巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法
2023-12-08 18:12:51
專利名稱：巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法
技術領域：
本發明屬於生物發酵領域，更具體地說是關於一種巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法。
背景技術：
冬蟲夏草(Cordyceps Sinesis(Berk)Sacc)是一種名貴滋補強壯藥，它具有廣泛的藥用價值，如增強細胞免疫和體液免役功能，雄性激素樣的作用等。但天然蟲草來源有限，價格昂貴。
發明內容
本發明提供了一種用巴西蟲草菌種經深層發酵生產蟲草菌絲粉的方法。
本發明的目的是通過如下的技術方案解決的利用巴西蟲草菌種，採用新研製的培養基配方，在發酵罐中通氣培養，控制適宜的溫度、攪拌速度、酸鹼度等培養條件，發酵生產蟲草菌絲體，菌絲體經乾燥後製得純蟲草菌絲粉。方法主要包括搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐培養，具體工藝如下(1)搖瓶培養接入巴西蟲草菌種，在22-32℃，搖床轉速120-300轉/分的條件下，培養3-6天後，接入種子罐培養；(2)種子罐培養將搖好的搖瓶種子接入種子罐中，接種量1-15％，在22-32℃，攪拌速度150-500轉/分，罐壓0.03-0.12兆帕，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分的條件下，培養1-4天；(3)發酵罐培養將已培養好的種子接入發酵罐，接種量為5-20％，在22-32℃，攪拌速度150-350轉/分，罐壓0.02-0.12兆帕，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分，pH6.5-8.0的條件下，培養3-6天，得蟲草菌絲體，乾燥得蟲草菌絲粉；其中所用的的培養基組分及重量百分含量為澱粉0.5-4％、糖0.75-2％、蛹酪素0.5-4％、無機鹽0.01-0.2％，pH 6.5-8.0，固體培養基加1-2％瓊脂。
本發明所述的方法中培養基的組分及重量百分含量的優選方案為澱粉0.8-3.5％、葡萄糖0.8-1.8％、蛹酪素0.8-3％、MgSO4及K2HPO40.03-0.1％，pH 6.5-8.0，固體培養基加1-2％瓊脂。
本發明中所用的巴西蟲草菌種是從天然冬蟲夏草經常規的組織分離、馴化培養而得到。
利用該工藝方法得到的蟲草菌絲粉主要成份和藥理作用與天然冬蟲夏草基本一致微量元素Cu、Zn、Sr等的含量大體一致；富含的19種人體必需胺基酸中，除門冬氨酸、組氨酸、精氨酸外，其餘基本一致；主要有效成份D-甘露醇、麥角甾醇、蟲草多糖的含量蟲草菌絲粉略高於天然冬蟲夏草；兩者在增強細胞免疫、體液免疫及雄性激素樣方面的藥理作用相近；該工藝生產的蟲草菌絲粉對CCl4誘發的肝損傷有一定的保護作用。
該工藝可進行大規模生產，生產成本低，具有較高的開發價值。該工藝生產的蟲草菌絲粉與天然蟲草的主要成分與藥理作用基本一致，為其代替天然蟲草奠定了基礎。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明的方法作進一步的說明。
實施例1(1)搖瓶培養50升的種子罐，以裝量30升計，接種量3％，則配搖瓶培養基的量為30升×3％＝0.9升。按澱粉1％、葡萄糖1％、蛹酪素1％、MgSO40.05％、K2HPO40.05％、pH6.8的配方，配0.9升培養液，分裝在500毫升三角瓶中，每瓶裝量為100毫升，裝好後滅菌，冷卻至30℃，接入試管種。每瓶接入種塊2塊約0.5平方釐米。搖床轉速為180轉/分，控制溫度為25℃，經4天培養後，接種至50升種子罐培養。
(2)種子罐培養50升的種子罐實裝量為30升，減去搖瓶種量0.9升，則為30-0.9＝29.1升。按本實施例(1)所述配方，配29.1升培養基(實際只加水至26升，預計滅菌時有3升的蒸汽冷凝水)，培養基滅菌後，待溫度降至30℃時接入搖好的搖瓶種子，接種量為10％，控制種子罐的溫度為25℃，攪拌轉速為300轉/分，通風量為1∶0.5體積/體積/分，罐壓為0.05兆帕，培養2天後，種子罐種子接種至500升發酵罐中發酵培養。
