世界範圍內對雌激素產品長達65年的壟斷。早期結合態雌激素提取研究中主要採用有機溶劑萃取方法，如低碳醇、酯、滷代烴等，有美國專利US2834712、US2429398、US2711988、US2519516，但該方法易產生乳化、沉澱現象，導致萃取效率低，雌激素損失過多等問題。上世紀60年代，美國專利US2551205開始採用活性炭提取結合雌激素混合物，之後相繼出現了離子交換樹脂、聚丙烯酸酯吸附樹脂、反相矽膠進行提取的案例。但這些方法普遍存在再生困難，吸附效率低，工業成本高等特點。在近幾年關於結合態雌激素的提取研究中，應用新型的大孔吸附樹脂從孕馬尿中提取雌激素的方法逐漸顯露出前所未有的優勢。該方法成本低、樹脂可再生、吸附效率高，易於工業化生產。孕馬尿中富含雌激素，每升孕馬尿中雌激素的平均含量為7(Tl30mg，每匹孕馬在孕期內可形成雌激素50 100g。目前市售的結合雌激素藥物多為從孕馬尿中提取的天然雌激素。驢和馬同屬馬屬，有著共同的起源，有不少共同特徵。但從驢尿中提取含有結合態雌激素的提取物還未見有報導。本發明在現有技術基礎上，採用苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂對孕驢尿中結合態雌激素進行吸附分離，並開創性的結合反相柱純化工藝，成功從孕驢尿中提取 到結合態雌激素混合物，填補了孕驢尿應用的空白。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種從孕驢尿中提取純化結合態雌激素的方法及由此方法得到的含有結合雌激素的提取物。為達上述目的，本發明一種從孕驢尿中提取純化結合雌激素的方法，包括以下步驟(I)將採集的孕驢尿樣品經過大孔樹脂吸附柱分離，採用水混溶性溶劑進行梯度洗脫，得到含有結合態雌激素的濃縮液；(2)將提取的結合態雌激素濃縮液，經反相C18柱富集純化，進行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結合態雌激素混合物；(3)將純化的結合態雌激素混合物，加水和醋酸緩衝液，震蕩，然後加酶進行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。
本發明的方法，其中優選所述步驟(I)所用的大孔吸附樹脂為苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂，市場有售。本發明的方法，其中優選所述步驟(2)所用純化方法為反相C18柱分離純化，且上樣前，C18反相柱經洗脫溶劑衝洗，預先平衡直到獲得穩定的基線。本發明的方法，其中優選所述步驟(3)醋酸緩衝液濃度為O. 2M，pH=5. 2。本發明的方法，其中優選所述步驟(3)中所用酶為硫酸酯酶。本發明的方法，其中優選所述水混溶性洗脫溶劑選自低級鏈烷醇，更優選為甲醇或乙醇。本發明的方法，其中優選所述步驟(I)中的孕驢尿為孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿液。本發明還涉及由上述方法得到的含有結合雌激素的提取物。進一步地，本發明含有結合雌激素的提取物中三種主要結合態雌激素為雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉。本發明與現有技術不同之處在於，相比之前結合態雌激素多從孕馬尿中提取，本發明首次從孕驢尿中提取結合態雌激素，得到了含有雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素的混合物。本發明在現有技術基礎上，採用市售苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂進行吸附分離，再經C18反相柱純化、進行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫，從孕驢尿中得到結合態雌激素提取物，由於常規使用的液-液和固-液提取方法中出現的諸多問題，如乳化層形成、沉澱、再生困難等現象，導致提取過程損失嚴重、成本增加、效率低。本發明克服了上述方法所產生的弊端，採用大孔吸附樹脂方法實現了快速、簡便地從孕驢尿中 獲得富集的結合雌激素混合物成分，並開創性的結合反相柱分離對富集的結合雌激素混合物進行了純化，得到的提取產品中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉成分含量高。本發明工藝簡單，樹脂可再生，節約成本，產品收率高，易於工業化生產。
具體實施例方式以下結合實施例和試驗數據，對本發明上述的和另外的技術特徵和優點作更詳細的說明。本發明具體實施例中所涉及的實驗材料來源1、孕驢尿液採自新疆喀什嶽普湖。2、洗脫及萃取溶劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。3、硫酸酯酶購自上海西格瑪奧德裡奇有限公司。4、液相檢測所用標準品雌酮、馬烯雌酮、17 α -雌二醇購自上海西格瑪奧德裡奇有限公司。實施例1將IL採集的孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿樣品經過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用O %，15 %，60%, 100%乙醇洗脫3個柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分並分別濃縮至IOOmL,得到純化的結合態雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP O. 2M、pH5. 2的醋酸緩衝液IOOmL,震蕩30min，然後加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時，溫度40°C。