(3)發酵罐培養500升發酵罐以實際裝量為300升計，減去種子罐的量30升，實際發酵罐需配培養液的量為300-30＝270升。按本實施例(1)所述配方配270升的培養基於500升發酵罐中(實際只加水至260升，預計約10升的蒸汽冷凝水)，滅菌，待溫度下降至30℃時把種子罐中已培養好的種子接入發酵罐中，接種量10％，控制發酵罐溫度為25℃，攪拌轉速為200轉/分，通風量為1∶0.4體積/體積/分，罐壓0.05兆帕，培養5天後，即獲得巴西蟲草菌絲體，乾燥，得純巴西蟲草菌絲粉，得率1.76％。
實施例2 蟲草菌絲粉與天然蟲草的主要成分比較表1、表2、表3分別是蟲草菌絲粉與天然蟲草的主要有效成分、微量元素、胺基酸含量的比較。
表1蟲草菌絲粉與天然蟲草的主要有效成分含量比較
表2蟲草菌絲粉與天然蟲草的微量元素含量比較
表3蟲草菌絲粉與天然蟲草的胺基酸含量比較
從上面的表1、2、3的結果看，作為冬蟲夏草的主要有效成分D-甘露醇(蟲草酸)、麥角甾醇(蟲草素)、粗多糖，其含量蟲草菌絲粉略高於天然冬蟲夏草。胺基酸含量兩者基本一致，微量元素含量相差也不大，說明兩者所含化學成分基本一致，為蟲草菌絲粉代替天然蟲草奠定了基礎。
實施例3 蟲草菌絲粉與天然蟲草的藥理作用比較(1)對免疫器官重量和白細胞的影響取體重12±2g的NIH系小鼠80隻，均分8組，每組10隻，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d，容量0.2ml/10g，對照組給予等容量蒸餾水。免疫低下第5-8組則於給藥後第4天腹腔注射環磷醯胺50mg/kg，末次給藥1h後眼眶取血記數白細胞，並頸椎脫位處死動物剖取胸腺，脾臟用扭力天平稱溼重，計算免疫器官指數(mg/10g體重)，結果見表4。
表4對免疫器官重量和白細胞的影響比較
與蒸餾水+環磷醯胺組比較△P＜0.05 △△P＜0.01(下同)結果表明，蟲草菌絲粉和冬蟲夏草對正常免疫器官胸腺、脾臟及白細胞數均有增加的趨勢，但統計學無顯著的意義。而免疫低下組的胸腺、脾臟則有明顯增重作用，且對環磷醯胺所致白細胞的降低有升高作用，與對照組比(P＜0.05和0.01).其作用在一定範圍內隨劑量增加而加強。
(2)對小鼠碳廓清速率的影響取體重18±2g小鼠40隻隨機分四組，每組10隻，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d。對照組給等容量蒸餾水，末次給藥後1h靜脈注射印度墨汁0.1ml/20g，注射後2分鐘和20分鐘分別從眼眶取血20微升放入0.1％Na2CO32ml溶液中搖勻，用RA-50自動化學分析儀波長670nm測OD值，計算碳廓清指數K值，結果見表5。
表5對小鼠碳廓清速率的影響的比較
與對照組比*P＜0.05 **P＜0.01(下同)結果表明蟲草菌絲粉各組均能增加碳廓清指數，其中8g/kg組與對照組比差異顯著(P＜0.05)，提示該產品能顯著提高機體對網狀內皮系統的吞噬功能。
(3)對小鼠體內淋巴細胞轉化功能的影響取小鼠40隻，隨機分四組，每組10隻，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d。各組給藥第3天肌肉注射PHA6mg/kg，連續注射3天。除蒸餾水組外，各組於注射PHA第2天均腹腔注射環磷醯胺一次50mg/kg，末次給藥後剪尾取血推片。瑞氏—吉姆氏染色，計算100個淋巴細胞中轉化細胞百分數，比較組間的差異，結果見表6。
表6對小鼠體內淋巴細胞轉化功能的影響的比較
結果表明，蟲草菌絲粉4和8g/kg及冬蟲夏草均能顯著地提高小鼠體內淋巴細胞轉化率，對抗環磷醯胺抑制淋巴細胞的轉化作用，與對照組比差異顯著(P＜0.05和0.01)。表明該產品能增強小鼠的細胞免疫功能。
(4)對小鼠血清溶血素抗體生成的影響取體重18±2g小鼠80隻，隨機分8組，每組10隻，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d。給藥第1天各組均腹腔注射5％雞紅血球0.2mg/只，致敏，免疫低下組於給藥第4天腹腔注射環磷醯胺一次50mg/kg，末次給藥1h斷頭取血用RA-50自動化學分析儀波長540nm測定溶血素OD值，計算半數溶血值(HC50)，比較組間的差異顯著性，結果見表7。
表7對小鼠血清溶血素抗體生成的影響的比較
結果表明，蟲草菌絲粉各組對正常小鼠有促進血清溶血素抗體生成的趨勢，但統計學無顯著差異，而對環磷醯胺抑制溶血素生成的作用則有明顯的對抗作用，與對照組比較差異顯著(P＜0.05)，表明蟲草菌絲粉對體液免疫有增強作用。
(5)對幼年雄性小鼠睪丸重量的影響取體重12±2g小鼠40隻，隨機分4組，每組10隻，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d。對照組給等容量蒸餾水，末次給藥1h後處死動物剖取睪丸，用扭力天平稱重，計算組織重量mg/10g體重，結果見表8。
表8對幼年雄性小鼠睪丸重量的影響比較
結果表明，蟲草菌絲粉和冬蟲夏草對雄性小鼠的睪丸有明顯增重作用，與對照組比差異顯著(P＜0.05)。
(6)對去勢小鼠副性腺器官重量的影響取雄性小鼠40隻，於乙醚麻醉下摘除睪丸，術後第5天，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d。對照組給等容量蒸餾水，末次給藥1h後頸椎脫位處死動物分別剖取精囊腺、包皮腺稱重，結果見表9。
表9對去勢小鼠副性腺器官重量的影響比較
結果表明，蟲草菌絲粉各組及冬蟲夏草對去勢小鼠的包皮腺、精囊腺有明顯的增重作用，提示該產品具有雄激素樣的作用。
(7)蟲草菌絲粉對CCL4誘發小鼠肝損傷的影響小鼠40隻，隨機分為4組，每組10隻，按不同劑量灌胃給藥，qd×7d。於給藥第7天，除正常對照組外，其餘3組均皮下注射0.1％CCL4花生油10ml/kg，注射後禁食16h斷頭，取血測谷丙轉氨酶(SGPT)含量結果如表10。
表10蟲草菌絲粉對CCL4誘發小鼠肝損傷的影響
與CCL4組比*P＜0.05 **P＜0.0權利要求
1.一種巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法，包括搖瓶培養、種子罐培養、發酵罐培養，其特徵在於(1)搖瓶培養接入巴西蟲草菌種，在22-32℃，搖床轉速120-300轉/分的條件下，培養3-6天後，接入種子罐培養；(2)種子罐培養將搖好的搖瓶種子接入種子罐中，接種量1-15％，在22-32℃，攪拌速度150-500轉/分，罐壓0.03-0.12兆帕，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分的條件下，培養1-4天；(3)發酵罐培養將已培養好的種子接入發酵罐，接種量為5-20％，在22-32℃，攪拌速度150-350轉/分，罐壓0.02-0.12兆帕，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分，pH 6.5-8.0的條件下，培養3-6天，得蟲草菌絲體，乾燥得蟲草菌絲粉；其中所用的的培養基組分及重量百分含量為澱粉0.5-4％、糖0.75-2％、蛹酪素0.5-4％、無機鹽0.01-0.2％、pH 6.5-8.0、固體培養基加1-2％瓊脂。
2.據權利要求1所述的巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法，其特徵在於所用的培養基配方為澱粉0.8-3.5％、葡萄糖0.8-1.8％、蛹酪素0.8-3％、MgSO4及K2HPO40.03-0.1％、pH 6.5-8.0、固體培養基加1-2％瓊脂。
3.據權利要求1所述的巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法，其特徵在於發酵所得的蟲草菌絲粉的主要有效成分是D-甘露醇、麥角甾醇、蟲草多糖。
全文摘要
本發明公開了一種巴西蟲草菌絲體深層發酵培養方法，以巴西蟲草菌種為出發菌，採用新研製的培養基配方，在適宜的溫度、攪拌速度、酸鹼度等培養條件下，生產蟲草菌絲體，菌絲體經乾燥後製得純蟲草菌絲粉。利用該方法生產的蟲草菌絲粉與天然蟲草的主要成分和藥理作用基本一致，並且該工藝可進行大規模生產，生產成本低，具有較高的開發價值。
文檔編號C12N1/14GK1397635SQ0213457
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月19日 優先權日2002年8月19日
發明者梁淑娃, 彭中健, 杜少平, 楊冠東 申請人:廣州市微生物研究所