水解後，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合併濃縮至幾乎幹，加入5mL甲醇，得到結合態雌激素提取物。經高效液相檢測(檢測過程請參見試驗例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素，含量分別為2. 9Img/L、2. 14mg/L、20. 45mg/L。實施例2將IL採集的孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿樣品經過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用10%，30%, 50%, 100%乙醇洗脫3個柱體積，取50%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分並分別濃縮至IOOmL,得到純化的結合態雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、pH5. 2的醋酸緩衝液IOOmL,震蕩30min，然後加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時，溫度400C。水解後，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合併濃縮至幾乎幹，加入5mL甲醇，得到結合態雌激素提取物。經高效液相檢測(檢測過程請參見試驗例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉含量分別為3. llmg/L、4. 2mg/L、18. 58mg/L0實施例3將IL採集的孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿樣品經過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用0%，15%，60%, 100%乙醇洗脫3個柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經C18反相柱純化，依次用20%，50%, 80%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分並分別濃縮至IOOmL,得到純化的結合態雌激素混合物。取100%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、pH5. 2的醋酸緩衝液IOOmL,震蕩30mi n，然後加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時，溫度400C。水解後，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合併濃縮至幾乎幹，加入5mL甲醇，得到結合態雌激素提取物。經高效液相檢測(檢測過程請參見試驗例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素，含量分別為2. 91mg/L、2. 14mg/L、20. 45mg/L。實施例4將IL採集的孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿樣品經過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用0%，15%，60%, 100%乙醇洗脫3個柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分並分別濃縮至IOOmL,得到純化的結合態雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、pH5. 2的醋酸緩衝液IOOmL,震蕩30min，然後加硫酸酯酶約50mg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時，溫度400C。水解後，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合併濃縮至幾乎幹，加入5mL甲醇，得到結合態雌激素提取物。經高效液相檢測(檢測過程請參見試驗例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素，含量分別為1. 87mg/L、0. 95mg/L、ll. 23mg/L。
實施例5將IL採集的孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿樣品經過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用0%，15%，60%, 100%乙醇洗脫3個柱體積，取60%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經C18反相柱純化，依次用20%，40%,60%, 80%, 90%, 100%甲醇各IOOOmL洗脫，收集餾分並分別濃縮至IOOmL,得到純化的結合態雌激素混合物。取90%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP O. 2M、pH5. 2的醋酸緩衝液IOOmL,震蕩30min，然後加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱2小時，溫度400C。水解後，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合併濃縮至幾乎幹，加入5mL甲醇，得到結合態雌激素提取物。經高效液相檢測(檢測過程請參見試驗例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素，含量分別為3. 5Img/L、4. 51mg/L>17. 59mg/L。實施例6將IL採集的孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿樣品經過苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂吸附柱分離，分別用10%，20%, 50%, 70%, 80%, 100%甲醇洗脫3個柱體積，取50%和70%洗脫部分濃縮20倍得濃縮液。將得到的孕驢尿濃縮液，經C18反相柱純化，依次用20%，50%，80%，100%乙醇各IOOOmL洗脫，收集餾分並分別濃縮至IOOmL,得到純化的結合態雌激素混合物。取100%甲醇洗脫部分純化的混合物lmL，加水IOOmLjP 0. 2M、PH5. 2的醋酸緩衝液IOOmL,震蕩30min，然後加硫酸酯酶約lOOmg，在磁力攪拌器上攪拌加熱I小時，溫度40°C。水解後，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯萃取液合併濃縮至幾乎幹，加入5mL甲醇，得到結合態雌激素提取物。經高效液相檢測(檢測過程請參見試驗例I)提取物中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉三種結合態雌激素，含量分別為 5. 21mg/L、2. 67mg/L、21. 33mg/L。
將上述實施例1-6提取純化得到的結合態雌激素混合物進行含量檢測如下試驗例I孕驢尿雌激素提取物高效液相色譜檢測測試儀器高效液相色譜儀(Agi lent 1100)色譜柱C185 μ m, 250 X 4. 6nm流動相A相為0. 3%乙酸，B相為純乙腈；洗脫條件0 10min，80% 60%A;10 20min，60% 30%A ;20 30min，30%-5%A ;3(T35min，59T0%A。檢測條件柱溫為28°C，流速，lml/min,檢測波長270nm，進樣體積20 μ I。測試步驟取Iml上述實施例得到的結合態雌激素提取物，通過0. 22 μ m—次性過濾器過濾，濾液加入進樣瓶中經液相檢測。樣品測定採用色譜峰的保留時間定性，採用外標法以峰面積定量，測量結果如上述實施例中所述。以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。
權利要求
1.一種從孕驢尿中提取純化結合雌激素的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)將採集的孕驢尿樣品經過大孔樹脂吸附柱分離，採用水混溶性溶劑進行梯度洗脫，得到含有結合態雌激素的濃縮液； (2)將提取的結合態雌激素濃縮液，經反相C18柱富集純化，進行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結合態雌激素混合物； (3)將純化的結合態雌激素混合物，加水和醋酸緩衝液，震蕩，然後加酶進行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(I)所用的大孔吸附樹脂為苯乙烯型非極性共聚體DlOl大孔吸附樹脂。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)所用純化方法為反相C18柱分離純化，且上樣前，C18反相柱經洗脫溶劑預先平衡。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(3)醋酸緩衝液濃度為O.2M，ρΗ=5· 2ο
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(3)中所用酶為硫酸酯酶。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述水混溶性洗脫溶劑選自低級鏈烷醇。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述洗脫溶劑為甲醇或乙醇。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(I)中的孕驢尿為孕期在3個月到10個月之間的孕驢尿液。
9.權利要求1-8任一項所述的方法得到的含有結合雌激素的提取物。
10.根據權利要求9所述的提取物，其特徵在於所述的提取物混合物中三種主要結合態雌激素為雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17 α -雌二醇硫酸鈉。
全文摘要
本發明涉及一種含有結合雌激素的提取物及其提取純化方法，包括以下步驟將採集的孕驢尿樣品經過大孔樹脂吸附柱分離，採用水混溶性溶劑進行梯度洗脫，得到含有結合態雌激素的濃縮液；將提取的結合態雌激素濃縮液，經反相C18柱富集純化，進行上樣、水混溶性溶劑梯度洗脫、收集組分濃縮，得到純化的結合態雌激素混合物；將純化的結合態雌激素混合物，加水和醋酸緩衝液，震蕩，然後加酶進行酶解，乙酸乙酯萃取，得到游離雌激素混合物。本發明採用苯乙烯型非極性共聚體D101大孔吸附樹脂，再經C18反相柱純化，首次從孕驢尿中得到結合態雌激素提取物，工藝簡單，樹脂可再生，節約成本，同時避免了常規使用的液-液和固-液提取法所產生的弊端。
文檔編號B01D15/10GK103040866SQ20121056268
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月21日 優先權日2012年12月21日
發明者孟彩雲, 秦玉峰, 尤金花, 周祥山 申請人:山東東阿阿膠股份有限公司